一種肝原代細胞的凍存液及其凍存復蘇方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種肝原代細胞的凍存液及其凍存復蘇方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藥物代謝主要是由肝臟中的I相和II相藥物代謝酶來完成的，而CYP450酶在生 物轉(zhuǎn)化過程中扮演了重要的角色，90%以上的藥物氧化是由CYP450酶催化的，是體內(nèi)最重 要的代謝酶，肝原代細胞保留了全部的CYP450酶，是研究藥物代謝的最佳體外模型，體外 運用肝原代細胞研究藥物的代謝通路和清除速率，與體內(nèi)生理條件下的肝臟代謝有可比 性。多個實驗室從不同種屬（包括人）的體外肝原代細胞模型得到的數(shù)據(jù)表明，藥物代謝的 種屬差異及細胞毒性的評價數(shù)據(jù)與體內(nèi)結(jié)果吻合，也證明體外肝原代細胞模型的有效性。 但由于肝原代細胞的獲得不容易，每次都得通過兩步灌流法分離獲得而且所花費的試劑價 格較高，所以剩余肝原代細胞的凍存是一個關(guān)鍵技術(shù)，如果能成功凍存新鮮分離的肝原代 細胞，將減少對以研究為目的的新鮮分離肝原代細胞的需求，且肝原代細胞可以隨時制備、 保存和應用，便于進行藥物代謝的研究，可以節(jié)省大量的人力、物力和財力。
[0003] 細胞凍存液是可以保護細胞免受冷凍損傷的物質(zhì)，肝原代細胞的凍存復蘇是一項 比較難的技術(shù)，主要是由于肝原代細胞膜比較脆弱，很容易被冰晶機械損傷。傳統(tǒng)的細胞凍 存液由DMEM或RPMI-1640加入一定比例的二甲基亞砜和胎牛血清組成，然后采用程序降溫 法凍存細胞，用該配方凍存的肝原代細胞，復蘇后肝原代細胞存活率較低，無法貼壁進行藥 物代謝研究，有待進一步改進。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種肝原代細胞的凍存液及其凍存復蘇方法，以解決上述 問題。
[0005] 本發(fā)明的實施例提供了一種肝原代細胞凍存液，該凍存液按如下配方制成： dH201000g、DMEM/F12培養(yǎng)基粉末15. 6g、碳酸氫鈉 I. 2g、地塞米松300ng、肝原代細胞生 長因子10 μ g、胰島素25mg、谷氨酰胺0. 3g、慶大霉素25mg、青霉素50mg、克拉霉素25mg、 DMS00. lg、PEG6000 10g、聚乙烯吡咯烷酮 lg、l，3-丙二醇 lg。
[0006] 本發(fā)明的實施例還提供了一種肝原代細胞凍存方法，包括如下步驟：
[0007] (a)按照兩步分離法獲得肝原代細胞，去除死細胞，細胞計數(shù)計算活細胞的數(shù)量， 含細胞液離心管插入冰浴中待用；
[0008] (b)按照權(quán)利要求1的配方配制細胞凍存液，按照4~6 * IO6個細胞/mL凍存液 進行凍存細胞，其中，細胞凍存液無菌；
[0009] (c)將含細胞液離心管在離心機上，4°C條件下離心40~50g，3min，去除上清液， 加入細胞凍存液，混勻，加入到細胞凍存管中，每個細胞凍存管加入的體積為1. 5~2mL ;
[0010] (d)將裝有肝原代細胞的凍存管放入逐級降溫凍存盒中，放入冰箱在_80°C條件 下凍存4~8小時后移至液氮罐中長期保存。
[0011] 進一步，該方法可以應用于鼠、鴨、雞、狗、兔、豬、羊、牛、猴和人肝臟分離的肝原代 細胞的凍存。
[0012] 本發(fā)明的實施例還提供了一種肝原代細胞復蘇方法，包括如下步驟：
[0013] a)從液氮灌中取出肝原代細胞的凍存管并迅速放入38~40°C水浴鍋中，不斷晃 動使其迅速融化；
[0014] b)用無菌吸管吸出溶化的細胞液加入到預先放置含10~20%胎牛血清的新鮮培 養(yǎng)液的無菌試管中，混勻，插入到冰浴中，4°C條件下離心40~50g，3分鐘，去除上清液，加 入含10~90% Percoll新鮮培養(yǎng)液，4°C條件下離心90~100g，3min，去除上清液，再加入 含10~20 %胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液，4°C條件下再離心40~50g，3min，去除上清液，最后 用含10~20%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液重懸，插入到冰浴中待用；
[0015] C)采用臺盼蘭染色方法進行細胞計數(shù)，計算活細胞總數(shù)，按照IO6個細胞/mL鋪于 鼠尾膠處理過的6、12和24孔培養(yǎng)板中，放入到培養(yǎng)板每孔體積分別為2mL、ImL和0. 5mL ;
[0016] d)培養(yǎng)板放入37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)4~6小時后吸除含血清的 培養(yǎng)液，加入含〇. 2~0. 3mg/mL Matrigen膠進行培養(yǎng)，24~36小時培養(yǎng)后，得到復蘇的肝 原代細胞。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的肝原代細胞的凍存液及其凍 存復蘇方法，可以使細胞凍存復蘇的存活率在80%以上，顯著提高了復蘇后肝原代細胞的 存活率。
【具體實施方式】
[0018] 本發(fā)明的目的在于提供一種新的細胞凍存液配方和相應的復蘇方法可以使細胞 凍存復蘇的活率在80%以上，進一步使凍存復蘇的細胞可以與新鮮分離的細胞具有同等的 代謝功能，可以使凍存復蘇的細胞能夠同新鮮分離的一樣貼壁做藥物代謝酶的誘導研究。
[0019] 下面通過具體的實施例子對本發(fā)明做進一步的詳細描述。
[0020] 1、肝原代細胞凍存液配制
[0021] 肝原代細胞凍存液配方組分為：dH201000g、DMEM/F12培養(yǎng)基粉末15. 6g、碳酸氫鈉 I. 2g、地塞米松300ng、肝原代細胞生長因子10 μ g、胰島素25mg、谷氨酰胺0. 3g、慶大霉素 25mg、青霉素50mg、克拉霉素25mg、DMS00. lg、PEG6000 10g、聚乙烯吡咯烷酮lg、l，3-丙二 醇lg。配制完成后，過濾分裝凍存于_20°C冰箱。使用前預先在冰上融化。
[0022] 2、肝原代細胞凍存與復蘇
[0023] (a)按照兩步分離法獲得肝原代細胞，去除死細胞，細胞計數(shù)計算活細胞的數(shù)量， 含細胞液離心管插入冰浴中待用；
[0024] (b)按照權(quán)利要求1的配方配制細胞凍存液，按照4~6 * IO6個細胞/mL凍存液 進行凍存細胞，其中，細胞凍存液無菌；
[0025] (c)將含細胞液離心管在離心機上，4°C條件下離心40~50g，3min，去除上清液， 加入細胞凍存液，混勻，加入到細胞凍存管中，每個細胞凍存管加入的體積為1. 5~2mL ;
[0026] (d)將裝有肝原代細胞的凍存管放入逐級降溫凍存盒中，放入冰箱在_80°C條件 下凍存4~8小時后移至液氮罐中長期保存。
[0027] 該凍存方法可以應用于鼠、鴨、雞、狗、兔、豬、羊、牛、猴和人肝臟分離的肝原代細 胞的凍存。
[0028] (e)從液氮灌中取出肝原代細胞的凍存管并迅速放入38~40°C水浴鍋中，不斷晃 動使其迅速融化；
[0029] (f)用無菌吸管吸出溶化的細胞液加入到預先放置含10~20%胎牛血清的新鮮 培養(yǎng)液的無菌試管中，混勻，插入到冰浴中，4°C條件下離心40~50g，3分鐘，去除上清液， 加入含10~90% Percoll新鮮培養(yǎng)液，4°C條件下離心90~100g，3min，去除上清液，再加 入含10~20 %胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液，4°C條件下再離心40~50g，3min，去除上清液，最 后用含10~20%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液重懸，插入到冰浴中待用；
[0030] (g)采用臺盼蘭染色方法進行細胞計數(shù)，計算活細胞總數(shù)，按照IO6個細胞/mL 鋪于鼠尾膠處理過的6、12和24孔培養(yǎng)板中，放入到培養(yǎng)板每孔體積分別為2mL、ImL和 0. 5mL ；
[0031] (h)培養(yǎng)板放入37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)4~6小時后吸除含血清 的培養(yǎng)液，加入含〇. 2~0. 3mg/mL Matrigen膠進行培養(yǎng)，24~36小時培養(yǎng)后，得到復蘇的 肝原代細胞，即可進行藥物誘導研究。
[0032] 本發(fā)明的凍存液同時含滲透性和非滲透性低溫保護劑，尤其采用DMSO、PEG6000、 聚乙烯吡咯烷酮和1，3-丙二醇，可以明顯阻止冰晶生長，可以有效形成低溫玻璃化凍存結(jié) 果。
[0033] 本發(fā)明通過提供了一種肝原代細胞的凍存液及其凍存復蘇方法，具有以下有益效 果：
[0034] 1)本發(fā)明可以使細胞凍存復蘇的活率在80%以上，進一步使凍存復蘇的細胞可 以與新鮮分離的細胞具有同等的代謝功能，可以使凍存復蘇的細胞能夠同新鮮分離的一樣 貼壁做藥物代謝酶的誘導研究。
[0035] 2)本發(fā)明的凍存液同時含滲透性和非滲透性低溫保護劑，尤其采用DMS0、 PEG6000、聚乙烯吡咯烷酮和1，3-丙二醇，可以明顯阻止冰晶生長，可以有效形成低溫玻璃 化凍存結(jié)果。
[0036] 3)本發(fā)明的玻璃化凍存液體系同時考慮了保護劑毒性、滲透性和玻璃化能力，而 且利用低溫凍存盒保證了慢速降溫的效果，使肝原代細胞不至于被迅速冰晶化而影響肝原 代細胞的復蘇活率。
[0037] 4)本發(fā)明減少了對以研究為目的的新鮮分離肝原代細胞的需求，且肝原代細胞可 以隨時制備、保存和應用，便于進行藥物代謝的研究，可以節(jié)省大量的人力、物力和財力。
[0038] 下面通過具體實例對該發(fā)明作進一步說明：
[0039] 實例 1
[0040] SD大鼠肝原代細胞凍存復蘇試驗
[0041] (a)按照兩步分離法獲得肝原代細胞，去除死細胞，細胞計數(shù)計算活細胞的數(shù)量， 含細胞液離心管插入冰浴中待用；