擬南芥硝酸鹽轉運體基因nrt3.1及其編碼蛋白與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物分子生物學與轉基因相關【技術領域】。具體為擬南芥硝酸鹽轉運體基因NRT3.1耐低氮功能的驗證，以及該基因在耐低氮和氮素營養(yǎng)高效植物新品種培育中的應用。本發(fā)明以模式植物擬南芥為材料，利用NRT3.1基因T-DNA插入突變體CS876661的純合株系研究NRT3.1基因在植物低氮高效方面的功能。實驗結果顯示：NRT3.1基因敲除突變體在低氮培養(yǎng)條件(0.1mMNO3-)下，地上部干重極顯著小于野生型(P＝0.002)，且根部和地上部含氮量均顯著低于野生型(P＝0.045，P＝0.01)。說明NRT3.1基因在植物應答低氮脅迫的信號轉導途徑中具有重要的作用，預計該基因的過量表達可提高植物的耐低氮能力并在植物氮素營養(yǎng)高效分子育種中具有較大的經(jīng)濟價值。
【專利說明】擬南芥硝酸鹽轉運體基因NRT3.1及其編碼蛋白與應用
所屬【技術領域】:
[0001]本發(fā)明屬于植物分子生物學與轉基因相關【技術領域】。具體為擬南芥硝酸鹽轉運體(Nitrate transporters, NRTs)家族關鍵基因NRT3.1在低氮脅迫下的反應和作用機理，以及該基因在營養(yǎng)高效植物新品種培育中的應用。
【背景技術】:
[0002]氮是植物必需的營養(yǎng)元素之一，是植物體內(nèi)蛋白質、核酸、葉綠素、酶等的組成成分。氮素供應不足會影響植物的生長發(fā)育，限制農(nóng)作物的產(chǎn)量；而氮肥施用過量則使氮素利用率下降，不僅造成資源浪費，而且引起環(huán)境污染。通過挖掘植物自身遺傳潛能，克隆耐低氮和氮素營養(yǎng)高效的基因，并利用轉基因技術培育氮素利用效率提高的新品種是解決這一問題的重要途徑之一。
[0003]擬南芥(Arabidopsis thaliana)屬十字花科、蕓薹屬植物，它不僅是第一個完成基因組序列測定的模式植物(Athanasios Theologis.et al., Nature, 2000,408:791-826)，而且具有植株小，生長周期短，種子數(shù)量多，基因組小且易于進行遺傳轉化，自花授粉而又易于雜交等優(yōu)點。因此在植物分子生物學及轉基因相關【技術領域】中，擬南芥被作為模式植物廣泛加以研究和應用。
[0004]硝酸鹽轉運體(Nitrate transporters, NRTs)是一類專司硝態(tài)氮吸收、運輸?shù)霓D運蛋白。研究發(fā)現(xiàn)擬南 芥基因組中存在3個NRT基因家族:NRT1、NRT2和NRT3，其中NRT3基因家族包含2個成員(NRT3.1和NRT3.2)。前人的研究證明NRT3.1基因為硝酸鹽高親和性吸收轉運體，在低氮素條件下，該基因的敲除突變體生長明顯弱于野生型(MamoruOkamot0.et al, Plant Physiology, March2006, Vol.140, pp.1036-1046)。但至今還未見低氮條件下該基因調(diào)控地上部生物量的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明提供一個擬南芥硝酸根離子高親和性轉運體基因，以及該基因對低氮脅迫的反應和生理機制。
[0006]所提供的硝酸鹽高親和性轉運體基因為NRT3.1 (AT5G50200)。
[0007]上述基因具有SEQ ID N0.1的堿基序列。
[0008]上述基因編碼的蛋白質具有SEQ ID N0.2的氣基酸序列。
[0009]NRT3.1 基因的 T-DNA 插入突變體 CS876661 是從 ABRC (Arabidopsis BiologicalResource Center)定購獲得。通過PCR鑒定獲得純合插入突變體，通過RT-PCR在mRNA水平上鑒定基因的敲除情況。
[0010]通過上述鑒定，獲得NRT3.1基因T-DNA插入突變體CS876661的純合株系，并以之為材料進行低氮處理，觀察低氮表型并拍照。然后對低氮處理后的擬南芥幼苗進行耐低氮相關指標的測定，包括:地上部干重測量，根部和地上部含氮量統(tǒng)計等。【專利附圖】

【附圖說明】:
[0011]圖1顯示野生型和突變體PCR和RT-PCR檢測的電泳結果，結果表明獲得了 NRT3.1基因T-DNA插入突變體株系CS876661的純合插入株系，其轉錄本被敲除。
[0012]圖2顯示野生型和突變體低氮處理7天的表型照片，結果表明在0.1mMNCV的培養(yǎng)條件下，突變體比野生型更早白化死亡，表現(xiàn)低氮敏感表型。
[0013]圖3顯示野生型和突變體低氮處理7天的地上部干重統(tǒng)計，結果表明在0.1mMN03_的培養(yǎng)條件下，突變體地上部干重極顯著小于野生型(P = 0.002)。
[0014]圖4顯示0.1mM NO3^處理后野生型和突變體根部和地上部含氮量差異，結果表明突變體根部和地上部含氮量均極顯著低于野生型(P = 0.001, P = 0.009)。
【具體實施方式】:
[0015]下面結合實驗方法和數(shù)據(jù)進一步闡述本發(fā)明。
[0016]1.擬南芥幼苗培養(yǎng):
[0017]野生型和突變體種子分別用0.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒lOmin，消毒后的種子放入4°C冰箱春化2天后點布于含I %瓊脂的MS (Murashige and Skoog)固體培養(yǎng)基上,置于22°C光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)生長。
[0018]2.純合突變體 的鑒定:
[0019]DNA提取:所用實驗藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司。取約0.5g擬南芥新鮮葉片，研磨成糊狀，加 400 μ I SDS 提取液(0.5% SDS(ff/V) ；200mMTris-Hcl, PH = 8.0 ；250mM NaCl ；25mM EDTA) ; 12，OOOr/min,離心3min ;取上清,加等體積異丙醇輕輕搖晃,靜置30min ；13, OOOr/min,離心5min ;棄上清,用lml95%乙醇沖洗1-2次后，自然風干,加去離子水30 μ 1，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0020]RNA提取:所用實驗藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司。所用研缽、槍頭、離心管等一應物品事先用1% DEPC水浸泡過夜后高溫高壓滅菌備用。取新鮮幼苗約Ig左右，于液氮中研磨成粉狀，加Iml TRIZOL提取液混勻，靜置IOmin ;4°C下12，OOOr/min離心IOmin ;取上清加300 μ I氯仿混勻，靜置IOmin后4°C下12, OOOr/min離心15min,樣品分為3層，RNA位于上層水相中；取500 μ I水相轉移到新離心管中，加等體積異丙醇沉淀 10-20min ; 12，OOOr/min 離心 IOmin,棄上清;用 75% 酒精洗漆 1-2 次,7，OOOr/min 離心2min,晾干Imin左右，加60 μ I無RNase水，輕輕震蕩使RNA溶解，_70°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0021]RT-PCR:所用反轉錄試劑盒(#kl621)購自 Fermentas。First strandcDNAsynthesis:管中加入 RNAl μ I, oligo(dT) 18primerl μ I, RNase-free water I μ 1，65 °C 處理 5min 后迅速冰浴冷卻；然后再加 5XReaction buffer4 μ I, Ribolock?RNaseinhibitor(20u/μ I)I μ I,IOmM dNTP Mix2μ I, RevertAid? H Minus M-MuLV ReverseTranscriptase (200u/μ I) I μ 1，42°C反應 60min ;70°C終止反應 5min，產(chǎn)物于 _20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0022]PCR檢測:所用實驗藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。我們設計了 2對引物，I對用于T-DNA插入檢測(LPl:5' -ACACTCACATTGGCTGACCTC-3' ,RPl:5/ -CTTCAGCGTTCAGGCTATCAG-3')，并結合T-DNA左邊界通用引物LBbl:5' -AACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC-3'，通過PCR鑒定獲得純合插入突變體。另外 I 對用于 RT-PCR 檢測(LP2:5 ' -CTTCAGCGTTCAGGCTATCAG-3 ' ；RP2:5' -AAAGAAG AAGTGTGCAAAGACAA-3 ')，通過RT-PCR在mRNA水平上鑒定基因的敲除情況。PCR 反應體系如下:10 X buffer buffer2 μ I, dNTP0.8 μ I, Primer LP/RP 各 Ιμ?，DNAl μ 1，dH2014y 1，Taq 酶 0.2 μ I。PCR 程序如下:94°C 3min ； (94°C 45sec ；58°C 45sec ；72°C 60sec) X30cycles ；72°C 5min。產(chǎn)物采用1% (ff/V)瓊脂糖凝膠電泳分離，恒壓IOOV電泳20min,用BIO-RAD凝膠成像掃描儀拍照記錄檢測結果。
[0023]PCR和RT-PCR檢測的結果表明我們鑒定到NRT3.1基因T-DNA插入突變體CS876661的純合插入株系，其轉錄本被敲除。
[0024]3.低氮處理:
[0025]在含I %瓊脂的固體MS培養(yǎng)基上生長5天的幼苗，分別轉移到含有0mM、0.2mM和IOmM N03_的培養(yǎng)基上，野生型和突變體各轉5-6株，排列整齊以便于觀察表型。低氮培養(yǎng)基包括 ImM KH2PO4, ImM MgSO4,0.25mM CaCl2,0.1mM Na-Fe-ethylenediamine tetraaceticacid (EDTA)，ImM KCl，30mMH3B03，5mM MnSO4, ImM ZnSO4, ImM CuSO4, 0.7mM Na2MoO4,
0.1mMNO3-和3%蔗糖，用NaOH調(diào)PH值至5.7-5.75。22°C光照培養(yǎng)7天后拍照，統(tǒng)計主根長、地上部干重、含氮量等指標。
[0026]結果表明在低氮培養(yǎng)條件(0.1mMNO3O下，突變體生長比野生型弱，表現(xiàn)低氮敏感表型:突變體地上部干重極顯著小于野生型(P = 0.002);根部和地上部含氮量也均極顯著低于野生型(P = 0.0OLP = 0.009)。而ImM NO3^處理下突變體地上部干重和根部及地上部含氮量與野生型均無顯著差異。這說明突變體在低氮條件下的氮素吸收能力減弱，氮素營養(yǎng)供應不足導致生長受阻。
【權利要求】
1.擬南芥硝酸鹽轉運體基因NRT3.1，其堿基序列如SEQ ID N0.1。
2.權利要求1所述的擬南芥硝酸鹽轉運體基因NRT3.1編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2。
3.權利要求1所述的擬南芥硝酸鹽轉運體基因NRT3.1敲除突變體的低氮處理方法及條件。
4.權利要求1所述的擬南芥硝酸鹽轉運體基因NRT3.1敲除突變體在低氮處理下所獲得的表型及其相關試驗數(shù)據(jù)。
5.權利要求1所述的擬南芥硝酸鹽轉運體基因NRT3.1在制備耐低氮及氮素營養(yǎng)高效轉基因植物中 的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK103667310SQ201310047443
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年2月6日 優(yōu)先權日:2013年2月6日
【發(fā)明者】徐江, 徐小棟, 東方陽, 魯黎明, 王西瑤, 張少斌, 遲志海, 洪雪, 麻艷超, 趙明, 丁在松, 付金東 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所