一種泥炭蘚原絲體的獲得及培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種泥炭蘚原絲體的獲得及培養(yǎng)方法，以泥炭蘚的莖葉體為原材料，經(jīng)組織粉碎，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從泥炭蘚組織莖葉體的碎片上長出新的原絲體，將該原絲體進行組織粉碎，再進行液體培養(yǎng)，得到所述泥炭蘚原絲體。本發(fā)明可大量獲取泥炭蘚的原絲體，并利用該原絲體在短時間內(nèi)獲得大量生長均一的莖葉體，有利于泥炭蘚在組織培養(yǎng)生理實驗及泥炭蘚原生質(zhì)體制備轉(zhuǎn)化或再生中的應(yīng)用等。
【專利說明】一種泥炭蘚原絲體的獲得及培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及自然資源的利用及保護領(lǐng)域，具體涉及一種泥炭蘚原絲體的獲得及培
養(yǎng)方法。【背景技術(shù)】
[0002]泥炭蘚屬(Sphagnum)屬于苔蘚植物門，蘚綱，泥炭蘚目，該目僅一科一屬。泥炭蘚屬全世界有300多種，我國40余種。泥炭蘚一股生長在沼澤地區(qū)，在我國東北和西南林下沼澤地生長茂盛。泥炭蘚是重要的造炭植物之一，它在長期的生長過程中會積累大量泥炭，并最終會成為具有工業(yè)利用價值的泥炭礦床，泥炭蘚固碳量占北半球泥炭沼澤固碳總量的一半。另外，泥炭蘚是濕地的主要植物類群之一。由于泥炭蘚泥炭纖維含量豐富，通氣透水性好，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是最理想的植物栽培基質(zhì)，已成為農(nóng)業(yè)、園藝生產(chǎn)中不可缺少的重要原材料。另外，泥炭蘚消毒后可代藥棉使用，植株死層形成之泥炭可作肥料及燃料。近年來，由于需求旺盛，大量出口，導(dǎo)致我國自然泥炭蘚資源被掠奪性開采，許多泥炭蘚濕地資源近乎枯竭，生態(tài)系統(tǒng)破壞嚴重。因此發(fā)展人工種植泥炭蘚是解決這一問題的必由之路。由于一股泥炭蘚的原絲體只能通過采集孢子萌發(fā)獲得。由于泥炭蘚孢子采集困難，而且該原絲體生長周期很短，在幾天內(nèi)會迅速分化成莖葉體，目前，還沒有穩(wěn)定大量培養(yǎng)泥炭蘚原絲體的報道。因此，目前泥炭蘚的培養(yǎng)和種植僅僅局限在樣田以及溫室進行，且在國內(nèi)外均是如此。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提出了一種泥炭蘚原絲體的獲得及培養(yǎng)方法，以泥炭蘚的莖葉體為原材料，經(jīng)多次組織粉碎，在改良的Knop液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從泥炭蘚組織莖葉體的碎片上長出新的原絲體，將該原絲體進行組織粉碎，再在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到所述泥炭蘚原絲體。利用本發(fā)明方法獲得的原絲體可以在短時間內(nèi)獲得大量生長均一的莖葉體。
[0004]其中，所述改良的Knop液體培養(yǎng)基的配方為:磷酸二氫鉀(KH2PO4) 250毫克/升，氯化鉀(KCl) 250 毫克 / 升，硫酸鎂(MgSO4.7H20) 250 毫克 / 升，硝酸鈣(Ca (NO3) 2.4H20) 1000毫克/升，硫酸亞鐵(FeSO4.7H20) 14毫克/升，pH5.4。
[0005]其中，所述組織粉碎是在超凈工作臺上使用組織粉碎儀，用滅菌的組織粉碎刀頭將所述泥炭蘚的莖葉體切成碎片；其中，所述碎片的長度為1-3毫米；優(yōu)選的碎片長度為2毫米。
[0006]其中，所述組織粉碎的初期粉碎時間為10-30秒；后期粉碎時間為30-40秒；優(yōu)選地，初期粉碎時間較短，為20秒；后期粉碎時間較長，為30秒。
[0007]其中，所述培養(yǎng)條件為:18_22°C，搖床轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘，24h震蕩，液體培養(yǎng)基pH值為5.4，懸浮培養(yǎng)，光照3500Lux，光照時間16h光照/8h黑暗。
[0008]其中，所述粉碎處理為每一次液體培養(yǎng)7-14天之后進行粉碎一次。第一次組織粉碎處理后的間隔期即培養(yǎng)期優(yōu)選為14天此后組織粉碎的間隔期間優(yōu)選7天。
[0009]其中，所述原絲體培養(yǎng)過程中的組織粉碎是規(guī)律連續(xù)進行的，若停止粉碎，原絲體將迅速分化為莖葉體。
[0010]本發(fā)明中多次組織粉碎及培養(yǎng)反復(fù)進行至少兩次以上，次數(shù)不限，按實際需要調(diào)
難
iF.0
[0011]本發(fā)明泥炭蘚原絲體的獲得及培養(yǎng)方法的具體步驟，包括:
[0012](I)將泥炭蘚的莖葉體進行脫毒，脫毒方法為70%乙醇30秒，無菌水沖洗3-5次，之后將莖葉體用無菌的濾紙將水分吸干，最后置于改良Knop固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以獲取無菌的莖葉體材料。
[0013](2)待莖葉體恢復(fù)生長后(2-3周后)，取3-5枝健康莖葉體于改良Knop液體培養(yǎng)基中，利用刀頭經(jīng)過高壓蒸汽滅菌的粉碎機粉碎20s，于搖床上懸浮培養(yǎng)。粉碎時是將粉碎機刀頭插入500ml的大三角燒瓶中，三角燒瓶中所裝培養(yǎng)液的體積一股是200ml。
[0014](3)每隔一周連續(xù)粉碎，第一次與第二次粉碎間隔時間可相對增加至10-14天。三次連續(xù)粉碎后即可觀察到穩(wěn)定的泥炭蘚原絲體。
[0015](4)此后，每周粉碎該原絲體一次，每次粉碎30s，當(dāng)原絲體的量增長過多時，可將原絲體分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，或按照下面步驟培養(yǎng)成莖葉體。
`[0016](5)若需培養(yǎng)成莖葉體，可吸取適量的粉碎后混合泥炭蘚原絲體或碎片的液體培養(yǎng)基于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，也可直接在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。液體培養(yǎng)的材料要置于搖床上懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:光照35001ux，光照時間16h光照/8h黑暗，溫度20-22°C。
[0017]本發(fā)明提出的簡便、快速的大量獲得并培養(yǎng)泥炭蘚原絲體的方法，能夠從泥炭蘚莖葉體出發(fā)獲得大量原絲體，并能夠在實驗室條件下維持其快速分裂狀態(tài)，而不會分化成莖葉體。提高利用泥炭蘚進行組織培養(yǎng)及生理實驗的應(yīng)用效率，包括在泥炭蘚原生質(zhì)體的制備、轉(zhuǎn)化、再生等的應(yīng)用等。同時利用本發(fā)明方法在實驗室實現(xiàn)泥炭蘚大量、穩(wěn)定、均一化增殖，為后期大量繁殖質(zhì)量均已的莖葉體以及進行相關(guān)生理生態(tài)分子生物學(xué)研究提供前提，不僅有利于相關(guān)生產(chǎn)研究工作，而且有利于自然生態(tài)環(huán)境的保護，同時涉及農(nóng)副業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域的研究應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明在液體中培養(yǎng)的泥炭蘚原絲體的示意圖。
[0019]圖2是多個葉狀原絲體和絲狀元絲體從一個莖葉體片段上再生出來的示意圖。
[0020]圖3是實施例2中在液體培養(yǎng)條件下利用本發(fā)明所制備的原絲體培養(yǎng)成莖葉體的示意圖。
[0021]圖4是實施例2中在固體培養(yǎng)條件下利用本發(fā)明所制備的原絲體培養(yǎng)成莖葉體的示意圖。
【具體實施方式】
[0022]結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以下實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。實施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。[0023]實施例1泥炭蘚原絲體的培養(yǎng)方法
[0024]原材料:采自我國四川達古冰川的泥炭蘚(Sphagnum squarrosum)莖葉體。
[0025]改良的Knop液體培養(yǎng)基的配方為:磷酸二氫鉀(KH2PO4) 250毫克/升，氯化鉀(KCl) 250 毫克 / 升，硫酸鎂(MgSO4.7H20) 250 毫克 / 升，硝酸鈣(Ca (NO3) 2.4H20) 1000 毫克 /升，硫酸亞鐵(FeSO4.7H20) 14毫克/升，pH5.4。 [0026]連續(xù)組織粉碎的設(shè)備:粉碎機(Fluko德國，F(xiàn)A25)。
[0027]具體步驟:將泥炭蘚在有土濕潤條件下栽培2周，采集新長出的莖葉體進行脫毒。脫毒方法為70%乙醇30秒，無菌水沖洗3-5次，之后將莖葉體用無菌的濾紙將水分吸干，最后置于改良Knop固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以獲取無菌的莖葉體材料。脫毒泥炭蘚莖葉體后，經(jīng)過無菌培養(yǎng)，取健康莖葉體2-3枝，在Knop液體培養(yǎng)基上利用粉碎機(Fluko)粉碎(10000r/min)，粉碎時間20s。將組織碎片液體培養(yǎng)2周后，再進行一次組織粉碎，粉碎時間30秒，培養(yǎng)I周后，可將細小綠色組織出現(xiàn)，即出現(xiàn)泥炭蘚原絲體，如圖1所示。此后，保持每隔一周進行一次組織粉碎，原絲體不斷增長，即可穩(wěn)定獲得大量的泥炭蘚原絲體，如圖
2所示。一旦終止粉碎，則原絲體將在7天后迅速分化為莖葉體。
[0028]實施例2利用培養(yǎng)的泥炭蘚原絲體繁殖泥炭蘚的莖葉體
[0029]原材料:采用實施例1培養(yǎng)獲得的無菌的泥炭蘚原絲體
[0030]改良Knop液體培養(yǎng)基的配方為:磷酸二氫鉀(KH2PO4) 250毫克/升，氯化鉀(KCl) 250 毫克 / 升，硫酸鎂(MgSO4.7H20) 250 毫克 / 升，硝酸鈣(Ca (NO3) 2.4H20) 1000 毫克 /升，硫酸亞鐵(FeSO4.7H20) 14毫克/升，pH5.4。
[0031]改良固體Knop培養(yǎng)基的配方為:液體改良Knop+0.8%瓊脂。
[0032]培養(yǎng)條件:溫度18_22°C，搖床轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘，24h震蕩，培養(yǎng)基pH值為5.4，懸浮培養(yǎng)，光照3000Lux，光照時間16h光照/8h黑暗。
[0033]具體步驟:將上述實施例1培養(yǎng)的泥炭蘚原絲體，停止持續(xù)組織粉碎，并置于搖床上培養(yǎng)，10天即可長出莖葉體。培養(yǎng)一個月后，平均長度可達7毫米，如圖3所示。另外，取少量該泥炭蘚的原絲體置于滅菌后的改良Knop固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一個月后，即可長出大量泥炭蘚莖葉體，如圖4所示。
【權(quán)利要求】
1.一種泥炭蘚原絲體的獲得及培養(yǎng)方法，其特征在于，以泥炭蘚的莖葉體為原材料，經(jīng)組織粉碎，在改良的Knop液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從泥炭蘚組織莖葉體的碎片上長出新的原絲體，將該原絲體進行多次組織粉碎，再在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到所述泥炭蘚原絲體。
2.如 權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述泥炭蘚的莖葉體為經(jīng)過無菌處理后脫毒，并在培養(yǎng)基上繁殖好的無菌的泥炭蘚的莖葉體。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述改良的Knop液體培養(yǎng)基包括:磷酸二氫鉀(KH2PO4) 250毫克/升，氯化鉀(KCl) 250毫克/升，硫酸鎂(MgSO4.7H20) 250毫克/升，硝酸鈣(Ca(NO3)2.4H20) 1000 毫克 / 升，硫酸亞鐵(FeSO4.7H20) 14 毫克 / 升，pH5.4。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述組織粉碎是在超凈工作臺上使用組織粉碎儀，用滅菌的組織粉碎刀頭將所述泥炭蘚的莖葉體切成碎片；其中，所述碎片的長度為1-3毫米。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述碎片長度為2毫米。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述組織粉碎的初期粉碎時間為10-30秒；后期粉碎時間為30-40秒。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述組織粉碎的初期粉碎時間為20秒，后期粉碎時間為30秒。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)條件為:18-22°C，搖床轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘，24h震蕩，液體pH值為5.4，懸浮培養(yǎng)，光照3500LUX，光照時間16h光照/8h黑暗。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述組織粉碎及泥炭蘚原絲體的培養(yǎng)是連續(xù)多次；在前后兩次所述組織粉碎的間隔期間，所述泥炭蘚原絲體的培養(yǎng)時間為7-14天。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，在第一次組織粉碎后的培養(yǎng)時間為14天，此后的每一次組織粉碎后的培養(yǎng)時間為7天。
【文檔編號】A01H4/00GK103609443SQ201310573487
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】孫越, 李澤玲, 李小方, 朱瑞良 申請人:華東師范大學(xué)