本發(fā)明涉及植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種通過花藥培養(yǎng)獲得烏桕再生植株的方法。
背景技術(shù)：
：烏桕(SapiumsebiferumRoxb)，大戟科烏桕屬落葉喬木，是一種集觀賞、藥用和油用于一體的多功能樹種。烏桕適應(yīng)性強，分布廣，種子含油率高達55％，是制造蠟燭、肥皂、金屬皂、潤滑脂、合成洗滌劑，軟化劑和制取軟脂酸、硬脂酸、玻璃鋼、高級噴漆的原料。近年來烏桕種子也成為制取生物柴油的重要原料，同時也是制備巧克力、化妝品的重要原料。此外，烏桕因其葉色多變，在秋季呈現(xiàn)出紅、橙、黃、綠、紫和褐等顏色，又是一種具有發(fā)展?jié)摿Φ木坝^植物，具有廣泛應(yīng)用前景。由于烏桕為多年生木本植物，且高度雜合，通過傳統(tǒng)的雜交育種方式很難滿足育種需求，而單倍體育種可以大大縮短育種年限，加快育種進程，在植物遺傳育種理論和實踐研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。植物花藥培養(yǎng)技術(shù)是最常用的獲得單倍體植株的方法，通過花藥培養(yǎng)可快速有效地獲得純合雙單倍體，避免了通過傳統(tǒng)育種手段需要多代自交才可以獲得純合穩(wěn)定的品系。此外，通過花藥培養(yǎng)獲得的單倍體可以直接用于遺傳圖譜的構(gòu)建、培育新品種或作為優(yōu)良親本用于品種改良。因此，本發(fā)明以烏桕花藥為材料，建立了一套適合烏桕的簡單、快速、穩(wěn)定的花藥離體再生體系，為烏桕的單倍體育種、遺傳圖譜的構(gòu)建及后期種質(zhì)資源的創(chuàng)建等提供技術(shù)支撐；同時，對烏桕的遺傳改良和新品種的選育都具有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適合烏桕的簡單、快速、穩(wěn)定的通過花藥培養(yǎng)獲得烏桕再生植株的方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種通過花藥培養(yǎng)獲得烏桕再生植株的方法，包括如下步驟：(1)外植體的選擇選取生長至適宜時期的烏桕花序用于后續(xù)培養(yǎng)；(2)外植體的低溫預(yù)處理將花序裝于自封塑料袋內(nèi)置于冰箱進行低溫預(yù)處理；(3)外植體的表面消毒將經(jīng)過低溫預(yù)處理后的花序經(jīng)流水沖洗后置于無菌操作臺中進行表面消毒；(4)愈傷組織誘導培養(yǎng)濾紙吸干步驟(3)中消毒后花序表面的水分，剝?nèi)』ㄋ?，接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，再經(jīng)過3-4周的光照培養(yǎng)，獲取愈傷組織；(5)愈傷組織的增殖培養(yǎng)將步驟(4)中獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)；(6)愈傷組織的分化將步驟(5)中增殖后的愈傷組織切成切塊，轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基中進行愈傷組織的分化培養(yǎng)；(7)不定芽的伸長將步驟(6)中已分化出叢生芽的愈傷組織，轉(zhuǎn)接于不定芽伸長培養(yǎng)基中進行不定芽的伸長培養(yǎng)并獲取相應(yīng)烏桕幼苗；(8)不定芽的生根將步驟(7)中伸長的烏桕幼苗轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，最終獲得烏桕再生植株。優(yōu)選地，所述步驟(1)中生長至適宜時期的烏桕花序為經(jīng)顯微鏡鏡檢，選取小孢子處于單核中期或單核靠邊期的烏桕花序。優(yōu)選地，所述步驟(2)中低溫預(yù)處理的方法為：將花序置于3-5℃冰箱處理6-24h。優(yōu)選地，所述步驟(3)中外植體的表面消毒的具體方法為：將花序經(jīng)流水沖洗20-30min后，于無菌操作臺中用無菌水沖洗3-5遍；再采用70％-75％的乙醇消毒15-20s,無菌水沖洗3-5遍，重復(fù)1次；接著，再用添加有0.5-1.0％(v/v)Tween的0.1％(w/v)的升汞消毒60-120s，最后用無菌水再沖洗5-8遍。優(yōu)選地，所述步驟(4)中花藥的剝?nèi)∮跓o菌操作臺中借助尖頭鑷子進行。優(yōu)選地，所述步驟(4)中愈傷組織誘導培養(yǎng)基為添加有0.6-3.0mg/LTDZ和0.6-3.0mg/LIAA的DKW培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述步驟(5)中增殖培養(yǎng)基為添加有0.1-0.5mg/LTDZ和1.0-2.0mg/LIAA的DKW培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述步驟(6)中分化培養(yǎng)基為添加有0.2-0.5mg/LTDZ和0.1-0.5mg/LZT的DKW培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述步驟(7)中不定芽伸長培養(yǎng)基為添加有0.05-0.2mg/LZT的1/2DKW培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述步驟(8)中生根培養(yǎng)基為添加有0.1-2.0mg/L亞精胺的1/2DKW培養(yǎng)基。本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明所提供的一種通過花藥培養(yǎng)獲得烏桕再生植株的方法，具體涉及一種以木本能源植物烏桕的花藥為外植體，通過愈傷組織的誘導、增殖和分化，最終獲得烏桕完整植株的方法；本發(fā)明建立了一套適合烏桕的簡單、快速、穩(wěn)定的花藥離體再生體系，為烏桕的單倍體育種、遺傳圖譜的構(gòu)建及后期種質(zhì)資源的創(chuàng)建等提供技術(shù)支撐，同時，對烏桕的遺傳改良和新品種的選育具有重要意義。附圖說明圖1是本發(fā)明實施例1-3提供的一種通過花藥培養(yǎng)獲得烏桕再生植株的方法的流程圖；圖2是本發(fā)明實施例1提供的一種通過花藥培養(yǎng)獲得烏桕再生植株的方法的小孢子處于單核靠邊期的花藥圖；圖3是本發(fā)明實施例1提供的一種通過花藥培養(yǎng)獲得烏桕再生植株的方法的小孢子處于單核靠邊期的花藥所對應(yīng)的花序大小圖；圖4是本發(fā)明實施例1提供的一種通過花藥培養(yǎng)獲得烏桕再生植株的方法的花藥愈傷組織的誘導圖；圖5是本發(fā)明實施例1提供的一種通過花藥培養(yǎng)獲得烏桕再生植株的方法的愈傷組織的增殖圖；圖6是本發(fā)明實施例1提供的一種通過花藥培養(yǎng)獲得烏桕再生植株的方法的愈傷組織的分化圖；圖7是本發(fā)明實施例1提供的一種通過花藥培養(yǎng)獲得烏桕再生植株的方法的不定芽的生根圖。具體實施方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1一種通過花藥培養(yǎng)獲得烏桕再生植株的方法，如圖1所示，包括如下步驟：(1)外植體的選擇經(jīng)顯微鏡鏡檢，選取小孢子處于單核靠邊期的烏桕花藥所對應(yīng)的花序用于后續(xù)培養(yǎng)，其中，小孢子處于單核靠邊期的花藥及花藥所對應(yīng)的花序大小圖分別如圖2、圖3所示；(2)外植體的低溫預(yù)處理將花序裝于自封塑料袋內(nèi)置于3℃冰箱進行低溫預(yù)處理6h；(3)外植體的表面消毒將經(jīng)過低溫預(yù)處理后的花序經(jīng)流水沖洗20min后置于無菌操作臺中用無菌水沖洗3遍；再采用70％的乙醇消毒15s，無菌水沖洗3遍，重復(fù)1次；接著，再用添加有0.5％(v/v)Tween的0.1％(w/v)的升汞消毒60s，最后用無菌水再沖洗5遍；(4)愈傷組織誘導培養(yǎng)濾紙吸干步驟(3)中消毒后花序表面的水分，于無菌操作臺中借助尖頭鑷子剝?nèi)』ㄋ?，接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，放置于光照周期為8/16(光照/黑暗)，光照強度(2000-2500lx)，溫度為(24±1)℃的恒溫培養(yǎng)室，經(jīng)過3周的培養(yǎng)，獲得如圖4所示的淡綠色的花藥愈傷組織，愈傷組織的誘導率高達100％；其中愈傷組織的誘導培養(yǎng)基為添加有0.6mg/LTDZ和0.6mg/LIAA的DKW培養(yǎng)基；(5)愈傷組織的增殖培養(yǎng)將步驟(4)中將誘導出的直徑為4mm的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基中進行愈傷組織的增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)5周后愈傷組織的增殖效率最高達6.8，其中增殖培養(yǎng)基為添加有0.1mg/LTDZ和1.0mg/LIAA的DKW培養(yǎng)基；(6)愈傷組織的分化將如圖5所示的增殖后的愈傷組織切成切塊，轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上，于光照周期為16/8(光照/黑暗)，光照強度(2500-3000lx)，溫度為(26±1)℃的恒溫培養(yǎng)室中，進行愈傷組織的分化；經(jīng)過3周的光照培養(yǎng)，93.2％的愈傷組織分化出如圖6所示的不定芽點，其中分化培養(yǎng)基為添加有0.2mg/LTDZ和0.1mg/LZT的DKW培養(yǎng)基；(7)不定芽的伸長待不定芽長至0.5cm后，將帶有不定芽叢的愈傷組織轉(zhuǎn)接于不定芽伸長培養(yǎng)基中進行不定芽的伸長培養(yǎng)并獲取相應(yīng)烏桕幼苗，其中不定芽伸長培養(yǎng)基為添加有0.05mg/LZT的1/2DKW培養(yǎng)基；(8)不定芽的生根光照培養(yǎng)2周后，將伸長的烏桕不定芽轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，1個月后獲得如圖7所示的根系健壯的烏桕再生植株，其中生根培養(yǎng)基為添加有0.1mg/L亞精胺的1/2DKW培養(yǎng)基。實施例2一種通過花藥培養(yǎng)獲得烏桕再生植株的方法，如圖1所示，包括如下步驟：(1)外植體的選擇經(jīng)顯微鏡鏡檢，選取小孢子處于單核中期的烏桕花藥所對應(yīng)的花序用于后續(xù)培養(yǎng)；(2)外植體的低溫預(yù)處理將花序裝于自封塑料袋內(nèi)置于5℃冰箱進行低溫預(yù)處理24h；(3)外植體的表面消毒將經(jīng)過低溫預(yù)處理后的花序經(jīng)流水沖洗30min后置于無菌操作臺中用無菌水沖洗5遍；再采用75％的乙醇消毒20s，無菌水沖洗5遍，重復(fù)1次；接著，再用添加有1.0％(v/v)Tween的0.1％(w/v)的升汞消毒120s，最后用無菌水再沖洗8遍；(4)愈傷組織誘導培養(yǎng)濾紙吸干步驟(3)中消毒后花序表面的水分，于無菌操作臺中借助尖頭鑷子剝?nèi)』ㄋ?，接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，放置于光照周期為8/16(光照/黑暗),光照強度(2000-2500lx)，溫度為(24±1)℃的恒溫培養(yǎng)室，經(jīng)過4周的培養(yǎng)，獲得淡綠色的花藥愈傷組織，愈傷組織的誘導率高達100％；其中愈傷組織的誘導培養(yǎng)基為添加有3.0mg/LTDZ和3.0mg/LIAA的DKW培養(yǎng)基；(5)愈傷組織的增殖培養(yǎng)將步驟(4)中將誘導出的直徑為6mm的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基中進行愈傷組織的增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)5周后愈傷組織的增殖效率最高達6.8，其中增殖培養(yǎng)基為添加有0.5mg/LTDZ和2.0mg/LIAA的DKW培養(yǎng)基；(6)愈傷組織的分化將增殖后的愈傷組織切成切塊，轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上，于光照周期為16/8(光照/黑暗)，光照強度(2500-3000lx)，溫度為(26±1)℃的恒溫培養(yǎng)室中，進行愈傷組織的分化；經(jīng)過3周的光照培養(yǎng)，93.2％的愈傷組織分化出不定芽點，其中分化培養(yǎng)基為添加有0.5mg/LTDZ和0.5mg/LZT的DKW培養(yǎng)基；(7)不定芽的伸長待不定芽長至1.0cm后，將帶有不定芽叢的愈傷組織轉(zhuǎn)接于不定芽伸長培養(yǎng)基中進行不定芽的伸長培養(yǎng)并獲取相應(yīng)烏桕幼苗，其中不定芽伸長培養(yǎng)基為添加有0.2mg/LZT的1/2DKW培養(yǎng)基；(8)不定芽的生根光照培養(yǎng)2周后，將伸長的烏桕不定芽轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，1個月后獲得根系健壯的烏桕再生植株，其中生根培養(yǎng)基為添加有2.0mg/L亞精胺的1/2DKW培養(yǎng)基。實施例3一種通過花藥培養(yǎng)獲得烏桕再生植株的方法，如圖1所示，包括如下步驟：(1)外植體的選擇經(jīng)顯微鏡鏡檢，選取小孢子處于單核中期的烏桕花藥所對應(yīng)的花序用于后續(xù)培養(yǎng)；(2)外植體的低溫預(yù)處理將花序裝于自封塑料袋內(nèi)置于4℃冰箱進行低溫預(yù)處理12h；(3)外植體的表面消毒將經(jīng)過低溫預(yù)處理后的花序經(jīng)流水沖洗25min后置于無菌操作臺中用無菌水沖洗4遍；再采用73％的乙醇消毒18s，無菌水沖洗4遍，重復(fù)1次；接著，再用添加有0.8％(v/v)Tween的0.1％(w/v)的升汞消毒100s，最后用無菌水再沖洗6遍；(4)愈傷組織誘導培養(yǎng)濾紙吸干步驟(3)中消毒后花序表面的水分，于無菌操作臺中借助尖頭鑷子剝?nèi)』ㄋ?，接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，其中愈傷組織的誘導培養(yǎng)基為添加有1.0mg/LTDZ和2.0mg/LIAA的DKW培養(yǎng)基；(5)愈傷組織的增殖培養(yǎng)將步驟(4)中將誘導出的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基中進行愈傷組織的增殖培養(yǎng)，其中增殖培養(yǎng)基為添加有0.3mg/LTDZ和1.5mg/LIAA的DKW培養(yǎng)基；(6)愈傷組織的分化將增殖后的愈傷組織切成切塊，轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上，其中分化培養(yǎng)基為添加有0.3mg/LTDZ和0.3mg/LZT的DKW培養(yǎng)基；(7)不定芽的伸長待不定芽長至0.7cm后，將帶有不定芽叢的愈傷組織轉(zhuǎn)接于不定芽伸長培養(yǎng)基中進行不定芽的伸長培養(yǎng)并獲取相應(yīng)烏桕幼苗，其中不定芽伸長培養(yǎng)基為添加有0.1mg/LZT的1/2DKW培養(yǎng)基；(8)不定芽的生根光照培養(yǎng)1.5周后，將伸長的烏桕不定芽轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，1個月后獲得根系健壯的烏桕再生植株，其中生根培養(yǎng)基為添加有1.0mg/L亞精胺的1/2DKW培養(yǎng)基。此外，上述花藥培養(yǎng)過程中采用的培養(yǎng)基種類以及相應(yīng)額外添加的植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度均經(jīng)過一定的實驗研究探究，其主要研究過程及結(jié)果如下：(1)不同濃度TDZ、IAA及培養(yǎng)基類型對烏桕花藥愈傷組織誘導和增殖的影響將經(jīng)表面消毒后的外植體接種于添加有不同濃度TDZ和IAA的培養(yǎng)基中進行愈傷組織的誘導和增殖，培養(yǎng)條件為：溫度(24±1℃)，光照強度2000lx,光照時間為8h/d；培養(yǎng)30d后，統(tǒng)計愈傷組織的誘導率及愈傷組織的長勢(表1)；表1TDZ與IAA結(jié)合使用對烏桕花藥愈傷組織誘導的影響從表1可知，不同濃度TDZ和IAA組合使用對烏桕花藥愈傷組織誘導率和長勢具有顯著的影響；將花藥接種于添加有1.0mg/LTDZ和2.0mg/LIAA的DKW培養(yǎng)基上，愈傷組織的誘導率高達100％，且愈傷組織為綠色，質(zhì)地疏松，利于后期的增殖和分化研究；(2)不同種類基本培養(yǎng)基類型對烏桕花藥愈傷組織誘導分化的影響在上述愈傷組織誘導的基礎(chǔ)上，進一步測試不同種類基本培養(yǎng)基類型對烏桕花藥愈傷組織誘導的影響，即將上述消毒后的花藥接種于添加有1.0mg/LTDZ和2.0mg/LIAA的不同類型基本培養(yǎng)基(MS、WPM、DKW和B5)上進行愈傷組織的誘導；表2培養(yǎng)基類型對烏桕花藥愈傷組織誘導的影響研究發(fā)現(xiàn)(表2)，培養(yǎng)基類型對烏桕花藥愈傷組織的誘導分化具有顯著影響，在所測試的4種類型培養(yǎng)基中，DKW基本培養(yǎng)基最有利于烏桕花藥愈傷組織的誘導，B5最不利于愈傷組織的誘導；(3)不同濃度TDZ和IAA對愈傷組織增殖的影響在愈傷組織誘導分化的基礎(chǔ)上，進一步測試TDZ和IAA濃度對愈傷組織增殖的影響，研究發(fā)現(xiàn)(表3)，通過調(diào)整TDZ和IAA的濃度，對愈傷組織的增殖系數(shù)及長勢同樣具有明顯的影響；將誘導出愈傷組織的花藥轉(zhuǎn)接于添加有0.3mg/LTDZ和1.5mg/LIAA的培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，愈傷組織質(zhì)地疏松，顏色脆綠，利于后期的分化，且愈傷組織的增殖系數(shù)高達6.8；表3不同濃度TDZ和IAA結(jié)合使用對花藥愈傷組織增殖的影響(4)不同濃度TDZ和ZT對烏桕花藥愈傷組織分化的影響將增殖后的愈傷組織切成0.1cm2大小的切塊，接種于添加有不同濃度TDZ和ZT的培養(yǎng)基中進行愈傷組織的分化研究；培養(yǎng)條件為：溫度(26±1℃)，光照強度3000lx，光照時間為16h/d；培養(yǎng)30d后，統(tǒng)計愈傷組織的分化率(表4)；表4不同濃度TDZ和ZT對烏桕花藥愈傷組織分化的影響研究結(jié)果表明，TDZ和ZT對烏桕花藥愈傷組織的分化具有明顯的影響；低濃度的TDZ和ZT更有利于愈傷組織的分化，添加有0.3mg/LTDZ和0.3mg/LZT時，愈傷組織的分化率最高達到93.2％；(5)不同濃度ZT對烏桕花藥愈傷組織分化形成的不定芽伸長的影響將分化出不定芽點的愈傷組織轉(zhuǎn)接于添加有不同濃度ZT的培養(yǎng)基中進行不定芽的伸長研究；培養(yǎng)條件為：溫度(26±1℃)，光照強度3000lx,光照時間為16h/d。培養(yǎng)30d后，統(tǒng)計不定芽的伸長情況(表5)；表5不同濃度ZT對烏桕花藥不定芽伸長的影響ZT(mg/L)芽伸長率(％)平均芽長(cm)0.0536.81.80.191.73.30.251.10.9研究結(jié)果表明，低濃度的ZT對烏桕花藥不定芽的伸長率及平均芽長具有重要的影響，培養(yǎng)基中添加有0.1mg/LZT時，不定芽伸長率高達91.7％，平均芽長為3.3cm；(6)不同濃度亞精胺對烏桕花藥不定芽生根的影響光照培養(yǎng)2周后，將伸長的不定芽轉(zhuǎn)接于添加有不同濃度亞精胺的1/2DKW培養(yǎng)基中進行不定芽的生根研究；培養(yǎng)條件為：溫度(26±1℃)，光照強度3000lx,光照時間為16h/d。培養(yǎng)30d后，統(tǒng)計不定芽的伸長情況(表6)；表6不同濃度亞精胺對烏桕花藥不定芽生根的影響研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加亞精胺有利于提高烏桕花藥不定芽的生根率和縮短不定根的形成時間；當培養(yǎng)基中添加1.0mg/L亞精胺時，不定芽生根率高達100％，平均每個外植體產(chǎn)生5.9個不定根，且平均根長為2.9cm，根粗壯有利于后期的移栽。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3