專利名稱：耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法。
背景技術(shù)：
耐冬山茶為第三紀(jì)的殘遺植物種類，因地殼運(yùn)動，使得青島耐冬與外界山茶基因交流甚少，從而保留了古老而獨(dú)具特色的遺傳特性。從觀賞角度而言，耐冬山茶花色艷麗，花型優(yōu)美，為青島市花；同時(shí)，其葉莖花亦可入藥，用于預(yù)防和治療多種疾病，極具醫(yī)療應(yīng)用前景；不僅如此，耐冬山茶還具有很強(qiáng)的CO2吸收能力，且對H2S等有害氣體具有較強(qiáng)的抗性，故亦具有凈化空氣等環(huán)保作用，可謂全身是寶。目前生產(chǎn)上使用的種苗仍是以傳統(tǒng)方式培育為主。然而，山茶的生長速度慢，繁殖系數(shù)低，靠嫁接、扦插等傳統(tǒng)方式培育，完全不能滿足市場的需求。而關(guān)于山茶屬植物的組織培養(yǎng)，國內(nèi)從20世紀(jì)80年代開始就有諸多研究工作，并取得了可喜的進(jìn)展。采用山茶種子的子葉、幼齡山茶花的莖尖與帶芽莖節(jié)、成年山茶花的莖尖與帶芽莖節(jié)等，作為外植體均可獲得再生植物?，F(xiàn)階段通過“芽生芽”這種莖段培養(yǎng)的方式得到耐冬山茶的例子已有，而對于耐冬山茶由愈傷組織誘導(dǎo)到不定芽分化的例子卻鮮有報(bào)道，也未見專利申請。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法的技術(shù)方案，采用該方法繁殖系數(shù)較高，周期較短，同時(shí)也為山茶分子育種奠定基礎(chǔ)。所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于包括以下步驟:
1)采集9月初的耐冬山茶果實(shí)，剝?nèi)ス?，用洗滌劑搓洗種子，再用自來水搓洗至無泡沫，置于培養(yǎng)瓶中，加入75%酒精進(jìn)行第一次消毒清洗8-12秒，然后純凈水清洗2-3遍，浙干水分，蓋上瓶蓋，置于無菌超凈臺備用；
2)再次使用75%酒精對種子表面消毒25-35秒，接著使用0.1 % HgCl2浸泡6_10分鐘，然后用無菌水沖洗5-6遍，清洗完畢后將種子鋪在放有過濾紙的平皿里吹干水分，備用；
3)剝?nèi)シN子的內(nèi)外種皮,接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,培養(yǎng)溫度為25±2°C,光照光強(qiáng)為2500 3000 Lx，光照時(shí)間為10_12h/d ;所述的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中加入0.4-0.6 mg 1^2，4-D和1.8-2.2 mg L-1 6-BA,愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中蔗糖含量為2_4%，瓊脂0.6-0.8%,滅菌前將PH調(diào)至5.7-5.9，120_125°C下滅菌20-25分鐘；
4)材料接入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基后15-18天后開始啟動，待第25-28天的時(shí)候誘導(dǎo)出的細(xì)密的愈傷組織已經(jīng)在材料與培養(yǎng)基接觸的外圍長滿了厚實(shí)的一圈，淡黃色，泛著些許綠色、晶瑩、剔透，這時(shí)再將長有愈傷組織的材料轉(zhuǎn)移至愈傷組織過渡培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照光強(qiáng)為2500 3000 Lx，光照時(shí)間為10_12h/d ;所述的愈傷組織過渡培養(yǎng)基為 MS 基本培養(yǎng)基中加入 0.1-0.15 mg L-1NAA + 2.0-2.2 mg Ll-BA ；
5)材料在愈傷組織過渡培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，待愈傷組織由淡黃色變?yōu)辄S色略帶一點(diǎn)紅色后將材料轉(zhuǎn)移至愈傷組織分化不定芽培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照光強(qiáng)為2500 3000 Lx，光照時(shí)間為10_12h/d ;所述的愈傷組織分化不定芽培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中加入0.4-0.6 mg じ1NAA + 9-11 mg じ1 6-BA或者M(jìn)S基本培養(yǎng)基中加入0.4-0.6mg じ1 IBA + 9-11 mg L-116-BA ;
6)材料成型并長至3-4cm的芽條，其基部用500-550mgL-1的IBA浸沒處理20_25min，然后轉(zhuǎn)到MV液體培養(yǎng)基的紙橋上在100-200 u mol m_2 s—1下誘導(dǎo)生根；誘導(dǎo)生根階段，采用MV液體培養(yǎng)基加入蔗糖15-20 gL-1，20-22天開始啟動，透明略帶紅色的幼根長出，再培養(yǎng)一段時(shí)間之后，幼根伸長并逐漸木質(zhì)化。所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟1)中:第一次消毒清洗時(shí)間9~10秒。所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟2)中:再次使用75%酒精對種子表面消毒28-30秒，接著使用0.1% HgCl2浸泡8-9分鐘。所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟3)中:光照光強(qiáng)為2600 2800 Lx，光照時(shí)間為llh/d ;所述的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中加入0.5mg じ12，4-D和1.9-2.0 mg L-11 6-BA,愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中蔗糖含量為3%，瓊脂0.7%，滅菌前將PH調(diào)至5.8，122°C下滅菌22分鐘。所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟4)中:光照光強(qiáng)為2600 2800 Lx,光照時(shí)間為llh/d ;所述的愈傷組織過渡培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中加入
0.11-0.13 mg じ1NAA + 2.1 mg L-116-BA。所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟5)中:光照光強(qiáng)為2600 2800 Lx,光照時(shí)間為llh/d ;所述的愈傷組織分化不定芽培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中加入0.5 mgL-11 NAA + 10 mg L-11 6-BA或者M(jìn)S基本培養(yǎng)基中加入0.5mg じ1IBA +10 mg L W-BA。所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟6)中:材料基部用520-530mg L-11 的IBA浸沒處理21_23min ；MV液體培養(yǎng)基的紙橋上在120-150 V- mol ia2 s-1下誘導(dǎo)生根；MV液體培養(yǎng)基加入鹿糖16-18 g L-1。所述的2，4-D，別名:(2，4-ニ氯苯氧基)こ酸，2，4_D酸，2，4_D屬于苯氧類物質(zhì)，是ー種人工合成的植物激素具有與生長素(IAA)相似的生理效應(yīng)，2，4-D主要用于蔬菜開花期沾花，2，4-D因用量和濃度不同，對同一作物組織有不同的效果，濃度低時(shí)可促進(jìn)坐果和無籽果實(shí)的發(fā)育，濃度稍高就會引起生長上的畸形；更高濃度可以殺死植物，作除草劑用，能夠除去多種雙子葉雜草。所述的6-BA，化學(xué)名稱:6-芐氨基腺嘌呤，別名:6_芐氨基嘌呤、細(xì)胞分裂素，
6-BA具有高效、穩(wěn)定、廉價(jià)和易于使用等特點(diǎn)，因而被廣泛采用，并且是組織培養(yǎng)者最喜愛的細(xì)胞分裂素。BA的主要作用是促進(jìn)芽的形成，也可以誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生，可用于提高茶葉、煙草的質(zhì)量及產(chǎn)量；蔬菜、水果的保鮮和無根豆芽的培育，明顯提高果品及葉片的品質(zhì)。所述的NAA，也稱a-萘こ酸，是廣譜型植物生長調(diào)節(jié)劑，能促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，誘導(dǎo)形成不定根増加坐果，防止落果，改變雌、雄花比率等?？山?jīng)葉片、樹枝的嫩表皮，種子進(jìn)入到植株內(nèi)，隨營養(yǎng)流輸導(dǎo)到全株。適用于谷類作物，増加分蘗，提高成穗率和千粒重；棉花減少蕾鈴脫落，增桃增重，提高質(zhì)量。果樹促開花，防落果、催熟增產(chǎn)。瓜果類蔬菜防止落花，形成小籽果實(shí)；促進(jìn)扦插枝條生根等。萘乙酸在植物組培中很是常用，但組培需要無菌環(huán)境，這就需要對萘乙酸所配的溶液進(jìn)行滅菌，選用的滅菌方法很重要，因?yàn)檩烈宜釋儆诩に?，若?jīng)過高溫蒸汽滅菌會失活，所以通常采用過濾除菌。所述的IBA，也叫吲哚丁酸，促進(jìn)植物主根生長，提高發(fā)芽率，成活率，用于促使插條生根。上述耐冬山茶 愈傷組織再生植株的方法，為耐冬山茶大規(guī)模無性繁殖提供一種周期較短，繁殖系數(shù)較高的方法，也為山茶分子育種奠定基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。I)采集9月初的耐冬山茶果實(shí)，剝?nèi)スぃ孟礉嵕晗捶N子，再用自來水搓洗至無泡沫，置于培養(yǎng)瓶中，加入75%酒精進(jìn)行第一次消毒清洗8-12秒，然后純凈水清洗2-3遍，浙干水分，蓋上瓶蓋，置于無菌超凈臺備用；
2)再次使用75%酒精對種子表面消毒25-35秒，接著使用0.1 % HgCl2浸泡6_10分鐘，然后用無菌水沖洗5-6遍，清洗完畢后將種子鋪在放有過濾紙的平皿里吹干水分，備用；
3)剝?nèi)シN子的內(nèi)外種皮,接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,培養(yǎng)溫度為25±2°C,光照光強(qiáng)為2500 3000 Lx，光照時(shí)間為10_12h/d ;所述的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中加入0.4-0.6 mg 1^2，4-D和1.8-2.2 mg Γ1 6-BA,愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中蔗糖含量為2_4%，瓊脂0.6-0.8%,滅菌前將PH調(diào)至5.7-5.9，120_125°C下滅菌20-25分鐘；
4)材料接入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基后15-18天后開始啟動，待第25-28天的時(shí)候誘導(dǎo)出的細(xì)密的愈傷組織已經(jīng)在材料與培養(yǎng)基接觸的外圍長滿了厚實(shí)的一圈，淡黃色，泛著些許綠色、晶瑩、剔透，這時(shí)再將長有愈傷組織的材料轉(zhuǎn)移至愈傷組織過渡培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照光強(qiáng)為2500 3000 Lx，光照時(shí)間為10_12h/d ;所述的愈傷組織過渡培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中加入0.1-0.15 mg L-1NAA + 2.0-2.2 mg L-16-BA，主要作用為中和愈傷誘導(dǎo)階段2，4-D的后續(xù)效應(yīng)；
5)材料在愈傷組織過渡培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，待愈傷組織由淡黃色變?yōu)辄S色略帶一點(diǎn)紅色后將材料轉(zhuǎn)移至愈傷組織分化不定芽培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照光強(qiáng)為2500 3000 Lx，光照時(shí)間為10_12h/d ;所述的愈傷組織分化不定芽培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中加入0.4-0.6 mg T1NAA + 9-11 mg Γ1 6-BA或者M(jìn)S基本培養(yǎng)基中加入0.4-0.6mg L-1IBA + 9-11 mg L_16-BA ；
6)材料成型并長至3-4cm的芽條，其基部用500-550mgL—1的IBA浸沒處理20_25min，然后轉(zhuǎn)到MV液體培養(yǎng)基的紙橋上在100-200 μ mol m_2 s—1下誘導(dǎo)生根；誘導(dǎo)生根階段，采用MV液體培養(yǎng)基加入蔗糖15-20 g L—1，20-22天開始啟動，透明略帶紅色的幼根長出，再培養(yǎng)一段時(shí)間之后，幼根伸長并逐漸木質(zhì)化。本發(fā)明的主要利用耐冬子葉誘導(dǎo)愈傷組織，在對愈傷組織進(jìn)行狀態(tài)調(diào)整的基礎(chǔ)上，利用特定激素配比的MS培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽分化，最后利用“濾紙橋生根法”解決山茶難以生根的技術(shù)難題，從而實(shí)現(xiàn)耐冬愈傷組織誘導(dǎo)及植株的再生。本發(fā)明所述的兩類培養(yǎng)及具體配方如下:
權(quán)利要求
1.冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)采集9月初的耐冬山茶果實(shí)，剝?nèi)ス?，用洗滌劑搓洗種子，再用自來水搓洗至無泡沫，置于培養(yǎng)瓶中，加入75%酒精進(jìn)行第一次消毒清洗8-12秒，然后純浄水清洗2-3適，浙干水分，蓋上瓶蓋，置于無菌超凈臺備用； 2)再次使用75%酒精對種子表面消毒25-35秒，接著使用0.1 % HgCl2浸泡6_10分鐘，然后用無菌水沖洗5-6遍，清洗完畢后將種子鋪在放有過濾紙的平皿里吹干水分，備用； 3)剝?nèi)シN子的內(nèi)外種皮,接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,培養(yǎng)溫度為25±2°C,光照光強(qiáng)為2500 3000 Lx，光照時(shí)間為10_12h/d ;所述的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中加入0.4-0.6 mg じ12， 4-D和1.8-2.2 mg じ1 6-BA，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中蔗糖含量為2_4%，瓊脂0.6-0.8%,滅菌前將PH調(diào)至5.7-5.9，120_125°C下滅菌20-25分鐘； 4)材料接入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基后15-18天后開始啟動，待第25-28天的時(shí)候誘導(dǎo)出的細(xì)密的愈傷組織已經(jīng)在材料與培養(yǎng)基接觸的外圍長滿了厚實(shí)的ー圈，淡黃色，泛著些許綠色、晶瑩、剔透，這時(shí)再將長有愈傷組織的材料轉(zhuǎn)移至愈傷組織過渡培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照光強(qiáng)為2500 3000 Lx，光照時(shí)間為10_12h/d ;所述的愈傷組織過渡培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中加入0.1-0.15 mg じ1NAA + 2.0-2.2 mg じ16-BA ； 5)材料在愈傷組織過渡培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，待愈傷組織由淡黃色變?yōu)辄S色略帶ー點(diǎn)紅色后將材料轉(zhuǎn)移至愈傷組織分化不定芽培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照光強(qiáng)為2500 3000 Lx，光照時(shí)間為10_12h/d ;所述的愈傷組織分化不定芽培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中加入0.4-0.6 mg じ1NAA + 9-11 mg じ1 6-BA或者M(jìn)S基本培養(yǎng)基中加入0.4-0.6mg じ1 IBA + 9-11 mg じ16-BA ; 6)材料成型并長至3-4cm的芽條，其基部用500-550mgじ1的IBA浸沒處理20_25min，然后轉(zhuǎn)到MV液體培養(yǎng)基的紙橋上在100-200 u mol m_2 s—1下誘導(dǎo)生根；誘導(dǎo)生根階段，采用MV液體培養(yǎng)基加入蔗糖15-20 gじ1，20-22天開始啟動，透明略帶紅色的幼根長出，再培養(yǎng)一段時(shí)間之后，幼根伸長并逐漸木質(zhì)化。
2.按權(quán)利要求1所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟I)中:第一次消毒清洗時(shí)間9-10秒。
3.按權(quán)利要求1所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟2)中:再次使用75%酒精對種子表面消毒28-30秒，接著使用0.1% HgCl2浸泡8_9分鐘。
4.按權(quán)利要求1所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟3)中:光照光強(qiáng)為2600 2800 Lx，光照時(shí)間為llh/d ;所述的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中加入0.5 mg じ12，4-D和1.9-2.0 mg じ1 6-BA,愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中蔗糖含量為3%，瓊脂.0.7%，滅菌前將PH調(diào)至5.8，122 °C下滅菌22分鐘。
5.按權(quán)利要求1所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟4)中:光照光強(qiáng)為2600 2800 Lx，光照時(shí)間為llh/d ;所述的愈傷組織過渡培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中加入 0.1 ト0.13 mg じ1NAA + 2.1 mg じ16-BA。
6.按權(quán)利要求1所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟5)中:光照光強(qiáng)為2600 2800 Lx，光照時(shí)間為llh/d ;所述的愈傷組織分化不定芽培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中加入0.5 mg じ1NAA + 10 mg じ1 6-BA或者M(jìn)S基本培養(yǎng)基中加入.0.5mg L 1IBA + 10 mg L W-BA。
7.按權(quán)利要求1所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟6)中:材料基部用520-530mg じ1的IBA浸沒處理21_23min ；MV液體培養(yǎng)基的紙橋上在120-150 V- mol ia 2 s-1下誘導(dǎo)生根；MV液體培養(yǎng)基加入鹿糖16-18 g じ1。
全文摘要
耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于包括以下步驟采集9月初的耐冬山茶果實(shí)，消毒、清洗；剝?nèi)シN子的內(nèi)外種皮，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基；第25-28天將材料轉(zhuǎn)移至愈傷組織過渡培養(yǎng)基上；待愈傷組織由淡黃色變?yōu)辄S色略帶一點(diǎn)紅色后將材料轉(zhuǎn)移至愈傷組織分化不定芽培養(yǎng)基內(nèi)；材料成型并長至3-4cm的芽條，其基部用IBA浸沒處理，然后轉(zhuǎn)到MV液體培養(yǎng)基的紙橋上誘導(dǎo)生根，20-22天開始啟動，透明略帶紅色的幼根長出，再培養(yǎng)一段時(shí)間之后，幼根伸長并逐漸木質(zhì)化。上述耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，為耐冬山茶大規(guī)模無性繁殖提供一種周期較短，繁殖系數(shù)較高的方法，也為山茶分子育種奠定基礎(chǔ)。
文檔編號A01H4/00GK103081807SQ20131004031
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者李紀(jì)元, 范正琪, 李辛雷, 殷恒福, 吳斌 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所