用于生成治療性蛋白質(zhì)的植物的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年3月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/790, 850和2012年 11月1日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/721，194的優(yōu)先權(quán)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本文涉及用于制備植物的材料和方法，所述植物適用于生成用于給予人和動(dòng)物的 治療性蛋白質(zhì)，具體而言是通過(guò)在編碼木糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的基因中進(jìn)行靶向 敲除。本文還涉及缺失木糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性或者具有降低的木糖基轉(zhuǎn)移酶 和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的煙草（Nicotiana)品種。
【背景技術(shù)】
[0004] 與動(dòng)物糖蛋白不同，植物糖蛋白具有0 (1，2)木糖基和核心-a (1，3)巖藻糖基殘 基，且缺少末端0 (1，4)半乳糖基殘基和唾液酸。0-1，2-木糖基轉(zhuǎn)移酶（"XylT"）催化 木糖從UDP-木糖轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)連接的N-聚糖的核心連接的甘露糖。該酶是植物和 一些非脊椎動(dòng)物物種特有的，且不存在于人或其他脊椎動(dòng)物中。a -1. 3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 ("FucT"）催化巖藻糖從⑶P-巖藻糖轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)連接的N-聚糖的核心|3 -連接的N-乙 酰葡糖胺（GlcNAc)。該酶發(fā)現(xiàn)于植物和動(dòng)物物種（包括人）中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本文提供了用于制備植物的材料和方法，所述植物特別用于生成適用于給予人和 動(dòng)物的治療性蛋白質(zhì)，具體而言是通過(guò)在編碼木糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的基因中進(jìn) 行靶向敲除。本文還提供了煙草（Nicotiana)品種，其與對(duì)照煙草品種相比缺失木糖基轉(zhuǎn) 移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性或者具有降低的木糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
[0006] 本發(fā)明至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)，即可通過(guò)敲除編碼木糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn) 移酶的基因的所有拷貝來(lái)制備適用于生成用于給予人和動(dòng)物的蛋白質(zhì)的植物。本發(fā)明 還至少部分基于缺失木糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的本賽姆氏煙草（Nicotiana benthamiana)品種的開發(fā)。能夠制備缺失木糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的可存活植 物可促進(jìn)用于給予人和動(dòng)物的治療性蛋白質(zhì)的生成，其與具有木糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn) 移酶活性的植物中生成的蛋白質(zhì)相比免疫原性或過(guò)敏性反應(yīng)的發(fā)生率較低。
[0007] 此外，本發(fā)明還至少部分基于：可通過(guò)使編碼木糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的 基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝敲除或突變來(lái)制備適用于生成用于給予人和動(dòng)物的蛋白質(zhì)的植物， 從而使基因的轉(zhuǎn)錄和/或所編碼多肽的翻譯與相應(yīng)野生型植物或植物細(xì)胞相比下降的發(fā) 現(xiàn)，并且至少部分基于具有下降的木糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的本賽姆氏煙草品 種的開發(fā)。能夠制備具有下降的木糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的可存活植物也可促 進(jìn)用于給予人和動(dòng)物的治療性蛋白質(zhì)的生成。植物生成的蛋白質(zhì)中聚糖水平的降低可從該 蛋白質(zhì)去除一些植物特有的特性。與不具有下降的木糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的 植物所生成的蛋白質(zhì)相比，這類蛋白質(zhì)具有較低的免疫原性或過(guò)敏性反應(yīng)發(fā)生率。與不具 有降低的聚糖水平的蛋白質(zhì)相比，這類蛋白質(zhì)還具有改善的功能活性。
[0008] 在一個(gè)方面，本文涉及一種煙草植物或植物細(xì)胞，其在多個(gè)XylT等位基因的每一 個(gè)中都具有突變且在多個(gè)FucT等位基因的每一個(gè)中都具有突變，其中該植物或植物細(xì)胞 在該植物或植物細(xì)胞所生成的糖蛋白的N-聚糖結(jié)構(gòu)上不生成可檢測(cè)水平的0 -1，2-木糖 基-糖或核心a-1，3-巖藻糖基-糖。該突變可以位于SEQ ID NO: 1、2或3中所列的一條 或多條序列處。該突變可以由一種或多種稀切核酸內(nèi)切酶（rare-cutting endonuclease) 誘導(dǎo)。該一種或多種稀切核酸內(nèi)切酶可以是轉(zhuǎn)錄激活因子樣（TAL)效應(yīng)子核酸內(nèi)切酶。該 TAL效應(yīng)子核酸內(nèi)切酶各自可結(jié)合SEQ ID N0:45-63中任一項(xiàng)所列序列。該植物或植物細(xì) 胞可包含編碼異源多肽的核酸。該突變各自可以是多于一個(gè)的核苷酸的缺失。多個(gè)XylT 等位基因和多個(gè)FucT等位基因中的每一個(gè)都可以具有內(nèi)源核酸序列的缺失且不包含任何 外源核酸。該植物或植物細(xì)胞可以是本賽姆氏煙草植物或植物細(xì)胞。
[0009] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種生成多肽的方法。該方法可包括（a)提供煙草植 物或植物細(xì)胞，其在多個(gè)XylT等位基因的每一個(gè)中都具有突變且在多個(gè)FucT等位基因的 每一個(gè)中都具有突變，該植物或植物細(xì)胞在該植物或植物細(xì)胞所生成的糖蛋白的N-聚糖 結(jié)構(gòu)上不生成可檢測(cè)水平的0 -1，2-木糖基-糖和核心a -1，3-巖藻糖基-糖，且該植物 或植物細(xì)胞含有核酸，該核酸包含（i)編碼多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地 連接于（ii)植物可表達(dá)啟動(dòng)子，和（iii)涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的序列，其中所述多 肽對(duì)所述植物是異源的；以及（b)在足以生成異源多肽的條件下使該植物或植物細(xì)胞生長(zhǎng) 足以生成異源多肽的時(shí)間。該方法還可包括從所述植物或植物細(xì)胞中分離該異源多肽。該 突變可已被一種或多種稀切核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)。該一種或多種稀切核酸內(nèi)切酶可以是TAL效 應(yīng)子核酸內(nèi)切酶。該TAL效應(yīng)子核酸內(nèi)切酶各自可結(jié)合SEQ ID N0:45-63中任一項(xiàng)所列序 列。
[0010] 在另一個(gè)方面，本文涉及一種制備煙草植物的方法，該煙草植物在多個(gè)XylT等位 基因的每一個(gè)中都具有突變且在多個(gè)FucT等位基因的每一個(gè)中都具有突變。該方法可包 括（a)使具有功能性XylT等位基因和功能性FucT等位基因的煙草植物細(xì)胞群體與靶向內(nèi) 源性XylT序列的一種或多種稀切核酸內(nèi)切酶和靶向內(nèi)源性FucT序列的一種或多種稀切核 酸內(nèi)切酶接觸，（b)從該群體中選擇特定細(xì)胞，其中多個(gè)XylT等位基因和多個(gè)FucT等位基 因已失活，以及（c)將所選植物細(xì)胞再生為煙草植物，其中該煙草植物在多個(gè)XylT等位基 因中含有突變且在多個(gè)FucT等位基因含有突變，且在該植物所生成的糖蛋白的N-聚糖結(jié) 構(gòu)上不生成可檢測(cè)水平的0-1，2-木糖基-糖或核心a-1，3-巖藻糖基-糖。該煙草植物 細(xì)胞可以是原生質(zhì)體。該方法可包括使用編碼一種或多種稀切核酸內(nèi)切酶的一種或多種載 體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。所述一種或多種稀切核酸內(nèi)切酶可以是TAL效應(yīng)子核酸內(nèi)切酶。該TAL 效應(yīng)子核酸內(nèi)切酶各自可靶向SEQ ID N0:45-63中任一項(xiàng)所列序列。該方法可包括向原生 質(zhì)體內(nèi)導(dǎo)入TAL效應(yīng)子核酸內(nèi)切酶蛋白。該方法還可包括培養(yǎng)原生質(zhì)體以生成植物株系。 該方法可包括從原生質(zhì)體中分離包含XylT基因座的至少部分或FucT基因座的至少部分的 基因組DNA。該煙草植物細(xì)胞可以是本賽姆氏煙草植物細(xì)胞。
[0011] 在另一個(gè)方面，本文涉及一種生成煙草植物的方法，該煙草植物在多個(gè)XylT等位 基因的每一個(gè)中都具有突變且在多個(gè)FucT等位基因的每一個(gè)中都具有突變。該方法可包 括（a)將在至少一個(gè)XylT等位基因中具有突變且在至少一個(gè)FucT等位基因中具有突變的 第一煙草植物與在至少一個(gè)XylT等位基因中具有突變且在至少一個(gè)FucT等位基因中具有 突變的第二煙草植物雜交以獲得后代，以及（b)從后代中選擇在多個(gè)XylT等位基因中具有 突變且在多個(gè)FucT等位基因中具有突變的煙草植物。該突變可以由一種或多種稀切核酸 內(nèi)切酶誘導(dǎo)。所述一種或多種稀切核酸內(nèi)切酶可以是TAL效應(yīng)子核酸內(nèi)切酶。所述TAL效 應(yīng)子核酸內(nèi)切酶各自可結(jié)合SEQ ID N0:45-63中任一項(xiàng)所列序列。該突變各自可以是多于 一個(gè)核苷酸的缺失。該后代可以是各所述等位基因上突變的純合子。
[0012] 本文還涉及一種煙草植物或植物細(xì)胞，其在一個(gè)或多個(gè)XylT等位基因上具有突 變且在一個(gè)或多個(gè)FucT等位基因上具有突變，其中，與不含有所述突變的相應(yīng)植物或植物 細(xì)胞相比，該植物或植物細(xì)胞中生成的糖蛋白的N-聚糖結(jié)構(gòu)上生成的0 -1，2-木糖基-糖 和核心a-1，3-巖藻糖基-糖的水平降低。該突變可位于SEQ ID NO: 1、2或3中所列的一 條或多條序列處。該突變可以由一種或多種稀切核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)。該一種或多種稀切核酸 內(nèi)切酶可以是轉(zhuǎn)錄激活因子樣（TAL)效應(yīng)子核酸內(nèi)切酶。該TAL效應(yīng)子核酸內(nèi)切酶各自可 結(jié)合SEQ ID N0:45-63中任一項(xiàng)所列序列。該植物或植物細(xì)胞可含有編碼異源多肽（如重 組多肽）的核酸。該突變各自可以是多于一個(gè)核苷酸的缺失。一個(gè)或多個(gè)XylT等位基因 和一個(gè)或多個(gè)FucT等位基因中的每一個(gè)都可以具有內(nèi)源核酸序列的缺失且不包含任何外 源核酸。該植物或植物細(xì)胞可以是本賽姆氏煙草植物或植物細(xì)胞。
[0013] 在另一個(gè)方面，本文涉及一種生成多肽的方法。該方法可包括（a)提供煙草植物 或植物細(xì)胞，其在一個(gè)或多個(gè)XylT等位基因中具有突變且在一個(gè)或多個(gè)FucT等位基因中 具有突變，其中，與不含有所述突變的相應(yīng)植物或植物細(xì)胞相比，該植物或植物細(xì)胞中生成 的糖蛋白的N-聚糖結(jié)構(gòu)上生成的0-1，2-木糖基-糖和核心a-1，3-巖藻糖基-糖的水 平降低，且該植物或植物細(xì)胞含有重組核酸，該重組核酸包含（i)編碼多肽的核苷酸序列， 所述核苷酸序列可操作地連接于（ii)植物可表達(dá)啟動(dòng)子，和（iii)涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷 酸化的序列，其中所述多肽對(duì)所述植物是異源的；以及（b)在足以生成異源多肽的條件下 使該植物或植物細(xì)胞生長(zhǎng)足以生成異源多肽的時(shí)間。該方法還可包括從所述植物或植物細(xì) 胞中分離該異源多肽。該突變可已被一種或多種稀切核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)。該一種或多種稀切 核酸內(nèi)切酶可以是TAL效應(yīng)子核酸內(nèi)切酶。該TAL效應(yīng)子核酸內(nèi)切酶各自可結(jié)合SEQ ID NO:45-63中任一項(xiàng)所列序列。
[0014] 在另一個(gè)方面，本文涉及一種制備煙草植物的方法，該煙草植物在一個(gè)或多個(gè) XylT等位基因中具有突變且在一個(gè)或多個(gè)FucT等位基因中具有突變。該方法可包括（a)使 具有功能性XylT等位基因和功能性FucT等位基因的煙草植物細(xì)胞群體與靶向內(nèi)源性XylT 序列的一種或多種稀切核酸內(nèi)切酶和靶向內(nèi)源性FucT序列的一種或多種稀切核酸內(nèi)切酶 接觸，（b)從該群體中選擇特定細(xì)胞，其中一個(gè)或多個(gè)XylT等位基因和一個(gè)或多個(gè)FucT等 位基因已失活，以及（c)將所選植物細(xì)胞再生為煙草植物，其中該煙草植物在一個(gè)或多個(gè) XylT等位基因中含有突變且在一個(gè)或多個(gè)FucT等位基因中含有突變，且與不含有所述突 變的植物相比，該煙草植物所生成的糖蛋白的N-聚糖結(jié)構(gòu)上生成的0 -1，2-木糖基-糖和 核心a-1，3-巖藻糖基-糖水平降低。該煙草植物細(xì)胞可以是原生質(zhì)體。該方法可包括使 用編碼一種或多種稀切核酸內(nèi)切酶的一種或多種載體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。該一種或多種稀切 核酸內(nèi)切酶可以是TAL效應(yīng)子核酸內(nèi)切酶。該TAL效應(yīng)子核酸內(nèi)切酶各自可靶向SEQ ID N0:45-63中任一項(xiàng)所列序列。該方法可包括向所述原生質(zhì)體內(nèi)導(dǎo)入TAL效應(yīng)子核酸內(nèi)切 酶。該方法還可包括培養(yǎng)所述原生質(zhì)體以生成植物株系。該方法可包括從原生質(zhì)體中分離 包含XylT基因座的至少部分或FucT基因座的至少部分的基因組DNA。該煙草植物細(xì)胞可 以是本賽姆氏煙草植物細(xì)胞。
[0015] 在另一個(gè)方面，本文涉及一種生成煙草植物的方法，該煙草植物在一個(gè)或多個(gè) XylT等位基因中具有突變且在一個(gè)或多個(gè)FucT等位基因中具有突變。該方法可包括（a) 將在至少一個(gè)XylT等位基因中含有突變且在至少一個(gè)FucT等位基因中含有突變的第一煙 草植物與在至少一個(gè)XylT等位基因中含有突變且在至少一個(gè)FucT等位基因中含有突變的 第二煙草植物雜交以獲得后代，以及（b)從后代中選擇在一個(gè)或多個(gè)XylT等位