一種利用致病真菌防治外來雜草空心蓮子草的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用于農(nóng)業(yè)植物保護的技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種利用致病真菌防 治外來雜草空心蓮子草的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 空心蓮子草是我國廣泛分布的外來入侵雜草之一，其生命力強，生長繁殖迅速，擴 散快，能夠入侵多種生境，危害當?shù)氐纳锒鄻有?，造成農(nóng)作物減產(chǎn)，影響農(nóng)事作業(yè)，污染水 體，堵塞水道，影響了淡水養(yǎng)殖和農(nóng)田灌溉，發(fā)展成為我國許多地區(qū)的惡性雜草。2003年被 列入國家環(huán)保總局公布的"中國第一批外來入侵生物名單"。空心蓮子草的防治主要包括物 理防治、化學防治和生物防治。物理防治可短時間內(nèi)產(chǎn)生較好的防除效果，但因空心蓮子草 具有較強的克隆繁殖特性，只要有1個莖節(jié)其就能繁殖，因此采用常規(guī)的機械除草和翻耕 方法，只會將其切成更多的莖段，從而催生更多的新植株，不利于防除?；瘜W防治在一定程 度上對控制空心蓮子草發(fā)揮了積極作用，但一些除草劑只能殺死地上部分，而對地下部分 卻沒有效果，且大量化學除草劑的使用必將對環(huán)境和人類健康產(chǎn)生一定的負面影響。因此， 開展生物防治是目前空心蓮子草防治最具潛力的和開發(fā)前景的方法。其中，利用天敵昆蟲 及病原菌進行防治是目前空心蓮子草生物防治的主要方法，而利用病原菌進行防治的方法 目前還處于防治物篩選階段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用致病真菌防治外來雜草空心蓮子草的方法，以解 決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0004]為解決上述問題，發(fā)明人在對空心蓮子草入侵現(xiàn)狀調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)了野外空心蓮 子草的自然發(fā)病現(xiàn)象，對其致病真菌進行了分離鑒定研究，經(jīng)過篩選，獲得了強致病鏈格孢 菌菌株J-14 ;通過前期菌絲體、孢子及代謝產(chǎn)物對空心蓮子草致病性比較研究，發(fā)現(xiàn)鏈格 孢菌代謝產(chǎn)物具有更強的致病性，同時其避免了菌絲體和孢子貨架期短的問題。
[0005]-種利用致病真菌防治外來雜草空心蓮子草的方法，具體步驟如下：
[0006] (1)液體培養(yǎng)基的制備
[0007] ①先采集新鮮的空心蓮子草莖葉，沖洗干凈，陰干去除莖葉表面的水分，剪碎成 1~2cm的碎片，取200g，加適量的水，煮沸后，繼續(xù)煎煮22~28min，經(jīng)兩層紗布過濾， 得空心蓮子草煎液；②添加葡萄糖20g，加水定容至1000mL;③分裝至500mL三角瓶，每瓶 300mL，在0·IMPa壓力下滅菌24~26min;
[0008] ⑵鏈格孢菌培養(yǎng)
[0009]在滅菌后的液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接3塊直徑為0. 8~1. 2cm的鏈格孢菌餅于液體培養(yǎng) 基中；培養(yǎng)溫度為25±1°(：，光照為170=12:12，搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為110印111/1^11，培養(yǎng) 時間為5~7d;
[0010] (3)鏈格孢菌毒素的制備
[0011] 將培養(yǎng)后菌液經(jīng)減壓抽濾得濾液，濾液經(jīng)大孔吸附樹脂吸附，然后用體積濃度為 90 %的洗脫劑洗脫得洗脫液，并濃縮得棕色浸膏；浸膏經(jīng)柱層析分離得活性毒素；
[0012] (4)鏈格孢菌毒素的應(yīng)用
[0013] 將分離的活性毒素加入水中進行配制，配制成濃度為125~2000 μ g/mL的混合 液，并加入助劑，混合均勻后，噴灑在空心蓮子草上，在3天內(nèi)使空心蓮子草表現(xiàn)出明顯的 毒害癥狀，并殺死共生雜草，同時對大多數(shù)空心蓮子草共生雜草具有毒殺效果。
[0014] 作為本發(fā)明進一步的方案：所述步驟（3)中的洗脫劑為石油醚、乙酸乙酯、丙酮、 乙醇中的一種或兩種混合物。
[0015] 作為本發(fā)明進一步的方案：所述步驟（4)中的助劑為表面活性劑、植物源助劑、增 效劑和滲透劑的混合物，提高鏈格孢菌毒素對空心蓮子草3~5倍的植物毒性。
[0016] 作為本發(fā)明再進一步的方案：所述助劑為十二烷基苯磺酸鈉、曲拉通X-100、硝酸 銨、有機硅、司班-60、農(nóng)乳HSH437、農(nóng)乳0201B、農(nóng)乳1602、農(nóng)乳8205中的多種混合物。[0017] 經(jīng)安全性檢測發(fā)現(xiàn)，毒素對花生、芝麻、空心菜、大豆、絲瓜及玉米具有較強的致病 性，而對棉花和煙草的致病性較弱，相對比較安全。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0019] 本發(fā)明方法液體培養(yǎng)操作簡單、培養(yǎng)基質(zhì)材料易獲得、所需設(shè)備簡單，所用毒素穩(wěn) 定性強，提取純化工藝簡單，可大批量生產(chǎn)；助劑對毒素具有較強的增效作用，以毒素作莖 葉噴施，使用方便，既可有效殺滅目標雜草空心蓮子草，同時也可兼顧殺滅大多數(shù)共生雜 草；可用于棉花田、煙草田及荒地等生境中空心蓮子草的防除，具有較高的環(huán)境安全性。
【附圖說明】
[0020] 圖1為不同濃度鏈格孢菌毒素對空心蓮子草的致病性對比圖。
[0021] 圖2為不同助劑對毒素的增效作用圖。
[0022] (A:吐溫20;B:吐溫80;C:曲拉通X-100;D:油酸甲酯；E:木質(zhì)素磺酸鈉；F:十二 烷基磺酸鈉；G:十二烷基苯磺酸鈉；Η:硝酸銨；I:硫酸銨J:有機硅；K:月桂氮酮；L:司 班-60;Μ:農(nóng)乳HSH437;Ν:農(nóng)乳 0201Β;0 :乳 0Ρ-10;Ρ:農(nóng)乳BY-130;Q:農(nóng)乳 4003;R:農(nóng)乳 600;S:農(nóng)乳1602;T:農(nóng)乳3201;U:農(nóng)乳8205,以上均購自江蘇省海安石油化工廠）
[0023] 圖3為不同助劑配方對毒素的增效作用圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0025] 實施例1
[0026]將強致病菌菌株J-14直徑6_菌塊轉(zhuǎn)接至馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA)、空心蓮子草 莖葉煎汁培養(yǎng)基（ADA)、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD)、1 %聚山梨酯80-玉米瓊脂 培養(yǎng)基（TCA)、沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDLA)、察氏培養(yǎng)基（CDA)和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA)7 種培養(yǎng)基平板上，置于25土 1°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，5d后測量菌落直徑，然后用載玻片 輕輕將孢子刮下，加入適量的無菌水配制成孢子懸浮液，在顯微鏡下，用血球計數(shù)板法統(tǒng)計 孢子的產(chǎn)量。每處理設(shè)5個重復，結(jié)果見表1。
[0027] 表1表明鏈格孢菌在空心蓮子草莖葉煎汁培養(yǎng)基（ADA)和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng) 基（SDA)上菌落生長較好，顯著高于其在其它培養(yǎng)基上的生長（P< 0. 05)，生長5d后相應(yīng) 的菌落直徑分別為5. 800cm和5. 876cm;鏈格孢菌在沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDLA)上生長的相 對較緩慢，生長5d后其菌落直徑為4. 524cm。鏈格孢菌在ADA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最高，為 519. 374X106個，顯著高于其在其它培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量（P< 0. 05)，其后依次為1 %聚山梨 酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基（TCA)、SDA和PDA，而在SDLA上的產(chǎn)孢量最小，顯著低于其它培養(yǎng) 基（P< 0. 05)。可見，ADA培養(yǎng)基最適合于鏈格孢菌的生長和產(chǎn)孢。
[0028] 表1不同培養(yǎng)基對鏈格孢菌菌落生長和產(chǎn)孢的影響
[0029]
[0030] 表中不同小寫字母表示差異顯著（P< 0.05)，下同。
[0031] 實施例2
[0032] 用少量乙酸乙酯（濃度為2% )溶解鏈格孢菌毒素后，用蒸餾水分別配制125、 250、500、1000、2000μg/mL的毒素溶液。以離體葉片針刺法檢測了毒素對空心蓮子草的致 病性。選取無病蟲害的健康空心蓮子草分株，取從頂端往下數(shù)的第3對葉片，用無菌水沖洗 干凈，并用吸水紙吸干葉片上的水分，置于鋪有一張濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，用解剖針輕輕刺 破葉片表皮，滴加10μL溶液，置于25±1°C生化培養(yǎng)箱中