專利名稱：利用水稻轉(zhuǎn)錄因子OsbZIP23提高植物耐逆境能力的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種水稻DNA片段(基因)的分離克隆、功能驗證和應(yīng)用' 所述的基因與植物耐逆境有關(guān)。將該基因的完整翻譯區(qū)(Coding sequence)與玉米的組成型啟動子 (Ubiquitinl)結(jié)合后直接轉(zhuǎn)入一般植物體，轉(zhuǎn)基因植株的脫落酸(ABA)敏感性和耐干早和耐鹽能力顯著提 髙。而6te^7/^J的T-DM插入突變體對高濃度的ABA鈍感，而且對干旱和髙鹽的耐性降低。
背景技術(shù)：
植物在生長的過程中會受到諸多環(huán)境因素的影響，干早、鹽害和低溫往往導(dǎo)致農(nóng)作物的大規(guī)模減產(chǎn)，在 許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。為了抵抗或適應(yīng)環(huán)境不利因素，植物體感受細胞外環(huán)境條件的變化并通過多種 途徑將其傳遞到細胞內(nèi)，會誘導(dǎo)表達一些應(yīng)答基因，產(chǎn)生一些使細胞免受干旱、高鹽、低溫等脅迫傷害的功 能蛋白、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及傳遞信號和調(diào)控基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，從而對外界的變化做出相應(yīng)的反應(yīng)(Xiong 等Cell signaling during cold, drought and salt stress. Plant Cell- 14 (s卿l), S165-S183, 2002、 而那些功能基因?qū)Νh(huán)境做出反應(yīng)的過程中能否正確表達受到調(diào)控因子特別是轉(zhuǎn)錄因子的精細調(diào)節(jié)。而目前在 許多植物中發(fā)現(xiàn)AP2/EREBP, Zinc finger, Myb， bZIP和NAC類轉(zhuǎn)錄因子家族在不同的逆境脅迫下，可誘導(dǎo) 表達或被抑制，因而認為這些轉(zhuǎn)錄因子家族在植物對逆境的應(yīng)答過程中起著非常重要的調(diào)控作用。因此分離 和鑒定對逆境起核心調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，并用于作物抗逆境的遺傳改良，對育種有著重要的意義。目前人 們已在植物抗性改良方面作了嘗試，利用DREB1A和DREB2A培育的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，其低溫耐性和干旱， 髙鹽耐性都比野生型強(Liu Q等Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA domains separate two cellular signal thansduction pathways in drought - and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell, 1998, 10.: 1391-1406.)。利用flsA54C/培育轉(zhuǎn)基因水稻顯著的提高了植株對干早和高鹽的耐受能力(Hu等Overexpressing a隨，ATAF, and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice PMS. 2006, 103: 12987-12992.)
水稻是最重要的糧食作物之一，耐鹽的水稻對申請人來說具有重要的意義，因而找出與耐干旱和耐鹽相 關(guān)的功能基因，培育耐逆境的品種對提髙水稻產(chǎn)量和種植面積具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從水稻中分離克隆一個包含有耐逆境相關(guān)基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，利用這個基因 改良水稻或其它植物的抗逆性。對這個基因進行結(jié)構(gòu)分析其屬于植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族，而且是與逆境相關(guān) 的，申請人將這個基因命名為fc6Zffi^。
本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用一種包含fe6277^ 基因的DNA片段，該片段賦予植物在干旱、商鹽等逆境條件下， 增強其耐受能力。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO: 1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO: 1所示的高 度同源DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO: 1所示序列的亞片段。
可以采用已經(jīng)克隆的flsM/Z^基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基因' 同樣，也可以采用PCR (polymerase chain reaction)技術(shù)，從基因組、mRNA和cDM中擴增得到本發(fā)明的 &6//尸^ 基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DM。釆用以上技術(shù)，可以分離得到包含 基因的序列，將這一序列與任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達的表達載體轉(zhuǎn)化植株，可獲得對髙鹽脅 迫耐受力得到增強的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達載體中時'在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任
何一種強啟動子或誘導(dǎo)型啟動子，本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達載體中時，也可使用增強子，這些增強子 區(qū)域可以是ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域起始密碼于等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的 翻譯。
攜帶有本發(fā)明fo6Z/7^ 基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射， 電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細胞(Weissbach， 1998， Method for Plant Molecular Biology YIII, Academy Press, New York, pp. 411—463; Geiserson and Corey, 1998, Plant Molecular Biology (2nd Edition)。
可使用包括本發(fā)明的fl^Z/尸^ 基因的表達載體轉(zhuǎn)化宿主是包括水稻在內(nèi)多種植物，培育耐逆境的植物品種。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


序列表SEQ ID NO:l顯示的是本發(fā)明分離克隆的包含有&必ZZ7^3基因編碼區(qū)DNA片段序列。 圖1: &6^/7^< 基因分離和鑒定流程圖。
圖2:用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的載體，將目標(biāo)基因Qs6ZZ7^ 序列通過ferfil和AimI雙酶切連接到圖中標(biāo)注 的相應(yīng)酶切位點即得到fl^ZZ7^ 超量表達載體。
圖3:圖3A:用Northern檢測&^//^基因在干旱，高鹽，低溫脅迫和聚乙二醇(PEG)、脫落酸(ABA) 處理不同時間點的表達水平；圖3B:實時定量PCR檢測0^Z/7^ 基因在茉莉酸(JA)，水楊酸(SA)和2,4-D 等逆境脅迫不同時間點的表達水平；圖3C:實時定量PCR檢測Orf^J/^ 基因在不同組織中的表達S。
圖4: 0sbZIP23亞細胞定位和酵母生化試驗。圖4A: 0sbZIP23亞細胞定位。其中圖4A (i) (ii)為綠色熒 光下GFP表達的圖像，(iii)(iv)為亮背景下的結(jié)果。圖4A(i) (iii)為0sbZIP23的亞細胞定位結(jié)果，圖4A(ii) (iv)為陽性對照的亞細胞定位結(jié)果。圖4B: 0sbZIP23轉(zhuǎn)錄激活功能驗證。1、 control A， 2、 control B， 3、 control C， 4、 control D, 5、 control E， 6、 negative control, 7、 8、 0sbZIP23pDEST32。 C: N端和C端 缺失驗證0sbZIP23轉(zhuǎn)錄激活區(qū)段。"+ "和"一"表示X-gal顯色的有無。
圖5: fls6ZZ/^J超量表達植株ABA敏感性檢測，圖5A : Os6Zi7^ 超量表達T-DM結(jié)構(gòu)圖.B: Os6Z/7^ 超量表達家系S20、 S26、 S35以及野生型對照(WT)在含0, 1, 2, 3umABA的培養(yǎng)基上發(fā)芽6天后的發(fā)芽 率統(tǒng)計。圖5B-圖5C: fls6Z/7^5在含3 ix mABA的培養(yǎng)基上生長14天后表型和生物量統(tǒng)計。
圖6: 0^Z/P^3超量表達和突變體單株耐鹽性檢測。圖6A,正常生長的Os62J/^J超量表達、突變體和 ZH11植株；圖6B,鹽脅迫后Qs6Z/Z^J超量表達、突變體和ZH11植株；圖6C，鹽脅迫后&67//^< 超量表達、 突變體和ZH11綠葉面積統(tǒng)計。
圖7: fl Z^J/^ 超量表達植株耐干旱性能檢測。圖7A: flsAZZ7^ 超量表達、突變體和ZH11植株P(guān)VC管 中嚴重干旱脅迫后的表型。圖7B: 0te6Z/7^ 超量表達、突變體和ZH11植株P(guān)VC管中嚴重干旱脅迫后相對產(chǎn) 量統(tǒng)計。圖7C: OsZ^/尸i^超量表達家系和對照失水速率比較。
圖8: fl^2T尸^ 突變體植株ABA敏感性檢測。圖8A: OsZ^/尸iy基因結(jié)構(gòu)圖和T-DNA插入位置'圖8B-圖8C: 0^7//^ 突變體家系及互補家系(compl.)以及野生型對照(WT)在含O, 3, 5, 8nmABA的培養(yǎng)基 上發(fā)芽6天后的表型及發(fā)芽率統(tǒng)計。圖8D: fo6Zi7^ 突變體家系及互補家系(co即l.)以及野生型對照(WT) 在含5 u mABA的培養(yǎng)基上生長14天后生物量統(tǒng)計。
圖9:實時定量PCR驗證部分芯片數(shù)據(jù)。町野生型；0X1, 0X2:兩個獨立超表達家系。以0s開頭的編 號為TIGR數(shù)據(jù)庫中水稻基因的系統(tǒng)編號。
具體實施例方式
&6//尸2< 基因的全長cDNA是從水稻品種"中旱5號"(由中國上海農(nóng)科院提供的一個公開使用的一個 水稻品種)中擴增所得。to/^J/2^是一個抗逆境相關(guān)基因。主要依據(jù)有以下幾個方面(1)采，c咖A芯片技 術(shù)分析發(fā)現(xiàn)(登錄號為AK072062)對應(yīng)的cDNA克隆在水稻品種"中旱5號"干早脅迫處理后表達 量增加4. 34倍，在鹽脅迫后上升了 10. 91倍，在ABA處理后上升了 3. 73倍。(2)對其進行逆境條件下的表
達譜分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)在脅迫處理(干旱和鹽脅迫)的過程中，表達量有明顯的提高。(3),將其全長基因在 植株中超量表達，轉(zhuǎn)基因植株的脫落酸(ABA)敏感性、耐干旱和高鹽的性能力大大增強(圖7， 8)。 (4)將該 基因在植株中敲除，轉(zhuǎn)基因植株的ABA敏感性、耐干旱和高鹽的性能力下降(圖7， 8) (5)芯片雜交結(jié)果顯示 te6ZZ7^3超量表達引起了大量抗逆基因的上升表達。這些結(jié)果都表明fls》Z/尸2 基因是一個逆境相關(guān)調(diào)控基因， 參與植物對逆境的調(diào)控。
以下實施例進一步定義本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在上述前期工作基礎(chǔ)上分離克隆包含有fls/^/;^ 基因完 整編碼區(qū)段的DNA片段以及驗證fe6Z/7^ 基因功能的方法(本發(fā)明流程如圖l所示)。根據(jù)以下的描述和這 些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對 本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實施例l :分離克隆包含有OsZ^J/^ 基因區(qū)段的DNA片段
通過水稻品種"中旱5號"(由中國上海農(nóng)科院提供的公開使用的一個水稻品種)的干旱誘導(dǎo)基因表達 譜分析，發(fā)現(xiàn)了一個受干旱強烈誘導(dǎo)(干旱脅迫后期表達量提髙4,34倍以上)的基因，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，該 基因為bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的一個成員，其對應(yīng)日本水稻全長數(shù)據(jù)庫(http:〃cdna01.dna.affrC.gO. jp)'中 的cDNA克隆J01310犯06。根據(jù)該克隆序列，設(shè)計引物0sbZIP23F (5' -TMGGTACCATCCCACCTCTCCTCAGGTT-3'， 序列特異引物外加接頭,/wl位點)和0sbZIP23R (5' -TAAGGATCCGGCAGCTTCACCATCCTACT-3'，序列特異引物外 外加接頭5a通I)，將該克隆的序列從"中旱5號"品種中反轉(zhuǎn)錄擴增出來。擴增產(chǎn)物就是本發(fā)明的序列 67-1460bp。具體步驟為采用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公司)從干旱脅迫處理的水稻品種"中旱5號" 中提取葉片總RNA (提取方法根據(jù)上述TRIZOL試劑說明書)，利用反轉(zhuǎn)錄酶(購自Iiwitrogen公司)將其反 轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)cDNA克隆J01310犯06的序列設(shè)計的巢式引物將其從反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中擴增出來，反 應(yīng)條件為94"C預(yù)變性2min; 94'C 30sec, 55'C 30sec, 72匸2min， 30個循環(huán)；72"C延伸5min。將擴增 獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T載體(購自Promega公司)，篩選陽性克隆并測序，獲得所需的全長基因。該克 隆被命名為PGEM-fls6Zffi^。
實施例2:檢獮水稻內(nèi)源基因^CiX J的誘導(dǎo)表達
以水稻品種"中旱5號"為材料，在3葉期分別進行干旱、冷害和商鹽脅迫以及脫落酸(ABA),茉莉酸 (JA),水楊酸(SA), 2,4-D和聚乙二醇(PEG)處理。干早處理是將幼苗斷水，并在0 、 3 、 6 、 12和24 小時后取樣。冷害處理是將幼苗置于4t:生長箱，0 、 3 、 6 、 12和24小時后取樣'髙鹽脅迫是將幼苗根部 浸泡在200 mM/L NaCl溶液中并在O 、 5、 14和24小時后取樣。ABA處理是將幼苗根部浸泡在100 MM/L ABA 溶液中并在0 、 3、 6、 12和24小時后取樣。茉莉酸(JA),水楊酸(SA)和2,4-D處理是將幼苗分別噴 施O. l爛/L的激素后分別在0、 1、 2、 6和12小時后取樣。PEG處理是將幼苗根部浸泡在20W的PEG6000溶 液中并在0、 1、 2、 6和12小時后取樣。提取葉片的總RNA (Trizol試劑，Invitrogen)后按《分子克隆》(科 學(xué)出版社，北京，1999年版)有關(guān)實驗操作方法進行RNA轉(zhuǎn)膜，并以fl^27尸i^為探針做Northern雜交。由 于該基因本底表達較低，JA、 SA和2,4-D是用實時定量PCR進行的。結(jié)果表明'本發(fā)明克隆的基因fls6Zffia7 能被干旱、高鹽和ABA、 PEG誘導(dǎo)表達，但不受低溫和其它激素誘導(dǎo)(如圖3A-B所示)，是一個與逆境相關(guān)的 轉(zhuǎn)錄因子。
同時利用實時定量PCR申請人檢測了 0sbZIP23在各個組織的表達量，發(fā)現(xiàn)該基因在葉片中具有很高的表 達量(如圖3C所示)。
實施例3， 0sbZIP23亞細胞定位和酵母細胞的生化功能分析
利用洋蔥表皮細胞的瞬時表達體系'申請人將包含預(yù)測為0sbZIP23核定位序列的cDM片段同GFP融合， 通過玉米里的一個強啟動子Ubiquitin的驅(qū)動在洋蔥細胞表達'在熒光顯微鏡觀察的結(jié)果說明0sbZIP23是一
個核蛋白(如圖4A)。其基本程序為將洋蔥表皮細胞剝離并放置在常用的MS培養(yǎng)基上(如本說明書中的'遺 傳轉(zhuǎn)化，部分所示)，將約l ug/wL的PUbiquitin:0sbZIP23"GFP融合表達質(zhì)粒5 nL在50 nL金粉惡浮 液中在懸浮狀態(tài)包被(依次加2.5 mol/L氯化鈣50 uL, 0.1 raol/L亞精胺20 uL),無水乙醉淸洗并重懸 后，利用基因槍(Bio-RAD,美國)將包被質(zhì)粒的金粉打進洋蔥表皮細胞內(nèi)，28 'C暗培養(yǎng)8-24 h,在萊卡激 光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照記錄。
0sbZIP23基因全長序列用引物(0sbZIP23y2hF: taagtcgacGATGGATTTTCCGGGAGGGA )和 (Qy6Zff^y2hR: taagggggfigeTGGACCCGTCAGAGTCCT )擴增后，通過I和油《I酶切連接到酵母 GAL4-DB融合表達載體pDBLEU (購自Invitrogen公司)，將其轉(zhuǎn)化酵母細胞MaV203 (購自Invitrogen公司)， 經(jīng)p-Galactosidase瞎活性和colony-lift filter實驗，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的酵母細胞顯藍色，說明其能夠激活報告基因 的表達(如圖4B),表明OAZZP"蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活功能。
為了鑒定tt^ZZ/^3的轉(zhuǎn)錄激活功能域和準(zhǔn)備下一步做蛋白互作的文庫篩選，申請人分別從基因的N端和 C端進行了缺失，然后通過檢測缺失片段的轉(zhuǎn)錄激活活性來確定其轉(zhuǎn)錄激活功能域。N端缺失的結(jié)果顯示 fe^Z/"尸Z 的轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵序列在其ORF的l-179bp,當(dāng)缺失這一段后，ft^ZZR"喪失了轉(zhuǎn)錄激活活性。從 C端開始缺失的結(jié)果顯示只有當(dāng)Os6ZZ7^ 基因缺失了 630-1069bp時，Os6Zffi25才喪失轉(zhuǎn)錄激活活性，可 以推測630-720bp是Gs6ZZ7^ 轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵序列。因此申請人認為Qs627尸^ 的轉(zhuǎn)錄激活活性受到兩段序 列的控制，失去其中的任意一段，a^Z/7^J就會失去轉(zhuǎn)錄激活活性(如圖4C)。 實施例4， flsAZZ7^ 基因超量表達載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化
根據(jù)實施例2的結(jié)果，知道本發(fā)明基因tt^277^5是能被干旱、高鹽，PEG和ABA誘導(dǎo)表達的，為了能更 好地闡明此基因的功能，申請人將其在水稻中超量表達，從轉(zhuǎn)基因植株的表型來驗證。方法是首先將實施 例1中得到的陽性克隆pGEM-0sbZIP23質(zhì)粒用^asfll和f/wl雙酶切(見圖2所示)，回收外源片段同時，用 同樣的方法瞎切攜帶玉米強啟動子Ubiquitinl的遺傳轉(zhuǎn)化載體pU1301(pU1301是在國際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn) 化載體pCAMBIA1301,來自澳大利亞CAMBIA實驗室，Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)基礎(chǔ)上改建的，攜帶具有組成型和超量表達特征的玉米強啟動子Ubiquitinl 的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體，瞎切完畢,用氛仿異戊醇(體積比24: l)抽提，純化酶切產(chǎn)物。用包含fo6Z//^3 基因的酶切片段和酶切的PU1301載體(如圖5A所示)做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10 P (菌株購自Invitrogen 公司)。通過酶切篩選陽性克隆，獲得轉(zhuǎn)化載體。
突變體互補載體的構(gòu)建過程是這樣的
通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系將其導(dǎo)入到水稻品種中花11 (中國水稻研究所提供的一個公開使用 的一個水稻品種)中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、浸染、共培養(yǎng)、篩選具有潮整素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽' 得到轉(zhuǎn)基因植株。上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(粳稻亞種)遺傳轉(zhuǎn)化體系應(yīng)用Hiei等人報道的方法(參見:Efficient transformation of rice， (5ry幼L , mediated by /^ro6acterj.咖and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA， 1994, Plant Journal 6:271-282)基礎(chǔ)上進行優(yōu)化(遺傳轉(zhuǎn)化步驟、培養(yǎng)基及 培養(yǎng)篩選條件參見下面詳細描述)。
將獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株被命名為S83。本發(fā)明總共獲得獨立轉(zhuǎn)基因水稻植株34株。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(粳稻亞種)遺傳轉(zhuǎn)化體系采用申請人所在的作物遺傳改良國家重點實驗室建立的轉(zhuǎn)化 體系(專利號ZL 200410013344.2; ZL 200410013345.7;專利申請?zhí)?00610141702.7)。該體系的具體步驟
如下 (1〉試劑和溶液縮寫
本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA(6-BenzylaminoPnrine, 6-芐基腺囁呤)； CN (Carbenicillin,羧芐青霧素)；KT (Kinetin,激動素)NM (Napthalene acetic acid'萘乙酸)；
IM (Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-二氯苯氧 乙酸)；AS (Acetosringone,乙酰丁香酮)；CH (Casein Enzymatic Hydrolysate,水解酪蛋白)； HN (Hygromycin B,潮霉素)；DMSO (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亞砜)；N6max (N6大量成分溶液)； N6mix (N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmix (MS微量成分溶液) (2)主要洛液配方
1)恥培養(yǎng)基大Jt元素母液[IO倍濃縮液(10X)]的配制
硝酸鉀(KN03) 28. 3 g
磷酸二氫鉀(KftP0》 4. 0 g
硫酸銨((NH4)2S04) 4.63 g
硫酸鎂(MgS04 7H2O) 1. 85 g
氯化鈣(CaCh *2H20) 1.66 g 逐一溶解，然后室溫下定容至1000 ml。 2) N6培養(yǎng)基傲i元素母液[IOO倍濃縮液(100X)]的配制
碘化鉀(KI) 0.08 g
硼酸(ftfiOs) 0.16 g
硫酸續(xù)(MnSO* 他0) 0. 44 g
硫酸鋅(ZnS07H2O) 0.15 g 室溫下溶解并定容至IOOO ml。
3)鐵鹽(Fe孤TA)貯存液(100X)的配制
準(zhǔn)備800 ml雙蒸水并加熱至7(TC，加入乙二銨四乙酸二鈉(N&EDTA 2H20) 3.73克，充分溶
解后在7(TC水浴中保持2小時，定容至1000 ml， 4'C保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)配制
煙酸(Nicotinic acid)0. 1 g
維生素Bl (Thiamine HC1)0.1 g
維生素B6 (Pyridoxine HC1)0.1 g
甘氨酸(Glycine)0.2 g
肌醇(Inositol)10 g
加水定容至1000 ml, 4"C保存?zhèn)溆谩?br> 5) MS培養(yǎng)基大量元素母液(IOX)的配制硝酸銨(NftN03)16.5 g
硝酸鉀19.0 g
磷酸二a鉀1. T g
硫酸鎂3.7 g
氯化鈣"g
室溫下溶解并定容至IOOO ml。
6) MS培養(yǎng)基微i元素母液(IOOX)的配制碘化鉀0.083 g
硼酸0.62 g
硫酸錳0.86 g
鉬酸鈉(NajMo04 2!fc0)0. 025 g
硫酸銅(CuSO* 5H20)0.0025 g
室溫下溶解并定容至1000 ml。
7) 2,4-D貯存液(1 mg/nl)的配制
秤取2,4-D 100 mg，用l ml 1 N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IO ml蒸餾水溶解完全后定容至100 ml， 于室溫下保存。
8) 6-BA貯##[ (1 mg/ml)的配制
秤取6-BA 100 mg，用l ml 1 N氨氧化鉀溶解5分鐘，然后加IO ml蒸餾水溶解完全后定容至100 ml，室溫保存。
9) 萘乙酸(NAA)貯存液(1 mg/ml)的配制
秤取NM 100 mg,用l ml 1 N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IO ml蒸餾水溶解完全后定容至100 ml, 4'C保存?zhèn)溆谩?br> 10) 吲哚乙酸(IAA )貯存液(1 mg/ml)的配制
秤取IM 100 mg，用l ml 1 N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IO ml蒸餾水溶解完全后定容至100 ml, 4r保存?zhèn)湓谝粋€大三角瓶中加入300 ml蒸餾水和硫酸鐵(FeS04 7H,0) 2. 78g。在另一個大 三角瓶中加入300 ml蒸餾水用。
11) 葡萄糖貯存液(0.5 g/ml)的配制
秤取葡萄糖125 g，然后用蒸餾水溶解定容至250 ml,滅菌后4'C保存?zhèn)溆谩?br> 12) AS貯存液的配制
秤取AS 0.392 g , DMSO 10 ral,分裝至l. 5 ml離心管內(nèi)，4t)保存?zhèn)溆谩?br> 13) IN氣氧化鉀貯存液
枰取氫氣化鉀5.6 g，并用蒸餾水溶解定容至100 ml，室溫保存?zhèn)溆谩?(3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方
1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基
N6max母液(10X) N6mix母液(100X) Fe2+EDTA貯存液(100X) 維生素貯存液(100X) 2， 4-D貯存液 脯氨酸(Proline) CH
蔗糖(Sucrose) Phytagel
100 ml
10 ral
10 ml
10 ml 2.5 ml 0.3 g 0.6 g 30 g 3 g
加蒸餾水至900 ml， IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至IOOO ml,分裝到50 ml三角瓶(25 ml /瓶)，封口滅菌。 2)繼代培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 100 ml
N6mix母液(100X) 10 ml
Fe2+EDTA貯存液(100X) 10 ml
維生素貯存液(100X) 10 ml
2,4-D貯存液 2. 0 ml
脯氨酸 0. 5 g
CH 0. 6 g
蔗糖 30 g
Phytagel 3 g
N6raax母液(10X)
N6mix母液(100X)
Fe2+EDTA貯存液(應(yīng))
維生素貯存液(100X)
2,4-D貯存液
CH
蔗糖
瓊月旨粉(Agarose)
加蒸鎦水至900ml， lN氣氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9,煮沸并定容至1000 ml,分裝到50ml三角瓶(25 ml /瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基
12. 5 ml 1. 25 ml 2.5 ml 2.5 ml 0. 75 ml 0.15 g 5 g l.巧g
加蒸餾水至250 ml， IN敦氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5 ml葡萄糖貯存液和250 W AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25 ml / 皿)。
4) 共培養(yǎng)基
N6raax母液(10X) 12.5 ml
N6raix母液(100X) 1.25ml Fe"EDTA貯存液(100X) 2.5 ml
維生素貯存液(100X) 2.5 ml
2,4-D貯存液 0. 75 ml
CH 0.2 g
蔗糖 5 g
瓊脂粉 1. 75 g
加蒸餾水至250 ml， IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6,封口滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5 ml葡萄糖貯存液和250 W AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25 ml / 每皿)。
5) 懸浮培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 5 ml
N6mix母液(100X) 0.5 ml
Fe2+EDTA貯存液(100X) 0.5 ml
維生素貯存液(100X) 1 ml
2,4-D貯存液 0. 2 ml
CH 0. 08 g
蔗糖 2 g
加蒸餾水至lOOml,調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個IOO ml的三角瓶中'封口滅菌。 使用前加入l ml葡萄糖貯存液和IOO W AS貯存液。
6) 選擇培養(yǎng)基
25 ml 2.5ral 2.5 ml 2.5 ml 0. 625 ml 0.15 g
N6max母液(10X) N6mix母液(100X) Fe2+EDTA貯存液(100X)
維生素貯存液(ioox)
2,4-D貯存液
CH
蔗糖 7. 5 g
瓊脂粉 1. 75 g
加蒸餾水至250 ml,調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 W HN和400卯m CN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25 ml /皿)
7) 預(yù)分化培養(yǎng)基
25 ml 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 50 W 50 Hi
0. 15 g 7.5 g
1. " g
加蒸餾水至250 ml, 1 N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，封口滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 HN和200 ppm CN,分裝倒入培養(yǎng)皿中(25 ml /皿)
8) 分化培養(yǎng)基
N6腿x母液(10X)
N6mix母液(100X)
Fe"EDTA貯存液(100X)
維生素貯存液(100X)
6-BA貯存液
KT貯存液
NM貯存液
IM貯存液
CH
蔗糖
瓊脂粉
N6max母液(10X)
N6mix母液(100X)
Fe2*EDTA貯存液(100X)
維生素貯存液(100X)
6-BA貯存液
KT貯存液
NM貯存液
IM貯存液
C H
蔗糖
Phytagel
100 ml 10 ml 10 ml 10 ml 2 ml 2 ml 0.2 ml 0.2 ml
1 g 30 g
3 g
加蒸餾水至900 ml, 1 N氫氣化鉀調(diào)節(jié)pH值到6. 0。
煮沸并定容至IOOO ml,分裝到50 ml三角瓶(50 ml /瓶)，封口滅菌,
9)生根培養(yǎng)基
MSmax母液(10X) 50 ml
MSraix母液(100X) 5 ral
Fe2<EDTA貯存液(100X) 5 ral
維生素貯存液(100X) 5 ral
蔗糖 30 g
Phytagel 3 g
加蒸館水至900 ml, 1 N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。 煮沸并定容至IOOO ml,分裝到生根管中(25 ral /管)，封口滅菌。 (4)農(nóng)桿苗介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟 4.1愈傷誘導(dǎo)
(1) 將成熟的水稻種子(中花ll,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)去殼，然后依次用70*的 乙醇處理1分鐘，0. 15%氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；
(2) 用滅菌水洗種子4-5次；
(3) 將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；
(4) 將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25土lt:。 4.2愈傷繼代
挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25土1"C。 4. 3預(yù)培養(yǎng)
挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25土1"C。 4.4農(nóng)桿菌培養(yǎng)
(1) 在帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105 (來源于CAMBIA,商用菌株) 兩天，溫度28'C;
(2) 將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28r搖床上培養(yǎng)2-3小時。 4. 5農(nóng)桿苗侵染
(1) 將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；
(2) 調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至Oaoo 0.8-1.0:
(3) 將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；
(4) 轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-2(TC。 4. 6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)
(1) 滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；
(2) 浸泡在含400 ppm羧芐靑霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；
(3) 轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干
(4) 轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。(第一次潮每素篩選濃度為400 pp邁，第
次以后為250 ppm) 4.7分化
(1) 將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7周；
(2) 轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室溫度26"C下每天光照培養(yǎng)14小時(光照強度 1000-15001ux),暗培養(yǎng)10小時。
4.8生根
(1) 剪掉分化時產(chǎn)生的根；
(2) 然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，培養(yǎng)條件同4. 7的步驟(2)所述。 4.9移栽
洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時在最初的幾天保持水分濕潤。
實施例5: ^Z^/月25基因轉(zhuǎn)基因T2家系對ABA敏感性的檢測
為了確定超量表達&6Z/Z^ 基因是否也會提髙轉(zhuǎn)基因植株發(fā)芽時的ABA敏感性，申請人將野生型、陰性 對照和轉(zhuǎn)基因家系的種子去殼消毒'將狀態(tài)一致的種子放到分別含有濃度為0、 1、 2、 3 一ol/LABA的MS培 養(yǎng)基生長，三天后開始每天觀察種子的發(fā)芽率'結(jié)果申請人發(fā)現(xiàn)在旭A存在下'轉(zhuǎn)基因植株發(fā)芽率明顯低于 對照，說明超量表達&6ZT/^ 的轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)芽受到抑制(圖5)。也就是說超蕭表達&AZ/P2J導(dǎo)致轉(zhuǎn)基 因植株發(fā)芽時對ABA的敏感性增強。
為了確定超量表達fl^ZT/^J基因是否也會提高轉(zhuǎn)基因植株苗期生長對的ABA敏感性，申請人將野生型、 陰性對照和轉(zhuǎn)基因家系的種子去殼消毒，在含有100 mg/L,潮霉素的MS培養(yǎng)基發(fā)芽后，將長勢一致的幼芽轉(zhuǎn) 至含有濃度為0陶ol/L和3 Wnol/L ABA的MS培養(yǎng)基生長，分別測量生長1星期后的每株幼苗的根長和株離。 如圖5所示，申請人發(fā)現(xiàn)在3 tool/L ABA存在下，轉(zhuǎn)基因植株的根長和株髙都明顯短于對照，說明超量表達 fe6Z/Z^J的轉(zhuǎn)基因植株的生長受到抑制。也就是說超量表達te6Z/Z^ 導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株生長時對ABA的敏感性 增強。
綜上所述，flsZ;ZZ/^ 的超量表達在發(fā)芽和生長兩個方面提髙了植株對ABA的敏感性。
實施例6: fo6Zffi25基因轉(zhuǎn)基因T,家系苗期耐鹽性篩選
為了驗證轉(zhuǎn)基因水稻植株的耐鹽性是否增強以及其增強是否與轉(zhuǎn)入的&6///^< 基因有關(guān)，本發(fā)明T2代 植株的部分家系進行了耐鹽性篩選。具體步驟如下申請人在小紅桶中對植株進行了高鹽脅迫處理，首先對 小紅桶生長3個星期的植株，斷水，表層干時，用200咖ol/L NaCl溶液代替水澆灌小紅桶，每3天澆灌一 次。在NaCl處理7d時，申請人觀察到對照植株葉片已萎焉并開始失綠，轉(zhuǎn)基因植株卻才開始出現(xiàn)葉片蔞焉； 在NaCl處理12 d后，統(tǒng)計了各家系的植株葉片的綠葉面積并照相。從統(tǒng)計數(shù)據(jù)可看出，在200 mmol/L NaCl 處理12d后，對照植株的綠葉面積只有35%,但轉(zhuǎn)基因家系卻還有85%以上的綠葉，說明fo6Zff^ 超量表 達提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性(圖6)。 實施例7: fl^Zff^ 基因轉(zhuǎn)基因T,家系成株期耐早性篩選
本試驗是在PVC管中進行了干旱脅迫試驗，設(shè)2個重復(fù)，每個重復(fù)每個家系12株；對轉(zhuǎn)基因植株在抽穗 灌漿期進行了脅迫，脅迫到抽糖基本完成后，復(fù)水讓其繼續(xù)生長，具體的脅迫方法詳見材料與方法。從圖21 可以看出，轉(zhuǎn)基因植株在嚴重干早脅迫復(fù)水后，還能恢復(fù)繼續(xù)生長，而野生型葉片死亡較多，已不能恢復(fù)正 常。待水稻成熟后，對正常生長和脅迫生長的材料進行了考種，從統(tǒng)計結(jié)果可看出，在正常條件下，轉(zhuǎn)基因 超量表達家系和野生型對照之間的結(jié)實率和單株產(chǎn)量有一定的差異。正常條件下，野生型的結(jié)實率有90.3戰(zhàn)， 轉(zhuǎn)基因的家系的結(jié)實率大約有70%,這可能是由于轉(zhuǎn)基因過程(組培)引起的。在配有大棚的PVC管中干旱脅 迫后，野生型對照的結(jié)實率降為36%左右，而轉(zhuǎn)基因超量表達家系的結(jié)實率還保持在60%以上，差異極其顯 著。從每株的相對產(chǎn)量來看，在配有大棚的PVC管中干旱脅迫后，野生型對照的每株相對產(chǎn)量為15.29%左右， 而轉(zhuǎn)基因超量表達家系的結(jié)實率還保持在50%以上，這些統(tǒng)計結(jié)果都表明在干旱脅迫下fc6Z/jR^ 超量表達轉(zhuǎn) 基因家系比陰性對照或野生型植株有更高的結(jié)實率，具有更強的抗早性(如圖7A-B所示)。
一般來說，耐干旱的植物會在干旱條件下保持較低的水分蒸騰，維持生物體內(nèi)正常生理活動所霈的水分。 申請人:取四葉期正常生長的水稻葉片在離體的條件檢測了它們失水速率。申請人把水稻葉片剪下來，在室溫 的條件下，分別在0、 0.5、 2、 4、 6、 8、 12和24小時在千分之一天平上稱重，然后計算它們失水的速率。 實驗結(jié)果如圖7C所示，0"Z^2J超量表達植株能在干早的條件下維持較低的水分喪失速率，大約比野生型對 照低5%左右。離體檢測24小時后，兩者基本沒有差異，說明此時兩者都已經(jīng)喪失了保持水分的能力。以上結(jié) 果說明，0s6ZZ/^ 超量表達使植株能更好的保持體內(nèi)的水分。
實施例8: ft^Z/fi^突變體的分離及表型鑒定
在突變體數(shù)據(jù)庫咖D(http:〃rmd. ncpgr. cn/)中，申請人找到了 Os6Z/Z^J的T-DNA插入突變體osfej'/^ ， 突變體編號為04Z11IJ69,經(jīng)過基因型檢測確定T-DNA插在fls6Zffi 3的第二個內(nèi)含子區(qū)域(如圖8A所示)。 通過實時定量PCR檢測表達量，發(fā)現(xiàn)該基因的表達量只有背景信號，說明該基因己經(jīng)被完全抑制'這個突變 體為申請人從另一個角度研^個基因的功能提供了便利。 8.1 fl^Z/Z^ 突變體植株ABA敏感性分析
為了確定fl^ZT尸W基因的敲除是否也會影響轉(zhuǎn)基因植株發(fā)芽時的ABA敏感性，申請人將野生型和突變體 家系的種子去殼消毒，將狀態(tài)一致的種子放到分別含有濃度為0、 3、 5、 8 Pmol/L旭A的MS培養(yǎng)基生長'三
天后開始每天觀察種子的發(fā)芽率。結(jié)果申請人發(fā)現(xiàn)在ABA存在下，，突變體植株發(fā)芽率明顯高于對照(圖8B-C), 說明敲除fls力Z/7^ 基因植株的發(fā)芽受到抑制的程度要遠低于對照。
為了確定敲除&67//^< 基因是否也會提髙轉(zhuǎn)基因植株生長的旭&敏感性，申請人將野生型和突變體家系 的種子去殼消毒，在含有100 mg/L潮每素的MS培養(yǎng)基發(fā)芽后，將長勢一致的幼芽轉(zhuǎn)至含有濃度為0 Mmol/L 和5 rtnol/L ABA的MS培養(yǎng)基生長，分別測量生長1星期后的每株幼苗的根長和株高。圖8D所示，申請人發(fā) 現(xiàn)在5 Wnol/L ABA存在下，突變體的生長量要明顯高于對照。由于正常條件下，OsA /Z^J的株離要短于對 照，因此申請人用在ABA存在的條件下植株的相對生長量來衡量植株受ABA抑制的程度，實驗結(jié)果顯示在5 陶ol/L ABA存在的條件下，野生型的相對生長量只有20%,而的相對生長量達到50%以上。
當(dāng)申請人將該突變體互補以后，申請人發(fā)現(xiàn)互補突變體的ABA鈍感得到了恢復(fù)。以上結(jié)果說明fo&27/^J 在植株ABA信號傳導(dǎo)過程中起著重要的作用，它的敲除降低了植株對旭A的敏感性。 8. 2 &62//^< 突變體植株苗期抗鹽性和抗旱性分析
同Gs6^7^3超量表達耐鹽性檢測一樣，申請人在小紅桶中對植株進行了高鹽脅迫處理。植株長到四葉期后， 用200 mmol/LNaCl溶液代替水港灌小紅桶，每3天燒灌一次。在NaCl處理5天時，申請人觀察到突變體植 株葉片已蔞焉并開始失綠，野生型植株卻才開始出現(xiàn)葉片萎焉；在NaCl處理12天后，統(tǒng)計了各家系的植株 葉片的綠葉面積并照相。從統(tǒng)計數(shù)據(jù)可看出，在200 mmol/L NaCl處理12天后，對照植株的綠葉面積有35%, 但突變體家系只有15%左右的綠葉(如圖6所示)，說明突變體植株的耐鹽性下降了。 0^^//^ 突變體植株成 株期干旱后沒有明顯的表型變化，但考種結(jié)果顯示在配有大棚的PVC管中干旱脅迫后，野生型對照的每株相 對產(chǎn)量為15. 29%左右，而突變家系的結(jié)實率只有6. 63% (如圖7所示)，說明突變體植株的耐早性下降了 。 以上結(jié)果說明&6ZZ/^3的敲除影響了植株的耐鹽性和耐旱性。 實施例9 0s6ZJ/^3轉(zhuǎn)基因植株的基因表達譜分析
是個轉(zhuǎn)錄因子，可能調(diào)控許多下游基因的表達，將其在植物超量表達后，應(yīng)會引起植物中許多 基因表達量的變化。為了確定哪些基因表達量有變化或者哪些可能是0^^/iRW調(diào)控的下游靶基因，本研究利 用DM chip技術(shù)分析了轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的基因表達譜，通過基因表達的差異，來預(yù)測fl^Zf尸"的 可能下游耙基因。申請人將正常種植的2個^^7KM超量表達家系和1株野生型植株RNA與Affimatrix寡 核苷酸的水稻全基因組芯片雜交，來比較轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的基因表達譜差異。
統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)fo6ZJ/^3超量表達植株與野生型對照相比，基因表達量上升的有237個基因，對這些差異 表達的基因進行功能預(yù)測和分類，并在實驗室已發(fā)表和未發(fā)表的逆境脅迫(干旱，鹽，ABA)芯片數(shù)據(jù)中查看 了這些基因的表達情況，申請人發(fā)現(xiàn)上升表達的基因中大約有80%的基因編碼一些參與逆境應(yīng)答反應(yīng)的蛋白， 比如調(diào)控蛋白(包括轉(zhuǎn)錄因子，蛋白激酶和磷酸化酶)，編碼滲透調(diào)節(jié)產(chǎn)物基因(LEA蛋白、脫水蛋白、脂質(zhì) 轉(zhuǎn)運子、P450蛋白等)，參與脫毒和還原反應(yīng)的蛋白和一些保護大分子的蛋白。還有一些上升表達的基因功能 未知。
同時對flsZ^/Z^ 突變體芯片雜交中下降表達的基因也進行了分析，teZ^/Z^ 突變體植株下降表達的基 因有80個，同樣對這些下降表達的基因進行功能預(yù)測和分類，并在實驗室已發(fā)表和未發(fā)表的逆境脅迫(干旱， 鹽，ABA)芯片數(shù)據(jù)中査看了這些基因的表達情況，結(jié)果顯示.在突變體中， 一些表達下降的基因是受到干早、 鹽或ABA誘導(dǎo)的。
為了驗證芯片結(jié)果的可靠性以及對啟動子序列分析的正確性，本研究還對部分基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表 達量進行了分析(如圖9所示)，結(jié)果顯示在超量表達轉(zhuǎn)基因植株中這些基因的表達量確實是上升的而在突變 體中大都沒有變化或下降表達，個別的表達量有略微的上升'說明te6ZJ/^ 確實能調(diào)控一系列與逆境相關(guān)基 因的表達，從而應(yīng)對不利環(huán)境。
_序列表_
110〉 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120〉利用水稻轉(zhuǎn)錄因子0sbZIP23提高植物耐逆境能力 <130〉
<141〉 2008-05-15 <160> 2
<170> Patentln version 3.1 <210〉 1 <211〉 1828 <212> DNA
<213> 水稻(0ryza sativa) <220〉
<221〉 gene
<222〉 (1)..(1828)
<223〉
<220>
<221> CDS
<222> (218).. (1288)
<223>
<400> 1
ggtccggttt cctctcctcg cctcgccgcg gcgcccgcgt cctcctcacc aacgccagag 60 ctccacatcc cacctctcct caggttcccg tctctgatcc ctcgttgcgt tacggggaag 120 caggcgtggt ggUgctccc cgtgcggagt tUcgattgg tttggttggg tgagtttggt 180 gctggggtgt tggggattgg UggUggag tttggag atg gat ttt ccg gga ggg 235
Met Asp Phe Pro Gly Gly 1 5 acg ccg ctg ccg Ug gcg 283 Thr Pro Leu Pro Leu Ala 20
gac gag ttc cag age acg 331 Asp Glu Phe Gin Ser Thr 35
atg aac atg gac gag etc 379 Met Asn Met Asp Glu Leu 50
cac gcc gtc ggc gcc gcc 427 His Ala Val Gly Ala Ala 65 70 gcg gcg gcg gag cac gcg 475 Ala Ala Ala Glu His Ala 85
ggg teg ctg acc etc ccc 523
age ggg agg cag cag Ser Gly Arg Gin Gin 10
agg cag ggg teg gtg Arg Gin Gly Ser Val 25
ctg ggc ggg gtc ggg Leu Gly Gly Val Gly 40
etc cgc age ate tgg Leu Arg Ser lie Trp 55
acg acg acg acg gcg Thr Thr Thr Thr Ala 75
gcg gtg ggg gcg ccg
cag ctg ccg ccg atg
Gin Leu Pro Pro Met 15
tac teg etc acg ttc
Tyx Ser Leu Thr Phe 30
aag gac ttc ggg teg
Lys Asp Phe Gly Ser 45
acg gcc gag gag teg
Thr Ala Glu Glu Ser 60
acg acg gcg tec gtg
Thr Thr Ala Ser Val 80
ccc gtt cag agg cagAla Val Gly Ala Pro Pro Val Gin Arg Gin Gly Ser Leu Thr Leu Pro
90 95 100
cgc acg etc age cag aag acc gtc gac gag gtc tgg cgc gac atg atg 571
Arg Thr Leu Ser Gin Lys Thr Val Asp Glu Val Trp Arg Asp Met Met
105 110 115
tgc ttc ggt ggc ggc ggc gcc tec acc gcg ccg gcc gcc gcg gag ccc 619
Cys Phe Gly Gly Gly Gly Ala Ser Thr Ala Pro Ala Ala Ala Glu Pro
120 125 130
ccg ccg ccg gcg cac egg cag cag acg etc ggg gag ate acg ctg gag 667
Pro Pro Pro Ala His Arg Gin Gin Thr Leu Gly Glu lie Thr Leu Glu 135 140 145 150
gag Uc etc gtg egg gcc ggc gtg gtg agg gag gac atg teg gtc ccg 715
Glu Phe Leu Val Arg Ala Gly Val Val Arg Glu Asp Met Ser Val Pro
155 160 165
ccc gtc ccg ccg gcg ccg act cct acg gcg get get gta cct ccc ccg 763
Pro VaJ Pro Pro Ala Pro Thr Pro Thr Ala Ala Ala Val Pro Pro Pro
170 175 180
ccg ccg ccg cag cag cag acg ccg atg ttg Uc ggt cag age aat gtg 811
Pro Pro Pro Gin Gin Gin Thr Pro Met Leu Phe Gly Gin Ser Asn Val
185 190 195
Uc cct ccg atg gtg cct ccg etc teg ctg gga aat ggg ctg gtc teg 859
Phe Pro Pro Met Val Pro Pro Leu Ser Leu Gly Asn Gly Leu Val Ser
200 205 210
gga get gtc gga cac ggc ggt ggt ggt gcc gcg teg ttg gtt teg ccg 907
Gly Ala Val Gly His Giy Gly Gly Gly Ala Ala Ser Leu Val Ser Pro
215 220 225 230
gtg agg ccg gtc teg tec aat ggc Uc ggc aag atg gaa ggc ggg gac 955
Val Arg Pro Val Ser Ser Asn Gly Phe Gly Lys Met Glu Gly Gly Asp
235 240 245
ctg teg teg ctg teg cca teg ccg gtg ccg tac gtt ttc aaa ggt ggg 1003
Leu Ser Ser Leu Ser Pro Ser Pro Val Pro Tyr Val Phe Lys Gly Gly
250 255 260
ctg agg gga agg aag gca ccg ggc ate gag aag gtt gtc gag aga卿 1051
Leu Arg Gly Arg Lys Ala Pro Gly lie Glu Lys Val Val Glu Arg Arg
265 270 275
cag egg egg atg ate卿aac agg gag tct gcc gcg agg teg cgc cag 1099
Gin Arg Arg Met lie Lys Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg Gin
280 285 290
agg aaa cag gca tat atg atg gaa ttg gaa get gag gta gca aaa ctt 1147
Arg Lys Gin Ala Tyr Met Met Glu Leu Glu Ala Glu Val Ala Lys Leu
295 300 305 310
犯g gag ctg aac gat gaa etc cag aaa aag cag gat g朋atg ttg gag 1195
Lys Glu Leu Asn Asp Glu Leu Gin Lys Lys Gin Asp Glu Met Leu Glu
315 320 325
cag caa aag aat gag gtt eta gag aga atg age cga caa gtt gga ccg 1243
Gin Gin Lys Asn Glu Val Leu Glu Arg Met Ser Arg Gin Val Gly Pro
330 335 340
aca gca aag aga att tgc ctt egg agg act ctg acg ggt cca tgg 1288
Thr Ala Lys Arg lie Cys Leu Arg Arg Thr Leu Thr Gly Pro Trp
345 350 355
tgatcgaagc taaaggecta gttacctgta actagaacac agtcctttca atgtgagcag 1348
tgatcatagt agttgtagga tggtgaagct gaagacctgg ttacctgtaa ctagaacaca 1408
gtcctttcaa agtgagcagt gattacagta gtagtaggat ggtgaagctg ccagttacct 1468
gtaactagaa cacagtcctt tcaaagtgag tatagtagta ggttagttca gaatcgccag 1528
ategatctge ccttgtaggc caaccattag tccgtgggct tgtctcttgg geggacagge 1588
tgectgagat attcactcga taggttttag ttgtctgagt tatatcc卿cattgtatgt 1648
aacctattta accatggtgc ctgctacctg tattgtattt tgctgctgta ggaacctatg 1708
tcggtgttac catcttgttc ttaatttgtg tacttctctt gccattttgg ataagatgta 1768
tctgaactta tacatatgta cttttccttg ccattttgga caagatgtat ctgaatttac 1828
<210> 2
<211〉 357
<212> PRT
<213〉 水稻(Oryz3 sativa)
<400> 2
Met Asp PheProGlyGlySerGlyArgGinGinGinLeuProProMet
151015
Thr Pro LeuProLeuAlaArgGinGlySerValTyrSerLeuThrPhe
202530
Asp Glu PheGinSerThrLeuGlyGlyValGlyLysAspPheGlySer
354045
Met Asn MetAspGluLeuLeuArgSerlieTrpThrAlaGluGluSer
505560
His Ala ValGlyAlaAlaThrThrThrThrAlaThrThrAlaSerVal
65707580
Ala Ala AlaGluHisAlaAlaValGlyAlaProProValGinArgGin
859095
Gly Ser LeuThrLeuProArgThrLeuSerGinLysThrValAspGlu
100105110
Vsl Trp ArgAspMetMetCysPheGlyGlyGlyGlyAlaSerThrAla
115120125
Pro Ala AlaAlaGluProProProProAlaHisArgGinGinThrLeu
130135140Gly Glu lie 145
Glu Asp Met Ala Ala Val Phe Gly
Gly Asn 210 Ala Ser 225
Lys Met
Tyr Val
Lys Val
Ala Ala 290 Ala Glu 305
Gin Asp Ser Arg Leu Thr
Gin 195 Gly
Leu
Glu
Phe
Val 275 Arg
Val
Glu
Gin
Gly 355
Thr
Ser
Pro 180 Ser
Leu
Val
Gly
Lys 260 Glu
Ser
Ala
Met
Val 340 Pro
Leu
Val 165 Pro
Asn
Val
Ser
Gly 245 Gly
Arg
Arg
Lys
Leu 325 Gly
Trp
Glu 150 Pro
Pro
Val
Ser
Pro 230 Asp
Gly
Arg
Gin
Leu 310 Glu
Pro
Glu
Pro
Pro
Phe
Gly 215 Val
Leu
Leu
Gin
Arg 295 Lys
Gin
Thr
Phe Leu Val Val Pro
Pro
Pro 200 Ala
Arg
Ser
Arg
Arg 280 Lys
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Gin
Ala
Pro 185 Pro
Val
Pro
Ser
Gly 265 Arg
Gin
Leu
Lys
匕ys 345
Pro 170 Gin
Met
Gly
Val
Leu 250 Arg
Met
Ala
Asn
Asn 330 Arg
Arg 155 Ala
Gin
Val
His
Ser 235 Ser
Lys
lie
Tyr
Asp 315 Glu
lie
Ala Gly
Pro Thr
Gin Thr
Pro Pro 205 Gly Gly 220
Ser Asn
Pro Ser
Ala Pro
Lys Asn 285 Met Met 300
Glu Leu Val Leu Cys Leu
Val
Pro
Pro 190 leu
Gly
Gly
Pro
Gly 270 Arg
Glu
Gin
Glu
Arg 350
Val Arg 160 Thr Ala 175
Met Leu
Ser Leu
Gly Ala
Phe Gly 240 Veil Pro 255
lie Glu
Glu Ser
Leu Glu
Lys Lys 320 Arg Met 335
Arg Thr
權(quán)利要求
1、OsbZIP23基因介導(dǎo)的賦予植物耐逆境能力的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO1中第1-1828位所示的DNA序列，或(b)編碼與(a)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列。
2、 合適啟動子連接的權(quán)利要求1所述的DNA序列。
3、 權(quán)利要求1或2所述的DNA序列在增加植物耐逆境能力中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及調(diào)控水稻抗逆境的轉(zhuǎn)錄因子基因OsbZIP23的克隆、功能驗證及應(yīng)用。本發(fā)明的特征是，OsbZIP23基因介導(dǎo)的賦予植物耐逆境能力的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO1中第1-1828位所示的DNA序列，或(b)編碼與(a)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列，也包括以合適啟動子連接的本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)錄因子基因的DNA序列。試驗表明本發(fā)明克隆的基因在增加植物耐逆境能力方面具有良好應(yīng)用前景。
文檔編號A01H1/00GK101348790SQ200810047788
公開日2009年1月21日 申請日期2008年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月21日
發(fā)明者勇 向, 熊立仲 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)