一種櫻桃苗超低溫脫毒處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及果樹病毒防治技術(shù)領(lǐng)域，具體屬于一種櫻桃苗超低溫脫毒處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002]櫻桃是我國當(dāng)前調(diào)整果樹種植結(jié)構(gòu)、實現(xiàn)農(nóng)民增收的首選樹種。病毒病嚴(yán)重影響甜櫻桃的產(chǎn)量和質(zhì)量，已成為限制我國櫻桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙之一。李屬壞死環(huán)斑病毒是發(fā)生最普遍、危害較嚴(yán)重的核果類果樹病毒，可導(dǎo)致樹體衰退、葉片黃化或壞死、花期推遲、果實成熟期推后或減產(chǎn)，嚴(yán)重時絕產(chǎn)。據(jù)調(diào)查，我國甜櫻桃栽培區(qū)域內(nèi)，PNRSV普遍發(fā)生，山東、遼寧、北京等地均檢測到PNRSV感染。宗曉娟等對山東甜櫻桃生產(chǎn)園病毒病RT-PCR鑒定顯示，PNRSV帶毒率為46.8%。
[0003]現(xiàn)有采用超低溫處理技術(shù)，超低溫技術(shù)是指在_80°C以下的超低溫條件下保存植物種質(zhì)的一整套生物技術(shù)。由于液氮溫度可達(dá)_196°C，且經(jīng)濟(jì)方便，目前普遍用于植物的超低溫保存。目前，超低溫保存作為一種新的脫毒技術(shù)而備受人們關(guān)注，并已經(jīng)在多種植物中得到證實。1997年，Brison等用超低溫保存結(jié)合莖尖離體培養(yǎng)，成功去除了李屬根狀莖上的李痘病毒，脫毒率達(dá)到50%，比單純的莖尖培養(yǎng)的脫毒率多了 2倍多。
[0004]但傳統(tǒng)的莖尖培養(yǎng)及熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒效率極低。代紅艷等證明甜櫻桃試管苗微莖尖培養(yǎng)不能有效脫除PNRSV。(2)操作復(fù)雜，效率低下。傳統(tǒng)莖尖培養(yǎng)要求剝?nèi)∏o尖小于0.5mm，操作難度大，成苗效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供了一種櫻桃苗超低溫脫毒處理方法，克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，玻璃化法超低溫保存可脫除櫻桃苗病毒，脫毒率為90.6 %。而常規(guī)的莖尖培養(yǎng)，脫毒率僅為63.5%。不僅脫毒率高，而且莖尖取材大、操作簡單方便。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]一種櫻桃苗超低溫脫毒處理方法，包括步驟如下:1)取苗采取壓枝的方法來取得櫻桃苗；
[0008]2)切下取得櫻桃苗單芽長約Imm的莖尖；
[0009]3)紅芽芋莖尖在附加固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3d，組培苗于溫度26?42°C、光強1000-20001x條件下培養(yǎng)30?35天;
[0010]4)預(yù)培養(yǎng)、裝載:將步驟3)熱處理后的組培苗在超凈工作臺剝?nèi)?2mm的莖尖組織，將莖尖組織預(yù)培養(yǎng)3?5天，然后經(jīng)室溫裝載20?30min ;
[0011]5)玻璃化:裝載后的莖尖組織轉(zhuǎn)至冷凍保護(hù)溶液PVS2中冰浴處理60?90min，
[0012]6)冷凍:玻璃化處理后的莖尖組織分裝至凍存管中，將冷凍管迅速投入液氮中冷凍20?24h ；
[0013]7)冷凍后進(jìn)行解凍，然后進(jìn)行恢復(fù)處理1-2次，然后進(jìn)行誘導(dǎo)成苗；
[0014]8)誘導(dǎo)成苗:恢復(fù)處理后的莖尖組織轉(zhuǎn)至MS增苗培養(yǎng)基中先暗培養(yǎng)3?7天，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，成苗后繼代培養(yǎng)，
[0015]9)病毒檢測:采用RT-PCR檢測待測苗，篩選出脫毒苗，對含有該病毒的植株，撥取莖尖做初代培養(yǎng)，繼代擴(kuò)繁4次以后，撥取1_左右的莖尖，利用玻璃化超低溫液氮處理技術(shù)對SMYEV進(jìn)行脫除，在病毒脫除過程中，裝載處理為20°C，Ih ;玻璃化處理為0°C，2h ;液氮處理Ih后，進(jìn)行45°C水浴2min。
[0016]所述的步驟4)將莖尖組織于添加0.2?0.3mol/L蔗糖濃度的液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2天，將預(yù)培養(yǎng)后的莖尖組織在裝載液中于室溫下處理28?30min，所述的裝載液為添加I?3mol/L的甘油和0.3?0.5mol/L蔗糖濃度的液體培養(yǎng)基。
[0017]所述的所述的步驟6)，冷凍步驟從(TC降到-30°C，-35°C或_40°C，每分鐘降溫15°C，隨即浸入液氮，或者以此種速度連續(xù)降到_196°C。
[0018]所述的所述的步驟6)，冷凍步驟從(TC降到-30°C，-35°C或_40°C，每分鐘降溫15°C，之后恒溫預(yù)凍I小時，然后浸入液氮，或者以此種速度連續(xù)降到_196°C。
[0019]與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:
[0020]本發(fā)明通過玻璃化法超低溫保存可脫除櫻桃苗病毒，脫毒率為90.6%，而常規(guī)的莖尖培養(yǎng)，脫毒率僅為63.5%。因此，采用本發(fā)明的玻璃化法超低溫保存脫毒法對櫻桃苗進(jìn)行脫毒，不僅脫毒率高，而且莖尖取材大、操作簡單方便；超低溫冷凍和復(fù)蘇過程簡化，省時省力、效率高、脫毒徹底、成本低、對儀器設(shè)備要求不高。
【具體實施方式】
[0021]實施例1，一種櫻桃苗超低溫脫毒處理方法，包括步驟如下:1)取苗采取壓枝的方法來取得櫻桃苗；
[0022]2)切下取得櫻桃苗單芽長約Imm的莖尖；
[0023]3)紅芽芋莖尖在附加固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3d，組培苗于溫度26?42°C、光強1000-20001x條件下培養(yǎng)30?35天;
[0024]4)預(yù)培養(yǎng)、裝載:將步驟3)熱處理后的組培苗在超凈工作臺剝?nèi)?2mm的莖尖組織，將莖尖組織預(yù)培養(yǎng)3?5天，然后經(jīng)室溫裝載20?30min ;
[0025]5)玻璃化:裝載后的莖尖組織轉(zhuǎn)至冷凍保護(hù)溶液PVS2中冰浴處理60?90min，
[0026]6)冷凍:玻璃化處理后的莖尖組織分裝至凍存管中，將冷凍管迅速投入液氮中冷凍20?24h ；
[0027]7)冷凍后進(jìn)行解凍，然后進(jìn)行恢復(fù)處理1-2次，然后進(jìn)行誘導(dǎo)成苗；
[0028]8)誘導(dǎo)成苗:恢復(fù)處理后的莖尖組織轉(zhuǎn)至MS增苗培養(yǎng)基中先暗培養(yǎng)3?7天，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，成苗后繼代培養(yǎng)，
[0029]9)病毒檢測:采用RT-PCR檢測待測苗，篩選出脫毒苗，對含有該病毒的植株，撥取莖尖做初代培養(yǎng)，繼代擴(kuò)繁4次以后，撥取1_左右的莖尖，利用玻璃化超低溫液氮處理技術(shù)對SMYEV進(jìn)行脫除，在病毒脫除過程中，裝載處理為20°C，Ih ;玻璃化處理為0°C，2h ;液氮處理Ih后，進(jìn)行45°C水浴2min。
[0030]所述的步驟4)將莖尖組織于添加0.2?0.3mol/L蔗糖濃度的液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2天，將預(yù)培養(yǎng)后的莖尖組織在裝載液中于室溫下處理28?30min，所述的裝載液為添加I?3mol/L的甘油和0.3?0.5mol/L蔗糖濃度的液體培養(yǎng)基。
[0031]所述的所述的步驟6)，冷凍步驟從(TC降到-30°C，-35°C或_40°C，每分鐘降溫15°C，隨即浸入液氮，或者以此種速度連續(xù)降到_196°C。
[0032]實施例2，其其它步驟相同，其中所述的步驟6)，冷凍步驟從0°C降到_30°C，_35°C或-40°C，每分鐘降溫15°C，之后恒溫預(yù)凍I小時，然后浸入液氮，或者以此種速度連續(xù)降到-196。。。
[0033]通過玻璃化法超低溫保存可脫除櫻桃苗病毒，脫毒率為90.6%，而常規(guī)的莖尖培養(yǎng)，脫毒率僅為63.5%。因此，采用本發(fā)明的玻璃化法超低溫保存脫毒法對櫻桃苗進(jìn)行脫毒，不僅脫毒率高，而且莖尖取材大、操作簡單方便；超低溫冷凍和復(fù)蘇過程簡化，省時省力、效率高、脫毒徹底、成本低、對儀器設(shè)備要求不高。
[0034]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
【主權(quán)項】
1.一種櫻桃苗超低溫脫毒處理方法，其特征在于:包括步驟如下:1)取苗采取壓枝的方法來取得櫻桃苗； 2)切下取得櫻桃苗單芽長約Imm的莖尖； 3)紅芽芋莖尖在附加固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3d，組培苗于溫度26?42°C、光強1000-20001x條件下培養(yǎng)30?35天; 4)預(yù)培養(yǎng)、裝載:將步驟3)熱處理后的組培苗在超凈工作臺剝?nèi)?2_的莖尖組織，將莖尖組織預(yù)培養(yǎng)3?5天，然后經(jīng)室溫裝載20?30min ； 5)玻璃化:裝載后的莖尖組織轉(zhuǎn)至冷凍保護(hù)溶液PVS2中冰浴處理60?90min， 6)冷凍:玻璃化處理后的莖尖組織分裝至凍存管中，將冷凍管迅速投入液氮中冷凍20 ?24h ； 7)冷凍后進(jìn)行解凍，然后進(jìn)行恢復(fù)處理1-2次，然后進(jìn)行誘導(dǎo)成苗； 8)誘導(dǎo)成苗:恢復(fù)處理后的莖尖組織轉(zhuǎn)至MS增苗培養(yǎng)基中先暗培養(yǎng)3?7天，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，成苗后繼代培養(yǎng)， 9)病毒檢測:采用RT-PCR檢測待測苗，篩選出脫毒苗，對含有該病毒的植株，撥取莖尖做初代培養(yǎng)，繼代擴(kuò)繁4次以后，撥取1_左右的莖尖，利用玻璃化超低溫液氮處理技術(shù)對SMYEV進(jìn)行脫除，在病毒脫除過程中，裝載處理為20°C，Ih ;玻璃化處理為0°C，2h ;液氮處理Ih后，進(jìn)行45°C水浴2min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的櫻桃苗超低溫脫毒處理方法，其特征在于:所述的步驟4)將莖尖組織于添加0.2?0.3mol/L蔗糖濃度的液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2天，將預(yù)培養(yǎng)后的莖尖組織在裝載液中于室溫下處理28?30min，所述的裝載液為添加I?3mol/L的甘油和0.3?0.5mol/L蔗糖濃度的液體培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的櫻桃苗超低溫脫毒處理方法，其特征在于:所述的所述的步驟6)，冷凍步驟從0°C降到_30°C，_35°C或_40°C，每分鐘降溫15°C，隨即浸入液氮，或者以此種速度連續(xù)降到-196 °C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的櫻桃苗超低溫脫毒處理方法，其特征在于:所述的所述的步驟6)，冷凍步驟從0°C降到_30°C，_35°C或-40°C，每分鐘降溫15°C，之后恒溫預(yù)凍I小時，然后浸入液氮，或者以此種速度連續(xù)降到_196°C。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種櫻桃苗超低溫脫毒處理方法，包括步驟如下1)取苗采取壓枝的方法來取得櫻桃苗，2)切下取得櫻桃苗單芽長約1mm的莖尖，3)紅芽芋莖尖在附加固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3d，組培苗于溫度26～42℃、光強1000-2000lx條件下培養(yǎng)30～35天；4)預(yù)培養(yǎng)、裝載，5)玻璃化，6)冷凍，7)冷凍后進(jìn)行解凍，然后進(jìn)行恢復(fù)處理1-2次，然后進(jìn)行誘導(dǎo)成苗，8)誘導(dǎo)成苗：9)病毒檢測本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，玻璃化法超低溫保存可脫除櫻桃苗病毒，脫毒率為90.6％。而常規(guī)的莖尖培養(yǎng)，脫毒率僅為63.5％。不僅脫毒率高，而且莖尖取材大、操作簡單方便。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104823851
【申請?zhí)枴緾N201510229959
【發(fā)明人】訾慶順
【申請人】鳳陽金小崗農(nóng)林科技產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月7日