專利名稱：Acacia mangium的體細(xì)胞胚發(fā)生再生的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及體細(xì)胞胚產(chǎn)生領(lǐng)域，尤其涉及通過體細(xì)胞胚發(fā)生再生Acacia mangium的方法。更特別的，本發(fā)明涉及一種通過在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)未成熟合子胚的外植體以生長為胚發(fā)生組織的方法。胚發(fā)生組織在體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基和萌發(fā)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。將萌發(fā)的胚進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為馴化植物以在田間種植。本發(fā)明特別適合產(chǎn)生用于重新造林的克隆種植原種。
本文所引用的例證本發(fā)明背景或提供關(guān)于實(shí)踐應(yīng)用的附加說明的出版物和其它物質(zhì)，在此并入?yún)⒖?，并分別集中列于所附的參考文獻(xiàn)表中。
森林對世界經(jīng)濟(jì)及保持和保存我們的生態(tài)系統(tǒng)是非常重要的。森林樹木具有廣泛的商業(yè)用途(建筑木材，造紙和紙漿原料，及作為能源)。當(dāng)天然森林補(bǔ)給不足時，木制品的全球性需求(大多數(shù)為發(fā)展中國家的造紙和紙漿及木柴)已逐年增加。重新造林是解決這種逐年增加的需求的方法。通常選擇快速生長，廣泛適應(yīng)性的樹種進(jìn)行重新造林。大多數(shù)樹種改良的程序基于對遺傳資源進(jìn)行處理，包括從現(xiàn)有森林中選擇優(yōu)異克隆，保存遺傳可變性，部分控制繁殖和所需性狀的傳統(tǒng)培育。盡管通常需若干代來進(jìn)行培育，但傳統(tǒng)的培育法已成功獲得具有快速和始終如一生長的精華樹木。然而，許多其它性狀如疾病和昆蟲抗性，不同木質(zhì)素組分和含量難以獲得，主要因?yàn)闃浞N和大分離群的高度雜合性所致。另外，授予某些表型如疾病抗性的基因在基因庫中可能根本沒有。另一方面，基于樹種遺傳轉(zhuǎn)化的分子培育可以導(dǎo)入一特定表型而不影響培育植物的遺傳背景。在楊屬物種和桉屬物種進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化能成功修飾木質(zhì)素含量(Tzfira等，1998；Robinson，1999)。對森林樹種進(jìn)行分子培育的前提是存在可靠及可重復(fù)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，這依賴于從一個單細(xì)胞再生一個完整植物的系統(tǒng)。
金合歡(Acacia)屬包含大約1200種熱帶和亞熱帶樹種。其屬于含羞草科(Mimosaceae)。Acacia mangium是一種多用途的，快速生長和固氮的精華熱帶豆類樹。Acacia mangium已越來越多地用于在退化的土壤中種植，重新造林和土壤復(fù)原。許多Acacia mangium已在酸性土壤或廢棄土地中種植。由于其產(chǎn)生高質(zhì)纖維，Acaciamangium已在東南亞如馬來西亞(Tsai，1988)和印度尼西亞大量種植作為紙漿業(yè)的原料。印度尼西亞的許多造紙和紙漿廠已主要依賴于種植園作為木材來源，優(yōu)選Acacia mangium。亞洲造紙和紙漿集團(tuán)有兩個會員公司，總租界地為540000公頃。至1996年，一個公司已種植了123000公頃的Acacia mangium，占其種植園的90％，相當(dāng)于180×106株幼苗。預(yù)計到2004年，亞洲種植和紙漿集團(tuán)的幾乎全部木材來源均來自種植園，主要是Acacia mangium種植園(Bayliss，1998a，1998b)。然而，Acacia mangium的花表現(xiàn)弱雌蕊先熟及變化水平的雄性兩性同體。其具有自身傳粉，與自然界的Acacia auriculiformis交叉種內(nèi)傳粉或種內(nèi)傳粉等特性(Sedgley等，1992；Sornsathapornkul和Owens，1999)。這些繁殖特性對通過種子進(jìn)行商業(yè)繁殖和種植是不利的。
再生通常用于木本樹木的繁殖中(Kozlowski和Pallardy，1997)。在Acacia中，少數(shù)樹種據(jù)報道成功再生，如通過體細(xì)胞胚發(fā)生再生Acacia catechure(Rout等，1995)，和通過器官發(fā)生再生Acaciaauriculiformis(Rao和Prasad，1991)。已報道了Acacia mangium嫩枝繁殖(Bhaskan和Subbash，1996；Ahmad，1991；Galiana等，1991a，1991b)，Toshihiro(1999)還報道了從無菌Acacia mangium幼苗中分離原生質(zhì)體。我們的PCT專利申請PCT/SG00/00010闡述了通過器官發(fā)生再生Acacia mangium。然而，通過體細(xì)胞胚發(fā)生再生Acaciamangium還沒有闡述。
體細(xì)胞胚是克隆起源的，因此使用體細(xì)胞胚的繁殖可具有非常高速率的營養(yǎng)性增加的潛力，由此在商業(yè)上是令人感興趣的。通過體細(xì)胞胚發(fā)生進(jìn)行再生是進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的一種有吸引力的方法。據(jù)報道體細(xì)胞胚比嫩枝更穩(wěn)定再生。用體細(xì)胞胚的再生系統(tǒng)的另一優(yōu)點(diǎn)是其明顯的單細(xì)胞起源。這意味著再生體不太可能是嵌合起源的，因?yàn)槿绻偕w源自成群細(xì)胞而不是單細(xì)胞，則植物組織可能是嵌合的或不穩(wěn)定的及產(chǎn)生不正常型。體細(xì)胞胚發(fā)生方法對馬鈴薯或其它抗體細(xì)胞胚發(fā)生的作物物種的適用性使這些作物可利用任何新的人工種子技術(shù)進(jìn)步。
體細(xì)胞胚適于通過根瘤農(nóng)桿菌(Mathews等，1992)，微注射(Neuhaus等，1987)和顆粒轟擊(Wilde等，1992)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。另外，體細(xì)胞胚可用液氮低溫貯藏而不喪失存活性。低溫貯藏是一種保持種質(zhì)的有效方法，并可使植物材料長時間轉(zhuǎn)運(yùn)。另外，體細(xì)胞胚適于開發(fā)人工種子技術(shù)(美國專利No.5572827；Bajaj，1995a)。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種通過體細(xì)胞胚發(fā)生再生Acacia mangium的方法。
本發(fā)明還涉及制備Acacia mangium的體細(xì)胞胚的方法。此方法通常變化上述步驟的前兩個。體細(xì)胞胚可用作制備轉(zhuǎn)基因植物的原料，可低溫貯藏并可發(fā)育成人工種子。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，Acacia mangium的體細(xì)胞胚發(fā)生可在MS基本培養(yǎng)基上從未成熟的胚軸中誘導(dǎo)的愈傷組織上實(shí)現(xiàn)，MS基本培養(yǎng)基補(bǔ)加了賽二唑素(thidiazuron，TDZ)和吲哚-3-乙酸(IAA)與抗壞血酸，天冬酰胺，酪素酶解物，谷氨酰胺，脯氨酸，蔗糖和phytagel的組合物。通過首先在含有蔗糖，phytagel和赤霉酸(GA3)的MS基本培養(yǎng)基上，然后在含有蔗糖和phytagel的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)體細(xì)胞胚，42.33％的球形胚發(fā)育為魚雷胚和子葉胚。11％的成熟體細(xì)胞胚萌發(fā)為幼苗，將其移至由泥炭土和沙土混合物組成的罐裝土壤中。
圖2A-F示出體細(xì)胞胚成熟和萌發(fā)。圖2A示出在AM-425上體細(xì)胞胚的成熟。圖2B-F示出體細(xì)胞胚成熟和萌發(fā)的各期，圖2B示出魚雷期，圖2C示出早期子葉期，圖2D示出子葉期，圖2E示出體細(xì)胞胚萌發(fā)，圖2F示出具有單個子葉的體細(xì)胞胚。
圖3A-H示出Acacia mangium的體細(xì)胞胚發(fā)生的組織學(xué)。圖3A-D示出自上皮細(xì)胞起始的體細(xì)胞胚中期(A和B，用箭頭表示)，二子代細(xì)胞(C，用箭頭表示)，和原胚結(jié)構(gòu)(D)；圖3E-G示出球形胚形成；圖3H示出心期胚。所用縮寫是dc＝分界細(xì)胞層；pe＝原胚結(jié)構(gòu)；sec＝表皮下細(xì)胞；sus＝胚柄；tdc＝二子代細(xì)胞。
圖4A-C示出體細(xì)胞胚萌發(fā)。圖4A示出在培養(yǎng)基中萌發(fā)的具有羽狀葉(用箭頭表示)，伸長的胚軸和胚根的成熟體細(xì)胞胚。圖4B示出在種植于土壤之前的幼苗。圖4C示出在土壤中生長的植物(3∶1)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及體細(xì)胞胚產(chǎn)生領(lǐng)域，尤其涉及通過體細(xì)胞胚發(fā)生再生Acacia mangium的方法。更特別的，本發(fā)明涉及在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)未成熟的合子胚外植體生長為胚發(fā)生組織的方法。胚發(fā)生組織在體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基和萌發(fā)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。將萌發(fā)胚進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為適于田間種植的馴化植物。此方法非常適于生產(chǎn)克隆種植原種以用于重新造林。
通過體細(xì)胞胚發(fā)生進(jìn)行繁殖是指胚是在體外從小塊植物組織或個體細(xì)胞中產(chǎn)生的方法。胚被稱為體細(xì)胞胚是因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生自體細(xì)胞(營養(yǎng))組織，而不是有性過程。通過體細(xì)胞胚發(fā)生的植物繁殖具有捕捉非常需要的基因型的所有遺傳獲得量的能力。另外，這些方法易于自動操作和機(jī)械化。這些性質(zhì)賦予體細(xì)胞胚發(fā)生方法具有產(chǎn)生大量個體克隆的潛力，以重新造林。
在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，體細(xì)胞胚是通過下述方法產(chǎn)生的，該方法分為兩步(1)胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)和(2)胚成熟。優(yōu)選使用兩步胚成熟法。一方面，體細(xì)胞胚是通過以下步驟制備的(a)在包括補(bǔ)加TDZ和IAA的基本培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚發(fā)生愈傷組織，(b)在包括補(bǔ)加GA3的基本培養(yǎng)基的第一種成熟培養(yǎng)基上使胚成熟，和(c)在包含基本培養(yǎng)基的第二種成熟培養(yǎng)基上使胚成熟。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，Acacia mangium的再生植物是通過下述方法生產(chǎn)的，該方法可分為4步(1)胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)，(2)胚成熟，(3)胚萌發(fā)，和(4)轉(zhuǎn)化為馴化植物。優(yōu)選使用兩步胚成熟法。然后可將馴化植物種植于田間。一方面，Acacia mangium的再生體是通過以下步驟制備的(a)在包括補(bǔ)加TDZ和IAA的基本培養(yǎng)基的愈傷組織培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚發(fā)生愈傷組織，(b)在包括補(bǔ)加GA3的基本培養(yǎng)基的第一種成熟培養(yǎng)基上使胚成熟，和(c)在包括基本培養(yǎng)基的第二種成熟培養(yǎng)基上使胚成熟，(d)在包括基本培養(yǎng)基的萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)成熟胚，和(e)將萌發(fā)植物在罐裝土壤中馴化。
后一實(shí)施方案更具體的是，Acacia mangium Willd.的體細(xì)胞胚發(fā)生是在MS基本培養(yǎng)基上從未成熟的胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織上實(shí)現(xiàn)的，所述MS培養(yǎng)基補(bǔ)加TDZ(1-2mg/l)和IAA(0.25-2mg/l)與抗壞血酸(Vc)100mg/l，天冬酰胺(Asn)150mg/l，酪素酶解物(CH)100mg/l，谷氨酰胺(Gln)150mg/l，脯氨酸(Pro)150mg/l，蔗糖30g/l和phytagel 0.3％的組合物。通過兩步成熟法，42.33％的球形胚發(fā)育為魚雷胚和子葉胚，所述兩步成熟法是將體細(xì)胞胚在含有30-50g/l蔗糖，0.1％活性炭，0.35％phytagel和2.5mg/l-5.0mg/l優(yōu)選5.0mg/l的GA3，與Vc 100mg/l，Asn 150mg/l，CH 100mg/l，Gln150mg/l，和Pro 150mg/l的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)體細(xì)胞胚，然后在含有50g/l蔗糖和0.35％phytagel與Vc 100mg/l，Asn 150mg/l，CH100mg/l，Gln 150mg/l，和Pro 150mg/l及0.1％活性炭的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)體細(xì)胞胚。在含有30g/l蔗糖和0.35％phytagel和2.5-5.0mg/l優(yōu)選5.0mg/l的GA3，與Vc 100mg/l，Asn 150mg/l，CH100mg/l，Gln 150mg/l，和Pro 150mg/l及0.1％活性炭的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)成熟體細(xì)胞胚，11％的成熟體細(xì)胞胚萌發(fā)為幼苗。將幼苗在含有20g/l蔗糖和0.35％phytagel的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后移至由泥炭土∶沙土(3∶1)組成的罐裝土中。移植的幼苗然后易于在田間種植。
組織學(xué)分析示出體細(xì)胞胚發(fā)生是源自胚發(fā)生愈傷組織的單一上皮細(xì)胞的單細(xì)胞胚發(fā)生。體細(xì)胞胚發(fā)生經(jīng)歷雙細(xì)胞期，原胚期，球形胚期，魚雷期和子葉期。原胚結(jié)構(gòu)是通過一分界細(xì)胞層與親代愈傷組織分開，球形胚通過類胚柄結(jié)構(gòu)與愈傷組織連接。
體細(xì)胞胚發(fā)生已用作為大規(guī)模繁殖油棕(Huong，1999；Aberlence-Bertossi等，1999)和大豆(Trick，1997)的方法，并還用于繁殖其它木本植物如Dalbergia sissoo Roxb(Das等，1997)，Camellia sinensis(L).O.Kuntze(Ponsamuel等，1996)，和Picea abies(L.)Karst(Westcott，1994)。體細(xì)胞胚發(fā)生的一重要應(yīng)用是進(jìn)行遺傳修飾。例如，大豆體細(xì)胞胚發(fā)生提供了培育高產(chǎn)量轉(zhuǎn)基因大豆植物的主要方法(Trick，1997)。組合胚發(fā)生和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在英國胡桃，核桃和櫻桃中也已成功進(jìn)行，對培育是非常重要的(Kozlowski和Pallardy，1997)。Acacia mangium是一種對造紙和紙漿業(yè)有商業(yè)重要性的熱帶豆類樹，并是種植的首選樹種。將本文所述的通過體細(xì)胞胚發(fā)生的有效再生系統(tǒng)，與biolistic或Agrobacterium介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化組合，提供了培育對害蟲或疾病抗性植物的另一種有價值的方法。
AM-308MS+IAA2.0mg/l+TDZ1.0mg/l1所有培養(yǎng)基還含有CH 100mg/l，Vc 100mg/l，Gln 150mg/l，Asn150mg/l和Pro 150mg/l，，phytagel 0.30％，蔗糖30g/l，在高壓滅菌后pH5.8。F.胚成熟和萌發(fā)培養(yǎng)基1AM-423 MS+蔗糖30.0mg/lAM-424 MS+GA35.0mg/l+蔗糖30.0mg/lAM-425 MS+蔗糖50.0mg/lAM-426 MS+GA35.0mg/l+蔗糖50.0mg/lAM-467 MS+GA32.5mg/l+蔗糖30.0mg/l1所有培養(yǎng)基還含有CH 100mg/l，Vc 100mg/l，Gln 150mg/l，Asn150mg/l和Pro 150mg/l，，phytagel 0.30％，活性炭0.1％，在高壓滅菌后pH5.8。G.幼苗生長(馴化)MS，蔗糖20.0mg/l，0.35％phytagelH.移植泥炭土∶白沙＝3∶1
據(jù)報道體細(xì)胞胚在愈傷組織中開始產(chǎn)生是在含有高濃度植物生長素或高比率植物生長素/細(xì)胞激動素的培養(yǎng)基中發(fā)生(Kozlowski和Pallardy，1997)。然而，在Acacia mangium的體細(xì)胞胚發(fā)生中，只在含有1.0-2.0mg/l TDZ和0.25-2.0mg/l IAA組合的培養(yǎng)基上獲得綠黃色易碎胚發(fā)生愈傷組織(表1；


圖1B)。TDZ 2.0mg/l和IAA0.25mg/l組合誘導(dǎo)胚發(fā)生愈傷組織最有效(16.41％)(表1)，該愈傷組織然后產(chǎn)生球形胚和心期胚(
圖1B-D)。此組合用于誘導(dǎo)更多的胚發(fā)生愈傷組織。然而，在含有2，4-D(1.0-5.0mg/l)和KT(0.5-3.0mg/l)，2，4-D(0.5-2.0mg/l)和6-BA(1.0-3.0mg/l)，NAA(0.5mg/l)和6-BA(1.0-3.0mg/l)，或NAA(0.5-2.0mg/l)和KT(0.5-3.0mg/l)的培養(yǎng)基上，未獲得胚發(fā)生愈傷組織(表1)。Rout等(1995)報道了細(xì)胞分裂素13.9μM(2.99mg/l)和NAA2.7μM(0.55mg/l)組合促進(jìn)在未成熟的子葉中A.catechu體細(xì)胞胚發(fā)生。然而，NAA和KT的相似組合在Acacia mangium未成熟胚軸中不誘導(dǎo)任何胚發(fā)生愈傷組織(表1)。自胚軸中誘導(dǎo)的愈傷組織在含有NAA和KT的培養(yǎng)基上是白色松散的。已記錄Acacia屬包含1200多種，形態(tài)學(xué)上也有很大差異(Simmons，1987)。在其它不同中，成熟Acacia mangium有大約30米高，而一個成熟的A.catechu只有9-12米。對植物生長調(diào)節(jié)劑應(yīng)答的差異可得自物種間遺傳背景的不同。TDZ推薦用于木本物種尤其在頑抗物種組織培養(yǎng)中(Lu，1993)。我們的結(jié)果示出TDZ在Acacia mangium中有效誘導(dǎo)胚發(fā)生愈傷組織。Chengalrayan等，(1997)報道用TDZ代替6-BA和KT可通過體細(xì)胞胚發(fā)生提高花生植物的回收。表1植物生長調(diào)節(jié)劑的不同組合對胚發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)的作用
1％(平均值±SD)；數(shù)據(jù)相當(dāng)于3份實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。
TDZ(2.0mg/l)和IAA(0.25mg/l)組合促進(jìn)Acacia mangium的體細(xì)胞胚發(fā)生。然而，體細(xì)胞胚發(fā)育在心期停止(
圖1D；圖3H)，如果心期胚在相同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上保持較長時間，則形成次生體細(xì)胞胚。體細(xì)胞胚不能向前發(fā)育為較晚期。因此，必需使體細(xì)胞胚成熟。實(shí)施例7體細(xì)胞胚成熟和萌發(fā)將在含有IAA 0.25mg/l和TDZ 2.0mg/l的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(AM-304)中誘導(dǎo)的球形胚(
圖1B-C)，在補(bǔ)加0-5.0mg/l GA3，30-50g/l蔗糖，Vc 100mg/l，Asn 150mg/l，CH 100mg/l，Gln 150mg/l，Pro 150mg/l，phytagel 0.35％(g/l)和活性炭0.1％的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天。然后將體細(xì)胞胚移至成熟培養(yǎng)基AM-425上，培養(yǎng)40天。接著將子葉體細(xì)胞胚(成熟體細(xì)胞胚)移至AM-424培養(yǎng)基上萌發(fā)。用全部250個球形體細(xì)胞胚，將在每種培養(yǎng)基組合上的實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行兩次。將幼苗移至含有蔗糖20g/l以及phytagel 0.35％的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩個月，之后移至由泥炭土∶沙土(3∶1)組成的罐裝土中。
體細(xì)胞胚的成熟與得自其它方法的結(jié)果相一致，成熟在通過體細(xì)胞胚發(fā)生再生植物中是非常重要的(Kozlowski和Pallardy，1997；Huong 1999)。體細(xì)胞胚的成熟使用兩步成熟法。首先，將體細(xì)胞胚在含有0.35％phytagel和2.5-5.0mg/l GA3的培養(yǎng)基(成熟培養(yǎng)基AM-424，AM-426，和AM-467)中處理(表2)。接著，將體細(xì)胞胚移至含有50g/l蔗糖和0.35％phytagel的培養(yǎng)基上(成熟培養(yǎng)基AM-425)脫水。在AM-424培養(yǎng)基上隨后在AM-425培養(yǎng)基上處理，促進(jìn)42.33％球形體細(xì)胞胚發(fā)育為魚雷胚和子葉胚(圖2A；表2)。表2不同培養(yǎng)基對體細(xì)胞胚成熟的作用
1％(平均值±SD)；數(shù)據(jù)是三份實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值在沒有GA3的成熟培養(yǎng)基(AM-423和AM-425)上，未觀測到球形體細(xì)胞胚進(jìn)一步發(fā)育為魚雷期和子葉期。這些結(jié)果表明GA3促進(jìn)體細(xì)胞胚成熟。我們的結(jié)果與在天竺葵(Pelargonium×hortorumBailey)體細(xì)胞胚發(fā)生的誘導(dǎo)和表達(dá)期均存在GA3對在胚軸外植體上的體細(xì)胞胚形成有害的報道相反(Hutchinson等，1997)。在我們的實(shí)驗(yàn)中，體細(xì)胞胚成熟是在相對高蔗糖濃度的情況下完成的。據(jù)報道在Populus體細(xì)胞胚發(fā)生中有相似結(jié)果，蔗糖濃度在20-50g/l刺激體細(xì)胞胚分化(Michler和Bauer 1991)。Biahoua和Bonnean(1999)報道了350mM(120g/l)的高蔗糖濃度提供更有效的Euonymuseuropaeus體細(xì)胞胚發(fā)生，并推斷高蔗糖濃度在體細(xì)胞胚發(fā)生中的兩種作用，其一是培養(yǎng)基中的營養(yǎng)因子，二是具有滲透潛力。體細(xì)胞胚發(fā)生的成熟對許多植物是關(guān)鍵的，如大豆(Ranch等，1986)和Piceaabies(Jalonen和Arnold 1991)體細(xì)胞胚發(fā)生。在培養(yǎng)基中加入6％的麥芽糖促進(jìn)大豆體細(xì)胞胚組織分化和成熟(Ranch等，1996)。對Picea abies體細(xì)胞胚成熟而言，在培養(yǎng)基中進(jìn)行ABA處理是必需的(Jalonen和Arnold 1991)。在我們的實(shí)驗(yàn)中，還觀測到異常子葉胚如只具有一個子葉的體細(xì)胞胚(圖2F)或具有三個子葉的體細(xì)胞胚，其不能萌發(fā)為幼苗。實(shí)施例8體細(xì)胞胚發(fā)生的組織學(xué)體細(xì)胞胚發(fā)生已經(jīng)被認(rèn)為是一種了解植物胚發(fā)育的模型(Warren，1993)。已經(jīng)識別兩種獨(dú)特類型的體細(xì)胞胚發(fā)生。一種是直接胚發(fā)生，其中一個單細(xì)胞(或細(xì)胞群)開始分生組織生長，該細(xì)胞的所有后代均形成部分胚(Warren，1993)。另一種是間接胚發(fā)生，其中胚在預(yù)先形成的分生組織叢中發(fā)育(Warren，1993)。在Acaciamangium中，胚發(fā)生屬于間接體細(xì)胞胚發(fā)生。組織學(xué)切片示出體細(xì)胞胚發(fā)生在胚發(fā)生愈傷組織的一個上皮細(xì)胞中發(fā)育(圖3A-D)。細(xì)胞的平周分裂產(chǎn)生二子代細(xì)胞(圖3A-C)，一個外子代細(xì)胞，一個內(nèi)子代細(xì)胞(圖3C)。二子代細(xì)胞的連續(xù)分裂形成原胚結(jié)構(gòu)(圖3D)，其進(jìn)一步發(fā)育為球形胚和心期胚(圖3E-H)。在光學(xué)組織學(xué)分析中，確定外子代細(xì)胞發(fā)育為體細(xì)胞胚的上皮細(xì)胞，但內(nèi)子代細(xì)胞發(fā)育為體細(xì)胞胚體。組織學(xué)切片還示出與上皮相鄰的上皮下細(xì)胞不形成體細(xì)胞胚，但其背斜分裂形成分界細(xì)胞層，以分開體細(xì)胞胚和親代愈傷組織(圖3C-G)。在原胚結(jié)構(gòu)和親代愈傷組織之間的一層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)在本文稱為分界細(xì)胞層(圖3D)。從原胚結(jié)構(gòu)至球形胚，在球形胚的基部形成一個類胚柄結(jié)構(gòu)(圖3G)。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，胚發(fā)育在心期胚停止(
圖1D；圖3H)。通過成熟，球形胚向前發(fā)育為魚雷胚(圖2B)和子葉胚(圖2C-D)。結(jié)果，體細(xì)胞胚發(fā)生經(jīng)過二細(xì)胞期(圖3C)，原胚期(圖3D)，球形期(圖3E-G)，心期(
圖1D；圖3H)，魚雷期(圖2B)，和子葉期(圖2C-D)。實(shí)施例9體細(xì)胞胚萌發(fā)正常體細(xì)胞胚萌發(fā)包括胚根延長，胚軸延長和第一片羽狀葉延展。只有由胚根，胚軸，子葉和第一片羽狀葉結(jié)構(gòu)組成的那些成熟體細(xì)胞胚，可萌發(fā)為自由生長的幼苗(圖4B-C)。在含有GA35.0mg/l的AM-424培養(yǎng)基上，11％的體細(xì)胞胚萌發(fā)為具有根，第一片羽狀葉(圖4A，箭頭所指)，和延長的胚軸的幼苗。具有胚根和胚軸延長但沒有第一片羽狀葉形成的體細(xì)胞胚，不能萌發(fā)為幼苗。具有第一片羽狀葉形成但沒有胚根延長的體細(xì)胞胚，不能通過生根或微量繁殖而拯救。異常胚如那些具有大單子葉(圖2F)或三子葉結(jié)構(gòu)的體細(xì)胞胚，不能萌發(fā)為幼苗。
本發(fā)明在此專利申請中參考本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)闡述已得以揭示，應(yīng)知此揭示只是例證了本發(fā)明而無限制之意，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的原理和所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，對本發(fā)明可加以修改。
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權(quán)利要求
1.一種制備Acacia mangium的體細(xì)胞胚的方法，包括a)在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)外植體，以誘導(dǎo)胚發(fā)生愈傷組織和球形胚形成；及b)在成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)球形胚至形成體細(xì)胞胚。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟b)包括b1)在第一種成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)球形胚；和b2)在第二種成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)胚。
3.一種再生Acacia mangium的方法，包括a)在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)外植體，以誘導(dǎo)胚發(fā)生愈傷組織和球形胚形成；及b)在成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)球形胚至形成體細(xì)胞胚，及c)在萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)體細(xì)胞胚，以產(chǎn)生再生的幼苗。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述步驟b)包括b1)在第一種成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)球形胚；和b2)在第二種成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)胚。
5.權(quán)利要求3的方法，其中再生的幼苗在馴化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
6.權(quán)利要求4的方法，其中再生的幼苗在馴化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中外植體是未成熟的胚。
8.權(quán)利要求7的方法，其中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括補(bǔ)加a)賽二唑素，b)吲哚-3-乙酸，c)酪素酶解物，d)L-抗壞血酸，e)L-谷氨酰胺，f)L-天冬酰胺，g)L-脯氨酸，h)蔗糖和i)phytagel的MS基本培養(yǎng)基。
9.權(quán)利要求8的方法，其中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含1.0mg/l-2.0mg/l的賽二唑素，和0.25mg/l-2.0mg/l的吲哚-3-乙酸。
10.權(quán)利要求8的方法，其中第一種成熟培養(yǎng)基包括補(bǔ)加a)赤霉酸，b)酪素酶解物，c)L-抗壞血酸，d)L-谷氨酰胺，e)L-天冬酰胺，f)L-脯氨酸，g)蔗糖，h)活性炭和i)phytagel的MS基本培養(yǎng)基。
11.權(quán)利要求10的方法，其中第一種成熟培養(yǎng)基包含2.5mg/l-5.0mg/l的赤霉酸和30g/l-50g/l的蔗糖。
12.權(quán)利要求8的方法，其中第二種成熟培養(yǎng)基包括補(bǔ)加a)酪素酶解物，b)L-抗壞血酸，c)L-谷氨酰胺，d)L-天冬酰胺，e)L-脯氨酸，f)蔗糖，g)活性炭和h)phytagel的MS基本培養(yǎng)基。
13.權(quán)利要求10的方法，其中第二種成熟培養(yǎng)基包括補(bǔ)加a)酪素酶解物，b)L-抗壞血酸，c)L-谷氨酰胺，d)L-天冬酰胺，e)L-脯氨酸，f)蔗糖，g)活性炭和h)phytagel的MS基本培養(yǎng)基。
14.權(quán)利要求8的方法，其中萌發(fā)培養(yǎng)基包括補(bǔ)加a)赤霉酸，b)酪素酶解物，c)L-抗壞血酸，d)L-谷氨酰胺，e)L-天冬酰胺，f)L-脯氨酸，g)蔗糖，h)活性炭和i)phytagel的MS基本培養(yǎng)基。
15.權(quán)利要求14的方法，其中萌發(fā)培養(yǎng)基包含2.5mg/l-5.0mg/l的赤霉酸。
16.權(quán)利要求10的方法，其中萌發(fā)培養(yǎng)基包括補(bǔ)加a)赤霉酸，b)酪素酶解物，c)L-抗壞血酸，d)L-谷氨酰胺，e)L-天冬酰胺，f)L-脯氨酸，g)蔗糖，h)活性炭和i)phytagel的MS基本培養(yǎng)基。
17.權(quán)利要求16的方法，其中萌發(fā)培養(yǎng)基包含2.5mg/l-5.0mg/l的赤霉酸。
18.權(quán)利要求13的方法，其中萌發(fā)培養(yǎng)基包括補(bǔ)加a)赤霉酸，b)酪素酶解物，c)L-抗壞血酸，d)L-谷氨酰胺，e)L-天冬酰胺，f)L-脯氨酸，g)蔗糖，h)活性炭和i)phytagel的MS基本培養(yǎng)基。
19.權(quán)利要求18的方法，其中萌發(fā)培養(yǎng)基包含2.5mg/l-5.0mg/l的赤霉酸。
20.權(quán)利要求8的方法，其中馴化培養(yǎng)基包括補(bǔ)加a)蔗糖和b)phytagel的MS基本培養(yǎng)基。
21.權(quán)利要求18的方法，其中馴化培養(yǎng)基包括補(bǔ)加a)蔗糖和b)phytagel的MS基本培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及體細(xì)胞胚產(chǎn)生領(lǐng)域,尤其通過體細(xì)胞發(fā)生再生Acaciamangium的方法。更特別的,本發(fā)明涉及通過在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)未成熟合子胚的外植體使之生長為胚發(fā)生組織而再生Acaciamangium植物的方法。胚發(fā)生組織在體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基上和萌發(fā)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。將萌發(fā)胚進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為馴化植物,以在田間種植。此方法特別適于產(chǎn)生克隆種植原種,用于重新造林。
文檔編號A01H4/00GK1382014SQ00811891
公開日2002年11月27日 申請日期2000年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月21日
發(fā)明者謝德玉, 洪焰 申請人:分子農(nóng)業(yè)生物學(xué)院