專利名稱：一種適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脫毒藍(lán)莓高效快繁技術(shù)，具體涉及一種適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)。
背景技術(shù)：
藍(lán)莓屬杜鵑花科越橘屬(Vaccinum)，為多年生落葉或者常綠小果類灌木型果樹。藍(lán)莓果實富含花青素、不飽和脂肪酸、鞣花酸及鈣、鉀、鋅、鐵等元素，B族維生素在藍(lán)漿果中含量尤為突出，具有很高的保健功能，被國際糧農(nóng)組織列為五大健康食品之一，堪稱世界水果之王，是近幾年來發(fā)展最迅速的集營養(yǎng)與保健于一身的第3代果樹品種。 兔眼藍(lán)莓(Vaccinium ashei Reade)是越桔屬中經(jīng)濟價值較高的一種，品質(zhì)佳，口感好，其生態(tài)適應(yīng)性、生長勢和抗病蟲性較強，無論高地還是低地、粘土或沙土上均能生長，非常適合我國南方栽培。隨著引種規(guī)模日益擴大，優(yōu)良種苗需求量急劇增加，種苗生產(chǎn)供不應(yīng)求。因此，研究一種新型的脫毒適宜兔眼藍(lán)莓高效快繁技術(shù)已為亟待解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提出一種適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)，組織培養(yǎng)憑借其無性繁殖的獨特優(yōu)勢，可以迅速去除病毒和更新品種，保留品種的本來特性，變異性小，并且可在較小空間內(nèi)和較短時間內(nèi)快速地獲得大量無性系脫毒組培苗，成為藍(lán)莓脫毒和快速繁殖的主要途徑，本發(fā)明就兔眼藍(lán)莓建立了一種脫毒高速快繁的有效方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)，其特征在于，采用外植體材料為當(dāng)年生幼嫩枝，通過以下步驟獲得脫毒試管苗a、嫩枝摘除葉片，清洗嫩枝，嫩枝切段形成單芽莖段，然后放置在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，完成無菌苗的獲得步驟，b、待單芽莖段葉芽伸長后，切下葉芽轉(zhuǎn)接在改良培養(yǎng)基中，完成叢生芽的誘導(dǎo)與增殖步驟，C、取無菌苗植株上碧綠的葉片，按照不同的葉片切法、不同的培養(yǎng)方式、不同濃度的ZT篩選最合適的葉片，培養(yǎng)在改良培養(yǎng)基中，完成葉片再生體系的建立步驟，d、剪取苗的單芽莖段，在改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從不同鹽濃度、不同活性碳濃度、不同IBA濃度的培養(yǎng)基中篩選出最適宜生根培養(yǎng)基，完成試管苗生根培養(yǎng)步驟，e、在煉苗基質(zhì)中培養(yǎng)，煉苗時打開培養(yǎng)瓶的瓶蓋進行培養(yǎng)環(huán)境的過渡，在濕度100%的室內(nèi)環(huán)境下培養(yǎng)，然后過渡到濕度80%、透光度70%的室外條件下，然后再逐步通風(fēng)換氣環(huán)境下培養(yǎng)，統(tǒng)計成活率，完成煉苗步驟；幼嫩枝采用以下步驟進行優(yōu)化改良f、將獲得的無菌苗轉(zhuǎn)接到不同的增值培養(yǎng)基上進行比較，叢生芽生長速度慢，從增殖率、叢生芽長勢、玉米素成本方面進行綜合考慮，得到最佳的改良培養(yǎng)基，以完成叢生芽的誘導(dǎo)與增殖的改良，g、進行葉片不同部位對重生苗誘導(dǎo)的影響測試，按垂直葉片主脈方向?qū)⑷~片切成二部分，葉片背面朝下接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，統(tǒng)計重生率，進行不同暗培養(yǎng)時間對葉片重生苗誘導(dǎo)的影響測試，隨著暗培養(yǎng)時間的延長，重生苗誘導(dǎo)頻率呈增高趨勢，不經(jīng)暗培養(yǎng)直接在光照培養(yǎng)條件下或暗培養(yǎng)條件下的重生率，進行ZT濃度對誘導(dǎo)葉片重生苗的影響測試，測試不同濃度的ZT對葉片重生苗的誘導(dǎo)作用，以完成葉片再生體系的建立的改良，h、進行鹽濃度對生根的影響測試，進行單個芽苗在不同鹽濃度的生根培養(yǎng)基中的生根誘導(dǎo)率存在差異比對，進行活性碳和生長素對生根的影響測試，活性碳對組培苗瓶內(nèi)生根具有重要影響，當(dāng)培養(yǎng)基中無活性碳時，插入培養(yǎng)基中的莖基部均先長愈傷組織然后生根，由于莖根之間維管束不通，不久莖即停止生長，葉色發(fā)紅脫落，苗長勢差，活性碳對杰兔生根具有促進作用，以完成試管苗的瓶內(nèi)生根改良，i、剪取2cm左右長的無菌苗新梢在生根培養(yǎng)基中生長，約45d左右苗高長至5-6cm時，生根率達95%，對生根苗移栽在5種不同基質(zhì)上，統(tǒng)計成活率，以完成煉苗基質(zhì)的優(yōu)化。優(yōu)選方法，步驟無菌苗的獲得是以田間生長的當(dāng)年生嫩枝為初始外植體，摘除葉片，用洗衣粉水溶液洗凈灰塵等污物后，經(jīng)自來水沖洗，轉(zhuǎn)到超凈工作臺上，先后用75%酒精和0.1 %升汞對外植體分別進行50s與10min的表面滅菌，接著用無菌水沖洗4次，每次約2min，最后用無菌濾紙吸去外植體表面水分，將枝條切成l_2cm長的單芽莖段，WPM培養(yǎng)基具體改良方法以Ca (NO3) 2 · 4H20、KNO3代替原WPM培養(yǎng)基中的K2S04、CaCl2,在無菌條件下將單芽莖段接種于改良WPM、1. 0mg/LZT、20g/L蔗糖和9g/L日產(chǎn)瓊脂粉的培養(yǎng)基(pH =5. 2)上誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)，培養(yǎng)條件為溫度25±2°C、光強2500Lx、經(jīng)過光周期16h光照和8h黑暗的光周期，30d后莖段葉芽伸長約4-6cm，葉片數(shù)量達7-9枚。優(yōu)選方法，步驟叢生芽的誘導(dǎo)與增殖是待莖段葉芽伸長后，切下轉(zhuǎn)接于以改良WPM為基本培養(yǎng)基，加蔗糖20g/L，日產(chǎn)瓊脂粉8. 8g/L，附加不同濃度的ZT和/或6_BA，pH值為5. 2的增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為溫度25±2°C、光強2500Lx、經(jīng)過光周期16h光照和8h黑暗的光周期。6-節(jié)氨基腺嘌呤(6-BA,英文通用名6-Benzylaminopurine)細(xì)胞分裂素，可抑制植物葉內(nèi)葉綠素、核酸、蛋白質(zhì)的分解；保綠防老將氨基酸、生長素、無機鹽等向處理部位調(diào)運。優(yōu)選方法，步驟葉片再生體系的建立是以改良WPS、1. 0mg/LZT、20g/L蔗糖和9g/L瓊脂粉pH = 5. 2為培養(yǎng)基，取無菌苗植株上碧綠的葉片，按不同的葉片切法、不同培養(yǎng)方式、不同濃度的ZT，篩選最合適的葉片再生體系，背面朝下，葉尖與葉柄分開放置，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶10片左右，每個處理組重復(fù)8-10瓶，葉片切法包括4種不同的葉片切法，4種不同的葉片切法為垂直葉片主脈切取葉片的1/2、1/3、2/3以及全葉；培養(yǎng)方式為暗培養(yǎng)時間分別為0d、7d、20d和30d，每個處理重復(fù)15-20次，暗培養(yǎng)溫度為25 ±2°C，幾種濃度ZT為0. 5,0. 8、I. I、I. 4、I. 7或2. 0，30d后觀察記錄葉片的出芽率與生長狀況，計算誘導(dǎo)重生苗率=誘導(dǎo)重生苗形成的葉片數(shù)/接種葉片數(shù)，從而獲得最佳的葉片再生體系，培養(yǎng)條件為溫度25±2°C、光強2500Lx、經(jīng)過光周期16h光照和8h黑暗的光周期。優(yōu)選方法，步驟試管苗生根培養(yǎng)為剪取苗高約2. Ocm左右的單芽莖段，改良WPS為基本培養(yǎng)基，另添加蔗糖20g/L，瓊脂9g/L，pH值5. 3左右，從不同鹽濃度(WPS、1/2WPS、1/4WPS、1/8WPS)、不同活性炭濃度(0%,0. 05%,O. 10%,O. 15%、0. 20% )、不同 IBA 濃度(O. Img/L、0. 2mg/L、0. 4mg/L、0. 6mg/L、0. 8mg/L)的培養(yǎng)基中篩選出最適宜的生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度25±2°C、光強2500Lx、光周期16h光照/8h黑暗，煉苗時，提前3d打開瓶蓋進行過渡，移栽后在組培室條件下保持濕度100%的塑料棚中培養(yǎng)20d，然后在濕度80 %、透光度70 %的室外條件下過渡7d再逐步通風(fēng)換氣，15d后，完全揭去棚膜，2周后統(tǒng)計成活率，煉苗時，每套基質(zhì)的栽植量不少于50株,各試驗的重復(fù)次數(shù)不少于3次。幾種煉苗基質(zhì)為草炭河沙=I : I ;草炭田土 = I : I ;草炭石英砂=2 3 : I ;草炭珍珠巖=I 2 : I ;全部采用水苔蘚。卩引哚丁酸(IBA, Indole-3-Butytric acid)促進植物主根生長，提高發(fā)芽率，成活率。用于促使插條生根。優(yōu)選方法，步驟叢生芽的誘導(dǎo)與增殖是將獲得的無菌苗轉(zhuǎn)接到幾種增殖培養(yǎng)基上進行比較，在WPM和ZT中，不定芽的發(fā)生率與培養(yǎng)基中的ZT有密切的關(guān)系，當(dāng)ZT質(zhì)量濃度為lmg/L時，IOd左右在莖基部開始出現(xiàn)叢生芽，20d后增殖率超過6倍，經(jīng)幾次繼代后，增殖率高達40-50倍，叢生芽粗壯，生長勢頭好，呈鮮嫩狀；當(dāng)ZT質(zhì)量濃度升高到2mg/L時，開始生長和分化的時間與lmg/L時相差不大，其增殖率稍有所增加；當(dāng)ZT質(zhì)量濃度高于2mg/L時，再生苗開始生長和分化現(xiàn)象提前，多數(shù)分化出來的新梢枝上出現(xiàn)2次枝，增殖率超過12倍，苗長勢較弱且同時出現(xiàn)玻璃化苗現(xiàn)象，WPM與其它激素組合效果均差于WPM和 ZT組合，使用6-BA時，O. 5mg/L和lmg/L 2種質(zhì)量濃度差異不大，它們均會在2周后出現(xiàn)生長和萌芽態(tài)勢，增殖率為4 5倍，其叢生芽生長緩慢，葉小且發(fā)紅，而對于6-BA和ZT組合來講，IOd后出現(xiàn)少量愈傷，增殖率為6 8倍，叢生芽生長速度慢，從增殖率、叢生芽長勢、玉米素成本方面進行綜合考慮，繼代培養(yǎng)基以改良WPM和lmg/L ZT為最佳。優(yōu)選方法，葉片不同部位對重生苗誘導(dǎo)的影響，離葉尖1/3、1/2、2/3或全葉，按垂直葉片主脈方向?qū)⑷~片切成二部分，葉片背面朝下接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，30天后統(tǒng)計葉片重生率；不同暗培養(yǎng)時間對葉片重生苗誘導(dǎo)的影響，在建立植物再生體系的研究中，暗培養(yǎng)是某些植物外植體重生苗的重要影響因素，不同暗培養(yǎng)時間對葉片重生苗誘導(dǎo)的影響，隨著暗培養(yǎng)時間的延長，重生苗誘導(dǎo)頻率呈增高趨勢，不經(jīng)暗培養(yǎng)直接在光照條件下的葉片重生率僅為29. 3%，暗培養(yǎng)20d后的葉片重生率高達93. 2%。當(dāng)暗培養(yǎng)時間超過30天后，雖然葉片重生率超過90%，由于葉片重生苗在暗培養(yǎng)時形成白化畸形苗，其有效苗數(shù)反而減少，20天的暗培養(yǎng)時間最為適宜；ZT濃度對誘導(dǎo)葉片重生苗的影響，ZT是一種高活力的細(xì)胞分裂素，具有打破植株頂端優(yōu)勢、促進腋芽萌發(fā)、誘導(dǎo)不定芽形成的作用，將離葉尖1/3處按垂直葉片主脈方向?qū)⑷~片切成葉尖端和葉柄端二部分，研究不同濃度的ZT對葉片重生苗的誘導(dǎo)作用，O. 5-2. Omg/L ZT均能誘導(dǎo)葉片不經(jīng)愈傷組織直接出芽，植株的變異性減少，不同濃度的ZT對葉片重生苗誘導(dǎo)的效果存在明顯差異；0. 5mg/L ZT對葉片重生苗的誘導(dǎo)率低，尚不足50%，葉片的葉尖端主要誘導(dǎo)簇生苗，葉柄端主要誘導(dǎo)單生苗；隨著ZT濃度的升高，葉片重生苗的誘導(dǎo)率增加；在I. 7mg/L ZT時達到最高，葉片的葉尖端與葉柄端的重生苗誘導(dǎo)率分別達到93. 8%和79. 5%，且主要為簇生苗，在2. Omg/L ZT時均有所下降，誘導(dǎo)葉片形成重生苗的最佳ZT質(zhì)量濃度為I. 7mg/L。優(yōu)選方法，鹽濃度對生根的影響，單個芽苗在不同鹽濃度的生根培養(yǎng)基中的生根誘導(dǎo)率存在差異，高鹽濃度不利于芽苗生根，大量元素不減少時僅在莖切段形成愈傷組織；大量元素減半時，在20天左右開始生根，生根率達40% ;大量元素減少到原來的1/4時，開始生根的時間為10天左右，生根率提高到90%以上，苗長勢強，葉色綠；而大量元素減少到原來的1/8時，第8天左右就開始生根，生根率也達到了 90%以上，由于營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，苗長勢弱，葉色黃且無光澤。因此適當(dāng)降低鹽濃度有利于生根且不影響苗的生長；活性碳和生長素對生根的影響，活性碳對組培苗瓶內(nèi)生根具有重要影響，當(dāng)培養(yǎng)基中無活性碳時，插入培養(yǎng)基中的莖基部均先長愈傷組織然后生根，由于莖根之間維管束不通，不久莖即停止生長，葉色發(fā)紅脫落，苗長勢差?；钚蕴繉芡蒙哂写龠M作用，但是存在不同的濃度效應(yīng)效果最好的是O. I %活性碳，在O. 1-0. 8mg/L IBA的有效生根率均達到80%以上，特別是在O. lmg/LIBA時生根率達到了 90%以上，莖基部產(chǎn)生愈傷組織較少或不產(chǎn)生愈傷組織，莖生長正常，IOd左右可見莖基部有根形成，45d左右長出4-6條根，根長達6cm左右；效果其次的是O. 15%活性碳，在O. lmg/L IBA時其有效生根率也達到了 80%以上；當(dāng)培養(yǎng)基中的活性碳為O. 2%時，有效生根率明顯降低，有效根數(shù)和根長也減少；培養(yǎng)瓶內(nèi)生根培養(yǎng)基中最佳的活性炭濃度和IBA濃度分別為O. 1%和O. lmg/L， 有效生根率高達95%。優(yōu)選方法，步驟煉苗基質(zhì)的優(yōu)化是剪取2cm左右長的無菌苗新梢在生根培養(yǎng)基中生長，45d左右苗高長至5-6cm時，生根率達95%，對生根苗移栽在5種不同基質(zhì)上，I. 5個月后統(tǒng)計成活率。結(jié)果表明，水苔蘚的效果最好，成活率高達100%，苗木的生長量達3cm以上，新增葉片6-8枚。效果其次的是2 3 I的草炭與石英砂組合，其成活率為86%，苗木的生長量較高。I : I的草炭與河沙基質(zhì)的成活率僅為52%，但成活苗的質(zhì)量卻很高，表現(xiàn)為生長墩實、植株健壯、生長量與“草炭+石英砂”相當(dāng)。草炭+園土基質(zhì)與草炭+珍珠巖基質(zhì)的效果居中。本發(fā)明的有益技術(shù)效果是本方法從葉片再生、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)到煉苗這幾個環(huán)節(jié)進行了一系列的優(yōu)化，建立了一套可高效、快速、持續(xù)獲得優(yōu)良的脫毒兔眼組培種苗的技術(shù)體系，有助與我國藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。


圖I是本發(fā)明實施例適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)的不同增值培養(yǎng)基上莖段的增值率的柱形圖。圖2是本發(fā)明實施例適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)的不同煉苗基質(zhì)對試管苗成活率的影響的柱形圖。本發(fā)明目的實現(xiàn)、功能特點及優(yōu)點將結(jié)合實施例，參照附圖做進一步說明。
具體實施例方式應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。具體實施的一種適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)，其特征在于，采用外植體材料為當(dāng)年生幼嫩枝，通過以下步驟快速獲得脫毒試管苗a、嫩枝摘除葉片，清洗嫩枝，嫩枝切段形成單芽莖段，然后放置在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，完成無菌苗的獲得步驟，b、待單芽莖段葉芽伸長后，切下葉芽轉(zhuǎn)接在改良培養(yǎng)基中，完成叢生芽的誘導(dǎo)與增殖步驟，C、取無菌苗植株上碧綠的葉片，按照不同的葉片切法、不同的培養(yǎng)方式、不同濃度的ZT篩選最合適的葉片，培養(yǎng)在改良培養(yǎng)基中，完成葉片再生體系的建立步驟，d、剪取苗的單芽莖段，在改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從不同鹽濃度、不同活性炭濃度、不同IBA濃度的培養(yǎng)基中篩選出最適宜生根培養(yǎng)基，完成試管苗生根培養(yǎng)步驟，e、在煉苗基質(zhì)中培養(yǎng)，煉苗時打開培養(yǎng)瓶的瓶蓋進行培養(yǎng)環(huán)境的過渡，在濕度100%的室內(nèi)環(huán)境下培養(yǎng)，然后過渡到濕度80%、透光度70%的室外條件下，然后再逐步通風(fēng)換氣環(huán)境下培養(yǎng)，統(tǒng)計成活率，完成煉苗步驟；幼嫩枝采用以下步驟進行優(yōu)化改良f、將獲得的無菌苗轉(zhuǎn)接到不同的增值培養(yǎng)基上進行比較，叢生芽生長速度慢，從增殖率、叢生芽長勢、玉米素成本方面進行綜合考慮，得到最佳的改良培養(yǎng)基，以完成叢生芽的誘導(dǎo)與增殖的改良，g、進行葉片不同部位對重生苗誘導(dǎo)的影響測試，按垂直葉片主脈方向?qū)⑷~片切成二部分，葉片背面朝下接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，統(tǒng)計重生率，進行不同暗培養(yǎng)時間對葉片重生苗誘導(dǎo)的影響測試，隨著暗培養(yǎng)時間的延長，重生苗誘導(dǎo)頻率呈增高趨勢，不經(jīng)暗培養(yǎng)直接在光照培養(yǎng)條件下或暗培養(yǎng)條件下的重生率，進行ZT濃度對誘導(dǎo)葉片重生苗的影響測試，測試不同濃度的ZT對葉片重生苗的誘導(dǎo)作用，以完成葉片再生體系的建立的改良，h、進行鹽濃度對生根的影響測試，進行單個芽苗在不同鹽濃度的生根培養(yǎng)基中的生根誘導(dǎo)率存在差異比對，進行活性碳和生長素對生根的影響測試，活性碳對組培苗瓶內(nèi)生根具有重要影響，當(dāng)培養(yǎng)基中無活性碳時，插入培養(yǎng)基中的莖基部均先長愈傷組織然后生根，由于莖根之間維管束不通，不久莖即停止生長，葉色發(fā)紅脫落，苗長勢差，活性炭對杰兔生根具有促進作用，以完成試管苗的瓶內(nèi)生根改良，i、剪取2cm左右長的無菌苗新梢在生根培養(yǎng)基中生長，約45d左右苗高長至5-6cm時，生根率達95%，對生根苗移栽在5種不同基質(zhì)上，統(tǒng)計成活率，以完成煉苗基質(zhì)的優(yōu)化。 本發(fā)明還在于，步驟無菌苗的獲得是以田間生長的當(dāng)年生嫩枝為初始外植體，摘除葉片，用洗衣粉水溶液洗凈灰塵等污物后，經(jīng)自來水沖洗，轉(zhuǎn)到超凈工作臺上，先后用75%酒精和O. I %升汞對外植體分別進行50s與IOmin的表面滅菌，接著用無菌水沖洗4次，每次約2min，最后用無菌濾紙吸去外植體表面水分，將枝條切成l_2cm長的單芽莖段，WPM培養(yǎng)基具體改良方法以Ca (NO3) 2 · 4H20、KNO3代替原WPM培養(yǎng)基中的K2S04、CaCl2，在無菌條件下將單芽莖段接種于改良WPM、I. Omg/L ZT、20g/L蔗糖和9g/L日產(chǎn)瓊脂粉的培養(yǎng)基(pH = 5. 2)上誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)，培養(yǎng)條件為溫度25±2°C、光強2500Lx、經(jīng)過光周期16h光照和8h黑暗的光周期，30d后莖段葉芽伸長約4-6cm，葉片數(shù)量達7-9枚。本發(fā)明還在于，步驟叢生芽的誘導(dǎo)與增殖是待莖段葉芽伸長后，切下轉(zhuǎn)接于以改良WPM為基本培養(yǎng)基，加蔗糖20g/L，日產(chǎn)瓊脂粉8. 8g/L，附加不同濃度的ZT和/或6-BA的增殖培養(yǎng)基(pH = 5. 2)中，培養(yǎng)條件為溫度25±2°C、光強2500Lx、經(jīng)過光周期16h光照和8h黑暗的光周期。本發(fā)明還在于，步驟葉片再生體系的建立是以改良WPS、1.0mg/LZT、20g/L蔗糖和9g/L瓊脂粉為培養(yǎng)基(pH = 5. 2)，取無菌苗植株上碧綠的葉片，按不同的葉片切法、不同培養(yǎng)方式、不同濃度的ZT，篩選最合適的葉片再生體系，背面朝下，葉尖與葉柄分開放置，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶10片左右，每個處理組重復(fù)8-10瓶，葉片切法包括4種不同的葉片切法，4種不同的葉片切法為垂直葉片主脈切取葉片的1/2、1/3、2/3以及全葉；培養(yǎng)方式為暗培養(yǎng)時間分別為0d、7d、20d和30d，每個處理重復(fù)15-20次，暗培養(yǎng)溫度為25±2°C，幾種濃度ZT為O. 5、0. 8、I. I、I. 4、I. 7或2. 0，30d后觀察記錄葉片的出芽率與生長狀況，計算誘導(dǎo)重生苗率=誘導(dǎo)重生苗形成的葉片數(shù)/接種葉片數(shù)，從而獲得最佳的葉片再生體系，培養(yǎng)條件為溫度25±2°C、光強2500Lx、經(jīng)過光周期16h光照和8h黑暗的光周期。本發(fā)明還在于，步驟試管苗生根培養(yǎng)為剪取苗高約2. Ocm左右的單芽莖段，改良WPS為基本培養(yǎng)基，另添加蔗糖20g/L、瓊脂9g/L(pH = 5. 3)，從不同鹽濃度、不同活性碳濃度、不同IBA濃度的培養(yǎng)基中篩選出最適宜的生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度25±2°C、光強2500Lx、光周期16h光照/8h黑暗，煉苗時，提前3d打開瓶蓋進行過渡，移栽后在組培室條件下保持濕度100%的塑料棚中培養(yǎng)20d，然后在濕度80%、透光度70%的室外條件下過渡7d再逐步通風(fēng)換氣，15d后，完全揭去棚膜，2周后統(tǒng)計成活率，煉苗時，每套基質(zhì)的栽植量不少于50株，各試驗的重復(fù)次數(shù)不少于3次。本發(fā)明還在于,煉苗基質(zhì)選擇草炭河沙=I I ;或者草炭田土 = I : I ;或者草炭石英砂=2 3 : I ;或者草炭珍珠巖=I 2 : I ;或者全部采用水苔蘚。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水苔蘚的效果最好，成活率高達100 %，苗木的生長量達3cm以上，新增葉片6-8枚。效果其次的是2 3 I的草炭與石英砂組合，其成活率為86%，苗木的生長量較高。I I的草炭與河沙基質(zhì)的成活率僅為52%，但成活苗的質(zhì)量卻很高，表現(xiàn)為生長墩實、植株健壯、生長量與“草炭+石英砂”相當(dāng)。草炭+園土基質(zhì)與草炭+珍珠巖基質(zhì)的效果居中
本發(fā)明還在于，步驟叢生芽的誘導(dǎo)與增殖是將獲得的無菌苗轉(zhuǎn)接到幾種增殖培養(yǎng)基上進行比較，在WPM和ZT中，不定芽的發(fā)生率與培養(yǎng)基中的ZT有密切的關(guān)系，當(dāng)ZT質(zhì)量濃度為lmg/L時，IOd左右在莖基部開始出現(xiàn)叢生芽，20d后增殖率超過6倍，經(jīng)幾次繼代后，增殖率高達40-50倍，叢生芽粗壯，生長勢頭好，呈鮮嫩狀；當(dāng)ZT質(zhì)量濃度升高到2mg/L時，開始生長和分化的時間與lmg/L時相差不大，其增殖率稍有所增加；當(dāng)ZT質(zhì)量濃度高于2mg/L時，再生苗開始生長和分化現(xiàn)象提前，多數(shù)分化出來的新梢枝上出現(xiàn)2次枝，增殖率超過12倍，苗長勢較弱且同時出現(xiàn)玻璃化苗現(xiàn)象，WPM與其它激素組合效果均差于WPM和ZT組合，使用6-BA時，O. 5mg/L和lmg/L 2種質(zhì)量濃度差異不大，它們均會在2周后出現(xiàn)生長和萌芽態(tài)勢，增殖率為4 5倍，其叢生芽生長緩慢，葉小且發(fā)紅，而對于6-BA和ZT組合來講，IOd后出現(xiàn)少量愈傷，增殖率為6 8倍，叢生芽生長速度慢，從增殖率、叢生芽長勢、玉米素成本方面進行綜合考慮，繼代培養(yǎng)基以改良WPM和lmg/L ZT為最佳。本發(fā)明還在于，葉片不同部位對重生苗誘導(dǎo)的影響，離葉尖1/3、1/2、2/3或全葉，按垂直葉片主脈方向?qū)⑷~片切成二部分，葉片背面朝下接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，30d后統(tǒng)計葉片重生率；不同暗培養(yǎng)時間對葉片重生苗誘導(dǎo)的影響，在建立植物再生體系的研究中，暗培養(yǎng)是某些植物外植體重生苗的重要影響因素，不同暗培養(yǎng)時間對葉片重生苗誘導(dǎo)的影響，隨著暗培養(yǎng)時間的延長，重生苗誘導(dǎo)頻率呈增高趨勢，不經(jīng)暗培養(yǎng)直接在光照條件下的葉片重生率僅為29. 3%，暗培養(yǎng)20d后的葉片重生率高達93. 2%。當(dāng)暗培養(yǎng)時間超過30d后，雖然葉片重生率超過90%，由于葉片重生苗在暗培養(yǎng)時形成白化畸形苗，其有效苗數(shù)反而減少，20d的暗培養(yǎng)時間最為適宜；ZT濃度對誘導(dǎo)葉片重生苗的影響，ZT是一種高活力的細(xì)胞分裂素，具有打破植株頂端優(yōu)勢、促進腋芽萌發(fā)、誘導(dǎo)不定芽形成的作用，將離葉尖1/3處按垂直葉片主脈方向?qū)⑷~片切成葉尖端和葉柄端二部分，研究不同濃度的ZT對葉片重生苗的誘導(dǎo)作用，O. 5-2. Omg/L ZT均能誘導(dǎo)葉片不經(jīng)愈傷組織直接出芽，植株的變異性減少，不同濃度的ZT對葉片重生苗誘導(dǎo)的效果存在明顯差異；0. 5mg/L ZT對葉片重生苗的誘導(dǎo)率低，尚不足50%，葉片的葉尖端主要誘導(dǎo)簇生苗，葉柄端主要誘導(dǎo)單生苗；隨著ZT濃度的升高，葉片重生苗的誘導(dǎo)率增加；在I. 7mg/L ZT時達到最高，葉片的葉尖端與葉柄端的重生苗誘導(dǎo)率分別達到93. 8%和79. 5%，且主要為簇生苗，在2. Omg/L ZT時均有所下降，誘導(dǎo)葉片形成重生苗的最佳ZT質(zhì)量濃度為I. 7mg/L。本發(fā)明還在于，鹽濃度對生根的影響，單個芽苗在不同鹽濃度的生根培養(yǎng)基中的生根誘導(dǎo)率存在差異，高鹽濃度不利于芽苗生根，大量元素不減少時僅在莖切段形成愈傷組織；大量元素減半時，在20d左右開始生根,生根率達40% ;大量元素減少到原來的1/4時，開始生根的時間為IOd左右，生根率提高到90%以上，苗長勢強，葉色綠；而大量元素減少到原來的1/8時，第8天左右就開始生根，生根率也達到了 90%以上，由于營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，苗長勢弱，葉色黃且無光澤。因此適當(dāng)降低鹽濃度有利于生根且不影響苗的生長；活性碳和生長素對生根的影響，活性碳對組培苗瓶內(nèi)生根具有重要影響，當(dāng)培養(yǎng)基中無活性碳時，插入培養(yǎng)基中的莖基部均先長愈傷組織然后生根，由于莖根之間維管束不通，不久莖即停止生長，葉色發(fā)紅脫落，苗長勢差。活性炭對杰兔生根具有促進作用，但是存在不同的濃度效應(yīng)效果最好的是O. I %活性碳，在O. 1-0. 8mg/L IBA的有效生根率均達到80%以上，特別是在O. lmg/LIBA時生根率達到了 90%以上，莖基部產(chǎn)生愈傷組織較少或不產(chǎn)生愈傷組織，莖生長正常，IOd左右可見莖基部有根形成，45d左右長出4-6條根，根長達6cm左右；效果其次的是O. 15%活性碳，在O. lmg/L IBA時其有效生根率也達到了 80%以上；當(dāng)培養(yǎng)基中的活性碳為O. 2%時，有效生根率明顯降低，有效根數(shù)和根長也減少；培養(yǎng)瓶內(nèi)生根培 養(yǎng)基中最佳的活性炭濃度和IBA濃度分別為O. 1%和O. lmg/L，有效生根率高達95%。本發(fā)明還在于，步驟煉苗基質(zhì)的優(yōu)化是剪取2cm左右長的無菌苗新梢在生根培養(yǎng)基中生長，45d左右苗高長至5-6cm時，生根率達95 %，對生根苗移栽在5種不同基質(zhì)上，
I.5個月后統(tǒng)計成活率。具體實施時I材料與方法I. I 材料植物材料為智博生物科技公司種植園種植的兔眼藍(lán)莓品種-杰兔。外植體材料為當(dāng)年生幼嫩枝。I. 2 方法I. 2. I無菌苗的獲得以田間生長的當(dāng)年生嫩枝為初始外植體，摘除葉片。用洗衣粉水溶液洗凈灰塵等污物后，自來水沖洗。轉(zhuǎn)到超凈工作臺上，先后用75%酒精和O. 1%升汞對外植體分別進行50s與IOmin的表面滅菌,接著用無菌水沖洗4次(每次約2分鐘)，最后用無菌濾紙吸去外植體表面水分。將枝條切成l_2cm長的單芽莖段，在無菌條件下將單芽莖段接種于WPM(改良)+1. Omg/L ZT+20g/L蔗糖+9g/L日產(chǎn)瓊脂粉的培養(yǎng)基(pH = 5. 2)上誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)。培養(yǎng)條件為溫度25±2°C、光強2500Lx、光周期16h光照/8h黑暗。30d后莖段葉芽伸長約4-6cm,葉片數(shù)量達7-9枚。WPM培養(yǎng)基具體改良方法以Ca (N03) 24H20、KN03代替原WPM培養(yǎng)基中的K2S04、CaC12。I. 2. 2叢生芽的誘導(dǎo)與增殖待莖段葉芽伸長后，切下轉(zhuǎn)接于以改良WPM為基本培養(yǎng)基，加蔗糖20g/L，日產(chǎn)瓊脂粉8. 8g/L，附加不同濃度的ZT和/或6-BA的增殖培養(yǎng)基(pH = 5. 2)中，具體是O. 5mg/L ZT,I. Omg/L ZT,2. Omg/L ZT,5. Omg/L ZT,0. 5mg/L 6-BA,I. Omg/L 6-BA,0. 5mg/L6-BA+1. Omg/L ZT, I. 0mg/L6-BA+l. Omg/L ZT。培養(yǎng)條件同上。I. 2· 3葉片再生體系的建立以改良WPS+1. 0mg/LZT+20g/L蔗糖+9g/L瓊脂粉為培養(yǎng)基(pH = 5. 2)，取無菌苗植株上碧綠的葉片，按不同的葉片切法、不同培養(yǎng)方式、不同濃度的ZT，篩選最合適的葉片再生體系。4種不同的葉片切法垂直葉片主脈切取葉片的1/2、1/3、2/3以及全葉，背面朝下，葉尖與葉柄分開放置，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶10片左右，每個處理組重復(fù)8-10瓶。不同培養(yǎng)方式暗培養(yǎng)時間分別為0d、7d、20d、30d，每個處理重復(fù)15-20(暗培養(yǎng)溫度為25±2°C)。幾種濃度ZT :0. 5、0. 8、1. 1、1.4、1.7、2. O。30d后觀察記錄葉片的出芽率與生長狀況，計算誘導(dǎo)重生苗率=誘導(dǎo)重生苗形成的葉片數(shù)/接種葉片數(shù)，從而獲得最佳的葉片再生體系。培養(yǎng)條件同上。I. 2. 4試管苗生根培養(yǎng)剪取苗高約2. Ocm左右的單芽莖段，改良WPS為基本培養(yǎng)基，另添加蔗糖20g/L，瓊脂 9g/L(pH = 5. 3)。從不同鹽濃度(WPS、1/2WPS、1/4WPS、1/8WPS)、不同活性炭濃度(0%,O. 05%,O. 10%,O. 15 %、0· 20 % )、不同 IBA 濃·度(O. Img/L、0. 2mg/L、0. 4mg/L、0. 6mg/L、0. 8mg/L)的培養(yǎng)基中篩選出最適宜的生根培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件同上。I. 2. 5 煉苗煉苗時，提前3d打開瓶蓋進行過渡。移栽后在組培室條件下保持濕度100%的塑料棚中培養(yǎng)20d，然后在濕度80 %、透光度70 %的室外條件下過渡7d再逐步通風(fēng)換氣。15d后，完全揭去棚膜。2周后統(tǒng)計成活率。煉苗時，每套基質(zhì)的栽植量不少于50株。各試驗的重復(fù)次數(shù)不少于3次。幾種煉苗基質(zhì)為草炭河沙=I I ;草炭田土 = I : I ;草炭石英砂=2 3 : I ;草炭珍珠巖=I 2 : I ;全部采用水苔蘚。2.結(jié)果與分析2. I叢生芽的誘導(dǎo)與增殖將獲得的無菌苗轉(zhuǎn)接到幾種增殖培養(yǎng)基上進行比較。圖I是本發(fā)明實施例適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)的不同增值培養(yǎng)基上莖段的增值率的柱形圖，圖I的結(jié)果表明，改良WPM+ZT的增殖效果明顯優(yōu)于改良WPM+6-BA和改良WPM+6-BA+ZT的組合。在WPM+ZT中，不定芽的發(fā)生率與培養(yǎng)基中的ZT有密切的關(guān)系。當(dāng)ZT質(zhì)量濃度為lmg/L時，IOd左右在莖基部開始出現(xiàn)叢生芽，20d后增殖率超過6倍，經(jīng)幾次繼代后，增殖率高達40-50倍，叢生芽粗壯，生長勢頭好，呈鮮嫩狀。當(dāng)ZT質(zhì)量濃度升高到2mg/L時，開始生長和分化的時間與lmg/L時相差不大，其增殖率稍有所增加。當(dāng)ZT質(zhì)量濃度高于2mg/L時，再生苗開始生長和分化現(xiàn)象提前，多數(shù)分化出來的新梢枝上出現(xiàn)2次枝，增殖率超過12倍，苗長勢較弱且同時出現(xiàn)玻璃化苗現(xiàn)象。WPM與其它激素組合效果均差于WPM+ZT組合。使用6-BA時，O. 5mg/L和lmg/L 2種質(zhì)量濃度差異不大，它們均會在2周后出現(xiàn)生長和萌芽態(tài)勢，增殖率為4 5倍，其叢生芽生長緩慢，葉小且發(fā)紅。而對于6-BA+ZT組合來講，IOd后出現(xiàn)少量愈傷，增殖率為6 8倍，叢生芽生長速度慢。因此，從增殖率、叢生芽長勢、玉米素成本等方面進行綜合考慮，繼代培養(yǎng)基以改良WPM+lmg/L ZT為最佳。2. 2葉片再生體系的建立2. 2. I葉片不同部位對重生苗誘導(dǎo)的影響離葉尖1/3、1/2、2/3和全葉，按垂直葉片主脈方向?qū)⑷~片切成二部分，葉片背面朝下接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，30天后統(tǒng)計葉片重生率，結(jié)果見表I。從表I中可以看出，離葉尖1/3處切法的誘導(dǎo)重生苗率最高，達到50%以上，而全葉的誘導(dǎo)重生苗率最低，僅26. 1%。在幾種葉片切法中，葉尖端的重生苗誘導(dǎo)率比葉柄端高。表I葉片不同部位對重生苗誘導(dǎo)的影響
權(quán)利要求
1.一種適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)，其特征在于，采用外植體材料為當(dāng)年生幼嫩枝，通過以下步驟獲得優(yōu)質(zhì)脫毒苗 a、嫩枝摘除葉片，清洗嫩枝，嫩枝切段形成單芽莖段，然后放置在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，完成無菌苗的獲得步驟； b、待單芽莖段葉芽伸長后，切下葉芽轉(zhuǎn)接在改良培養(yǎng)基中，完成叢生芽的誘導(dǎo)與增殖步驟，將獲得的無菌苗轉(zhuǎn)接到不同的增值培養(yǎng)基上進行比較，叢生芽生長速度慢，從增殖率、叢生芽長勢、玉米素成本方面進行綜合考慮，得到最佳的改良培養(yǎng)基，以完成叢生芽的誘導(dǎo)與增殖的改良； C、取無菌苗植株上碧綠的葉片，按照不同的葉片切法、不同的培養(yǎng)方式、不同濃度的ZT篩選最合適的葉片，培養(yǎng)在改良培養(yǎng)基中，完成葉片再生體系的建立步驟，進行葉片不同部位對重生苗誘導(dǎo)的影響測試，按垂直葉片主脈方向?qū)⑷~片切成二部分，葉片背面朝下接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，統(tǒng)計重生率，進行不同暗培養(yǎng)時間對葉片重生苗誘導(dǎo)的影響測試，隨著暗培養(yǎng)時間的延長，重生苗誘導(dǎo)頻率呈增高趨勢，不經(jīng)暗培養(yǎng)直接在光照培養(yǎng)條件下或暗培養(yǎng)條件下的重生率，進行ZT濃度對誘導(dǎo)葉片重生苗的影響測試，測試不同濃度的ZT對葉片重生苗的誘導(dǎo)作用，以完成葉片再生體系的建立的改良； d、剪取苗的單芽莖段，在改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從不同鹽濃度、不同活性炭濃度、不同IBA濃度的培養(yǎng)基中篩選出最適宜生根培養(yǎng)基，完成試管苗生根培養(yǎng)步驟，進行鹽濃度對生根的影響測試，進行單個芽苗在不同鹽濃度的生根培養(yǎng)基中的生根誘導(dǎo)率存在差異比對，進行活性碳和生長素對生根的影響測試，活性碳對組培苗瓶內(nèi)生根具有重要影響，當(dāng)培養(yǎng)基中無活性碳時，插入培養(yǎng)基中的莖基部均先長愈傷組織然后生根，由于莖根之間維管束不通，不久莖即停止生長，葉色發(fā)紅脫落，苗長勢差，活性炭對生根具有促進作用，以完成試管苗的瓶內(nèi)生根改良； e、在煉苗基質(zhì)中培養(yǎng)，煉苗時打開培養(yǎng)瓶的瓶蓋進行培養(yǎng)環(huán)境的過渡，在濕度100%的室內(nèi)環(huán)境下培養(yǎng)，然后過渡到濕度80%、透光度70%的室外條件下，然后再逐步通風(fēng)換氣環(huán)境下培養(yǎng)，統(tǒng)計成活率，完成煉苗步驟，剪取2cm左右長的無菌苗新梢在生根培養(yǎng)基中生長，約45d左右苗高長至5-6cm時，生根率達95%，對生根苗移栽在5種不同基質(zhì)上，統(tǒng)計成活率，以完成煉苗基質(zhì)的優(yōu)化。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)，其特征在于，步驟脫毒組培苗的獲得是以田間生長的當(dāng)年生嫩枝為初始外植體，摘除葉片，用洗衣粉水溶液洗凈灰塵等污物后，經(jīng)自來水沖洗，轉(zhuǎn)到超凈工作臺上，先后用75%酒精和O. 1%升汞對外植體分別進行50s與IOmin的表面滅菌,接著用無菌水沖洗4次,每次約2min,最后用無菌濾紙吸去外植體表面水分，將枝條切成l_2cm長的單芽莖段，WPM培養(yǎng)基具體改良方法以Ca(NO3)2 · 4H 20、KNO3代替原WPM培養(yǎng)基中的K2S04、CaCl2，在無菌條件下將單芽莖段接種于改良WPM、1. Omg/L ZT、20g/L蔗糖和9g/L日產(chǎn)瓊脂粉的培養(yǎng)基(pH = 5. 2)上誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)，培養(yǎng)條件為溫度25±2°C、光強2500Lx、經(jīng)過光周期16h光照和8h黑暗的光周期，30d后莖段葉芽伸長約4-6cm，葉片數(shù)量達7-9枚。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)，其特征在于，步驟叢生芽的誘導(dǎo)與增殖是待莖段葉芽伸長后，切下轉(zhuǎn)接于以改良WPM為基本培養(yǎng)基，加蔗糖20g/L,日產(chǎn)瓊脂粉8. 8g/L，附加不同濃度的ZT和/或6-BA的增殖培養(yǎng)基(pH = 5. 2)中，培養(yǎng)條件為溫度25±2°C、光強2500Lx、經(jīng)過光周期16h光照和8h黑暗的光周期。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)，其特征在于，步驟葉片再生體系的建立是以改良WPS、I. 0mg/LZT、20g/L蔗糖和9g/L瓊脂粉為培養(yǎng)基(pH = 5. 2)，取無菌苗植株上碧綠的葉片，按不同的葉片切法、不同培養(yǎng)方式、不同濃度的ZT，篩選最合適的葉片再生體系，背面朝下，葉尖與葉柄分開放置，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶10片左右，每個處理組重復(fù)8-10瓶，葉片切法包括4種不同的葉片切法，4種不同的葉片切法為垂直葉片主脈切取葉片的1/2、1/3、2/3以及全葉；培養(yǎng)方式為暗培養(yǎng)時間分別為0d、7d、20d和30d，每個處理重復(fù)15-20次，暗培養(yǎng)溫度為25±2°C，ZT的種濃度分別為O. 5、O. 8、I. I、I. 4、I.7或2. 0，30d后觀察記錄葉片的出芽率與生長狀況，計算誘導(dǎo)重生苗率=誘導(dǎo)重生苗形成的葉片數(shù)/接種葉片數(shù)，從而獲得最佳的葉片再生體系，培養(yǎng)條件為溫度25±2°C、光強2500Lx、經(jīng)過光周期16h光照和8h黑暗的光周期。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)，其特征在于，步驟試管 苗生根培養(yǎng)為剪取苗高約2. Ocm左右的單芽莖段，改良WPS為基本培養(yǎng)基，另添加蔗糖20g、瓊脂9g/L(pH = 5. 3)，從不同鹽濃度、不同活性碳濃度、不同IBA濃度的培養(yǎng)基中篩選出最適宜的生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為 溫度25±2°C、光強2500Lx、光周期16h光照/8h黑暗，煉苗時，提前3d打開瓶蓋進行過渡，移栽后在組培室條件下保持濕度100%的塑料棚中培養(yǎng)20d,然后在濕度80 %、透光度70 %的室外條件下過渡7d再逐步通風(fēng)換氣，15d后，完全揭去棚膜，2周后統(tǒng)計成活率，煉苗時，每套基質(zhì)的栽植量不少于50株，各試驗的重復(fù)次數(shù)不少于3次。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)，其特征在于，煉苗基質(zhì)選擇草炭河沙=I : I ;或者草炭田土 = I : I ;或者草炭石英砂=2 3 : I ;或者草炭珍珠巖=I 2 : I ;或者全部采用水苔蘚。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)，其特征在于，步驟叢生芽的誘導(dǎo)與增殖是將獲得的無菌苗轉(zhuǎn)接到幾種增殖培養(yǎng)基上進行比較，在WPM和ZT中，不定芽的發(fā)生率與培養(yǎng)基中的ZT有密切的關(guān)系，當(dāng)ZT質(zhì)量濃度為lmg/L時，IOd左右在莖基部開始出現(xiàn)叢生芽，20d后增殖率超過6倍，經(jīng)幾次繼代后，增殖率高達40-50倍，叢生芽粗壯，生長勢頭好，呈鮮嫩狀；當(dāng)ZT質(zhì)量濃度升高到2mg/L時，開始生長和分化的時間與Img/L時相差不大,其增殖率稍有所增加；當(dāng)ZT質(zhì)量濃度高于2mg/L時，再生苗開始生長和分化現(xiàn)象提前，多數(shù)分化出來的新梢枝上出現(xiàn)2次枝，增殖率超過12倍，苗長勢較弱且同時出現(xiàn)玻璃化苗現(xiàn)象，WPM與其它激素組合效果均差于WPM和ZT組合，使用6-BA時，O. 5mg/L和lmg/L 2種質(zhì)量濃度差異不大，它們均會在2周后出現(xiàn)生長和萌芽態(tài)勢，增殖率為4 5倍，其叢生芽生長緩慢，葉小且發(fā)紅，而對于6-BA和ZT組合來講，IOd后出現(xiàn)少量愈傷，增殖率為6 8倍，叢生芽生長速度慢，從增殖率、叢生芽長勢、玉米素成本方面進行綜合考慮，繼代培養(yǎng)基以改良WPM和lmg/L ZT為最佳。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)，其特征在于，葉片不同部位對重生苗誘導(dǎo)的影響，離葉尖1/3、1/2、2/3或全葉，按垂直葉片主脈方向?qū)⑷~片切成二部分，葉片背面朝下接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，30d后統(tǒng)計葉片重生率；不同暗培養(yǎng)時間對葉片重生苗誘導(dǎo)的影響，在建立植物再生體系的研究中，暗培養(yǎng)是某些植物外植體重生苗的重要影響因素，不同暗培養(yǎng)時間對葉片重生苗誘導(dǎo)的影響，隨著暗培養(yǎng)時間的延長，重生苗誘導(dǎo)頻率呈增高趨勢，不經(jīng)暗培養(yǎng)直接在光照條件下的葉片重生率僅為29. 3%，暗培養(yǎng)20d后的葉片重生率高達93.2%，當(dāng)暗培養(yǎng)時間超過30d后，雖然葉片重生率超過90%，由于葉片重生苗在暗培養(yǎng)時形成白化畸形苗，其有效苗數(shù)反而減少，20d的暗培養(yǎng)時間最為適宜；ZT濃度對誘導(dǎo)葉片重生苗的影響 ，ZT是一種高活力的細(xì)胞分裂素，具有打破植株頂端優(yōu)勢、促進腋芽萌發(fā)、誘導(dǎo)不定芽形成的作用，將離葉尖1/3處按垂直葉片主脈方向?qū)⑷~片切成葉尖端和葉柄端二部分， 研究不同濃度的ZT對葉片重生苗的誘導(dǎo)作用，O. 5-2. Omg/L ZT均能誘導(dǎo)葉片不經(jīng)愈傷組織直接出芽 ，植 株的變異性減少，不同濃度的ZT對葉片重生苗誘導(dǎo)的效果存在明顯差異；0.5mg/L ZT對葉 片重生苗的誘導(dǎo)率低，尚不足50%，葉片的葉尖端主要誘導(dǎo)簇生苗，葉柄端主要誘導(dǎo)單生苗；隨著ZT濃度的升高，葉片重生苗的誘導(dǎo)率增加；在I. 7mg/LZT時達到最高，葉片的葉尖端與葉柄端的重生苗誘導(dǎo)率分別達到93. 8%和·79. 5%，且主要為簇生苗，在2. Omg/L ZT時均有所下降，誘導(dǎo)葉片形成重生苗的最佳ZT質(zhì)量濃度為I. 7mg/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)，其特征在于，鹽濃度對生根的影響，單個芽苗在不同鹽濃度的生根培養(yǎng)基中的生根誘導(dǎo)率存在差異，高鹽濃度不利于芽苗生根，大量元素不減少時僅在莖切段形成愈傷組織；大量元素減半時，在20d左右開始生根，生根率達40%;大量元素減少到原來的1/4時，開始生根的時間為IOd左右，生根率提高到90%以上，苗長勢強，葉色綠；而大量元素減少到原來的1/8時，第8d左右就開始生根，生根率也達到了 90%以上，由于營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，苗長勢弱，葉色黃且無光澤，因此適當(dāng)降低鹽濃度有利于生根且不影響苗的生長；活性碳和生長素對生根的影響，活性碳對組培苗瓶內(nèi)生根具有重要影響，當(dāng)培養(yǎng)基中無活性碳時，插入培養(yǎng)基中的莖基部均先長愈傷組織然后生根，由于莖根之間維管束不通，不久莖即停止生長，葉色發(fā)紅脫落，苗長勢差，活性炭對杰兔生根具有促進作用，但是存在不同的濃度效應(yīng)效果最好的是O. 1%活性碳，在·O.1-0. 8mg/L IBA的有效生根率均達到80%以上，特別是在O. lmg/L IBA時生根率達到了·90 %以上，莖基部產(chǎn)生愈傷組織較少或不產(chǎn)生愈傷組織，莖生長正常，IOd左右可見莖基部有根形成，45d左右長出4-6條根，根長達6cm左右；效果其次的是O. 15%活性碳，在O. Img/L IBA時其有效生根率也達到了 80%以上；當(dāng)培養(yǎng)基中的活性碳為O. 2%時，有效生根率明顯降低，有效根數(shù)和根長也減少；培養(yǎng)瓶內(nèi)生根培養(yǎng)基中最佳的活性炭濃度和IBA濃度分別為O. 1%和O. lmg/L，有效生根率高達95%
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)，其特征在于，步驟煉苗基質(zhì)的優(yōu)化是剪取2cm左右長的無菌苗新梢在生根培養(yǎng)基中生長，45d左右苗高長至·5-6cm時，生根率達95 %，對生根苗移栽在5種不同基質(zhì)上，I. 5個月后統(tǒng)計成活率，實驗結(jié)果表明，水苔蘚的效果最好，成活率高達100%，苗木的生長量達3cm以上，新增葉片6-8枚；效果其次的是2 3 I的草炭與石英砂組合，其成活率為86%，苗木的生長量較高，·I I的草炭與河沙基質(zhì)的成活率僅為52%，但成活苗的質(zhì)量卻很高，表現(xiàn)為生長墩實、植株健壯、生長量與“草炭+石英砂”相當(dāng)；草炭+園土基質(zhì)與草炭+珍珠巖基質(zhì)的效果居中。
全文摘要
一種適宜脫毒兔眼藍(lán)莓的高效快繁技術(shù)，其特征在于，采用外植體材料為當(dāng)年生幼嫩枝，采用以下步驟獲得優(yōu)質(zhì)脫毒苗a、無菌苗的獲得，b、叢生芽的誘導(dǎo)與增殖，c、葉片再生體系的建立，d、試管苗生根培養(yǎng)，e、煉苗；優(yōu)質(zhì)脫毒苗采用以下方法進行改良f、叢生芽的誘導(dǎo)與增殖，g、葉片再生體系的優(yōu)化，h、試管苗的瓶內(nèi)生根優(yōu)化，i、煉苗基質(zhì)的優(yōu)化。本方法從葉片再生、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)到煉苗這一系列環(huán)節(jié)進行了優(yōu)化，建立了一種可高效、快速、持續(xù)獲得優(yōu)良的脫毒兔眼組培種苗技術(shù)。
文檔編號A01H4/00GK102870680SQ20121040578
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者劉如石, 邱義蘭 申請人:劉如石