一種篩選橡膠樹增產(chǎn)刺激劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種篩選橡膠樹增產(chǎn)刺激劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell-Arg)屬大戟科橡膠屬，是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作 物。橡膠樹樹皮被定期開割，膠乳（細(xì)胞質(zhì)）從割斷處排出，經(jīng)加工成為天然橡膠。目前橡 膠樹所產(chǎn)的天然橡膠占全世界天然橡膠總產(chǎn)量的99%以上，與石油、煤炭、鐵礦石并列為四 大工業(yè)原料，是重要的戰(zhàn)略物資。
[0003] 應(yīng)用化學(xué)藥劑調(diào)控技術(shù)促進(jìn)橡膠樹的產(chǎn)膠和排膠技術(shù)，是提高橡膠樹生產(chǎn)力重要 技術(shù)，也是橡膠生產(chǎn)和理論研宄的重要內(nèi)容。傳統(tǒng)的橡膠樹增產(chǎn)刺激劑篩選方法是將藥劑 涂抹于成齡樹皮，再對(duì)膠樹進(jìn)行割膠測(cè)產(chǎn)，以確定該藥劑的增產(chǎn)效果。橡膠樹屬高大喬木， 每畝種植約30株，其經(jīng)濟(jì)壽命長達(dá)40年。該方法存在如下顯著缺點(diǎn)：①占地面積大，試驗(yàn) 成本高。在驗(yàn)證化學(xué)藥劑對(duì)橡膠樹的增產(chǎn)效果試驗(yàn)時(shí)，需要大面積的成齡樹林段，需耗費(fèi)大 量人力物力，導(dǎo)致試驗(yàn)成本過高。②一些藥劑可能對(duì)膠樹有傷害作用，會(huì)導(dǎo)致膠樹損失經(jīng)濟(jì) 價(jià)值；③環(huán)境因素難控制。試驗(yàn)在大田中進(jìn)行，易受到季節(jié)、氣候、植株間差異等環(huán)境因素的 影響，往往造成試驗(yàn)重復(fù)性不好。④試驗(yàn)周期長。橡膠樹從種植至能夠開割，至少需7年時(shí) 間。這些缺點(diǎn)限制了橡膠樹化學(xué)藥劑規(guī)?；Y選。迄今為止僅對(duì)茉莉酸、乙烯利等少數(shù)幾 種化學(xué)試劑進(jìn)行了割膠增產(chǎn)效果試驗(yàn)，而對(duì)于大量其它化學(xué)藥劑的增產(chǎn)效果由于試驗(yàn)條件 所限尚未能得到驗(yàn)證，制約了橡膠樹增產(chǎn)刺激劑篩選的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種篩選橡膠樹增產(chǎn)刺激劑的方法，使得所述 方法能夠縮短篩選時(shí)間、簡(jiǎn)化篩選條件，并使得篩選結(jié)果重復(fù)性好。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] -種篩選橡膠樹增產(chǎn)刺激劑的方法，包括：
[0007] 以橡膠樹古銅期芽條的莖段或葉柄為外植體，消毒后將外植體切段分別接種于對(duì) 照培養(yǎng)基和添加有待檢測(cè)化學(xué)試劑的篩選培養(yǎng)基，24-28°C暗條件下培養(yǎng)60-100d，然后統(tǒng) 計(jì)對(duì)照培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基愈傷組織中乳管細(xì)胞分化頻率，以篩選培養(yǎng)基愈傷組織中乳管 細(xì)胞分化頻率顯著高于對(duì)照培養(yǎng)基愈傷組織中乳管細(xì)胞分化頻率為判斷標(biāo)準(zhǔn)，篩選出可以 作為橡膠樹增產(chǎn)刺激劑的待檢測(cè)化學(xué)試劑；
[0008] 其中，所述對(duì)照培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基附加2, 4-0、6-84、嫩4、蔗糖、植物凝膠，？!1值為 5. 8-6. 2 ;所述篩選培養(yǎng)基為對(duì)照培養(yǎng)基附加待檢測(cè)化學(xué)試劑。
[0009] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有橡膠增產(chǎn)刺激劑篩選方法存在耗時(shí)長、成本高、重復(fù)性差等缺陷， 通過細(xì)胞工程技術(shù)，以特定的培養(yǎng)基進(jìn)行定向乳管細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后加入待檢測(cè)的化 學(xué)試劑來影響這種誘導(dǎo)培養(yǎng)效果，以其分化頻率作為判斷標(biāo)準(zhǔn)來快速篩選橡膠增產(chǎn)刺激 劑。
[0010] 作為優(yōu)選，所述對(duì)照培養(yǎng)基中2, 4-D、6-BA、NAA、蔗糖、植物凝膠濃度為：2, 4-D l-5mg/L，6-BA 0· 5-2mg/L，NAA 0· 5-4mg/L，蔗糖 30-50g/L，植物凝膠 2. 2-2. 5g/L。在本發(fā) 明的一些實(shí)施方式中，所述2, 4-D的濃度可以為lmg/L、2mg/L、3mg/L或5mg/L ;所述6-BA 的濃度可以為〇· 5mg/L、lmg/L、l. 5mg/L或2mg/L ;所述NAA的濃度可以為0· 5mg/L、lmg/L、 3mg/L或4mg/L ;所述鹿糖的濃度可以為30g/L、40g/L或50g/L ;所述植物凝膠的濃度可以 為 2. 2g/L、2. 3g/L、2. 4g/L 或 2. 5g/L。
[0011] 作為優(yōu)選，所述篩選培養(yǎng)基中待測(cè)化學(xué)試劑的濃度為〇.5-20mg/L，更優(yōu)選為 0. 5-2mg/L〇
[0012] 作為優(yōu)選，所述統(tǒng)計(jì)乳管細(xì)胞分化頻率通過石蠟制片鏡檢統(tǒng)計(jì)。
[0013] 進(jìn)一步優(yōu)選，所述石蠟制片具體步驟為：
[0014] 愈傷組織固定于FAA溶液，酒精系列脫水，溴-碘染色液染色，石蠟包埋制片。
[0015] 更優(yōu)選地，所述石蠟制片具體步驟為：
[0016] 愈傷組織固定于FAA溶液，室溫下固定48-72h，然后依次于50%、60%、70%、 80%、90%、95%、100%、100%酒精中脫水111，60°0條件下溴-碘染色液染色36-4211，染色 后愈傷組織用石蠟包埋，切片機(jī)切成8-12um薄片，將薄片粘貼于干凈的載玻片上，二甲苯 去蠟，固綠復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片。
[0017] 作為優(yōu)選，所述橡膠樹品種為熱研7-33-97或RRM600。
[0018] 以現(xiàn)有的橡膠增產(chǎn)刺激劑茉莉酸、乙烯利和非橡膠增產(chǎn)刺激劑赤霉素為檢測(cè)對(duì) 象，按照本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，添加有茉莉酸、乙烯利的篩選培養(yǎng)基的愈傷組 織，其乳管細(xì)胞分化頻率顯著高于對(duì)照培養(yǎng)基，而添加有赤霉素的篩選培養(yǎng)基的愈傷組織 其乳管細(xì)胞分化頻率與對(duì)照培養(yǎng)基無顯著差異，且篩選結(jié)果的重復(fù)性較好。上述結(jié)果表明， 本發(fā)明方法具有較高的重復(fù)性、準(zhǔn)確性。
[0019] 利用本發(fā)明方法篩選橡膠樹增產(chǎn)刺激劑具有明顯優(yōu)勢(shì)：1、愈傷組織的生長條件 是可控的，其培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度、溫度、營養(yǎng)成分等在室內(nèi)條件下得到控制，因此不受環(huán)境 因素的影響，篩選試驗(yàn)重復(fù)性好。2、篩選試驗(yàn)在室內(nèi)進(jìn)行，操作方便，不需占用大面積田間 材料，試驗(yàn)成本低，節(jié)省大量人力物力。3、愈傷組織一般生長周期為2-3個(gè)月，在該周期內(nèi) 檢測(cè)所篩選的化學(xué)藥劑對(duì)愈傷組織中乳管細(xì)胞分化的影響，從而快速知道該藥劑的刺激效 果，大大縮短試驗(yàn)周期。與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明能大大提高橡膠樹增產(chǎn)刺激劑的篩選效 率，可用于橡膠樹增產(chǎn)刺激劑的規(guī)?；Y選。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 本發(fā)明實(shí)施例公開了一種篩選橡膠樹增產(chǎn)刺激劑的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借 鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域 技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí) 施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的產(chǎn)品 及方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0021] 依照本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
，本發(fā)明所述對(duì)照培養(yǎng)基和篩