一種提高長白落葉松體細胞胚發(fā)生和植株再生效率的過渡培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種提高落葉松體細胞胚發(fā)生和植株再生效率的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 長白落葉松屬于松科中的落葉松亞科落葉松屬，具有分布廣、抗逆性強及早期速 生等優(yōu)點，為北半球溫帶山區(qū)與寒帶氣候條件下重要的速生用材樹種。長白落葉松有很高 的生態(tài)價值與經(jīng)濟價值，但是長白落葉松生長周期長，桿插等無性繁殖存在生根率較低等 問題，且長白落葉松具有雜合性高的特點，有性生殖產(chǎn)生的子代變異較大，很多優(yōu)良性狀難 W維持，通過傳統(tǒng)的育種方法并不能很好的滿足許多遺傳改良的需求，所W利用如細胞工 程等現(xiàn)代生物技術(shù)手段，建立穩(wěn)定且高效的長白落葉松體細胞胚胎發(fā)生體系對于長白落葉 松的遺傳育種具有重要而深遠的意義。
[0003] 對于建立植物體細胞胚胎發(fā)生體系而言，最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)在于如何快速獲得大量優(yōu) 質(zhì)的體細胞胚胎?，F(xiàn)階段，關(guān)于體胚發(fā)生階段，長白落葉松的體細胞胚胎發(fā)生存在許多問 題，主要是胚性愈傷組織質(zhì)量差、高頻的體胚發(fā)生需使用昂貴的設(shè)備進行液體同步化培養(yǎng)、 胚性愈傷體胚發(fā)生能力差、體胚發(fā)生所需周期長、早期原胚的子葉及根原基發(fā)育不正常。通 常落葉松胚性愈傷組織體細胞胚的發(fā)生量不超30個/g，且發(fā)生需要80天W上。即便是較 好的體系，子葉胚的發(fā)生也需40-60天；體胚的萌發(fā)率不超過70%;植株再生率也在30%W 下。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明是要解決現(xiàn)有長白落葉松體細胞胚胎發(fā)生體系中高頻的體胚發(fā)生需要使 用昂貴的設(shè)備進行液體同步化培養(yǎng)、子葉胚發(fā)生頻率普遍不高且所需周期長、體胚萌發(fā)率 及植株再生率低的問題，提供一種提高長白落葉松體細胞胚發(fā)生和植株再生效率的過渡培 養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
[0005] 本發(fā)明提高長白落葉松體細胞胚發(fā)生和植株再生效率的過渡培養(yǎng)基，包括W下組 分：
[0006] N札NO, 35.5-150nig/L KNO. 227.47-909.9mg/L KH2PO4 34-l:;6.!mg/L · 7H,?0 6!.I-246.5mg/L Mg(NO;)2· 0H2O 64.1-256.5mg/L
[0007] MgCh · 6H20 i 2' ?-50 mg/L CaCl：·4H20 ! 2,5-50 mg,/L Ca(NO:')2· 4札0 59 1-236.2 mg/L ZnS〇4'7H；：0 3.6-14.4 mg/L FeS〇4·7H20 3.4-13.9 mg/L 3.8-i5.5 rng/L CuS〇4· 5H;0 0,03-0,0125 mg/L MiiSC、· 2HhO 2,6-! 0 5 mg/L C0CI2 ·6H2O 日.03-0.0! 25 rng/L M 1-4'15 mg/L Na，· EDTA 4.66-18.65 - 'W' Na2Mo〇4· 2H;0 0.03-0.0 ? 25 mg/L Gin 0-1000 mg/L 肌醇〇-15g/L 水解酪蛋白 fi-500m咨/L 齋糖 30-90g/L ABA 日-I mg/L 2'4-D 0-0,! 5 mg/L BA 0-0 05 mg/L KT 0-0,05 mg/L 轅釀 5.8-6.0 g/L
[000引其中薦糖的優(yōu)選濃度為60g/l，肌醇的優(yōu)選濃度為10g/l，Gln的優(yōu)選濃度為0. 5g/ 以水解酪蛋白的優(yōu)選濃度為0. 25g/L。
[0009] 為保證愈傷組織的正常生長代謝，培養(yǎng)基中還應(yīng)含有2mg/LCly，lmg/LVB1， 0. 5mg/LVB5 及 0. 5mg/LVB6。
[0010] 利用上述培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的方法為：將長白落葉松胚性愈傷組織接種于上述培養(yǎng) 基中，于22-25Γ、暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7-21d，其中優(yōu)選培養(yǎng)時間為14天。
[0011] 本發(fā)明的有益效果：
[0012] 本發(fā)明通過在體胚誘導(dǎo)前對胚性愈傷組織進行的過渡培養(yǎng)，提高了長白落葉松高 質(zhì)量體胚發(fā)生量，縮短了體胚發(fā)生時間，從而改善了長白落葉松體胚發(fā)生效率，在此基礎(chǔ)上 顯著提高了體胚萌發(fā)率及生根率。通過過渡培養(yǎng)，僅15天即可獲得子葉期的體胚，其發(fā)生 數(shù)量最多可W達330個/g，體細胞胚的萌發(fā)率約為100%，生根率可達50%。
【附圖說明】
[0013] 圖1為長白落葉松胚性愈傷組織；
[0014] 圖2為長白落葉松體細胞胚胎發(fā)生；
[0015] 圖3為長白落葉松體細胞胚胎的萌發(fā)；
[0016] 圖4為長白落葉松體細胞胚胎的生根；
[0017] 圖5為長白落葉松體細胞胚胎的植株再生。
【具體實施方式】
[0018] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于W下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
[0019]
【具體實施方式】一：本實施方式提高長白落葉松體細胞胚發(fā)生和植株再生效率的過 渡培養(yǎng)基，包括W下組分：
[0020] NH4NO.; 35,5-!50mg/L KNO:， 227,47-909.9 mgC KHzPQj 34-)36.) mg/L MgS〇4 ·7H2O 6U-246.5 mg/L Mg(NO:'),?·()比O 64. i -256.5 mg/L MgCb ·6H2O ! 2,5-50 mg/L CaCb · 4Fh〇 12.5-50 mg/L Ca(NO'-;)2· 4H;0 59,1-236.2 mg/L ZnSO.j · 7H:0 3.6-J4,4 mg/L FeSO.i · 7H_，0 3.4-13.9 rng/L H.iBO; 3.8-15.5熱g化 CuS〇4· 5H.：0 日.03-0.0 i 25 mg/L MnS〇4· 2H?0 2.()-10.5 mg/L CoCi. ·0H2O 0.03-0,0125 mg/L K1 1-4.15 mg/L Na：· EDTA 4.66-18.65 mg/L Na:M〇a+ * 2比0 0.03-0.0! 25 mg/L
[0021] 樹舟 ο-10貸οmg,''L 肌醇 0-15g/L 水解酪巧ΓI 0-500mg/L 騙械 30-90當(dāng)'L ΑΒΑ 0-1mg/L 2,4-D 0-0 15mg/L BA 0-0.05nm/L .....口· KT 0-0.05 mg/L 枯|:j衍 5.8-6.0 g/L
【具體實施方式】 [0022] 二：本實施方式與一不同的是：所述薦糖的濃度為 30-60g/L。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0023] Ξ:本實施方式與一或二不同的是：所述肌醇的濃度 為1-lOg/L。其它與一或二相同。
【具體實施方式】 [0024] 四：本實施方式與一至Ξ之一不同的是：所述Gin的 濃度為0. 5-lg/L。其它與一至Ξ之一相同。
[00巧]【具體實施方式】五：本實施方式與【具體實施方式】一至四之一不同的是：所述水解酪 蛋白的濃度為0. 25-0. 5g/L。其它與【具體實施方式】一至四之一相同。
【具體實施方式】 [0026] 六：本實施方式與一至五之一不同的是：所述培養(yǎng)基 中還含有2mg/LCly，lmg/LVB1，0. 5mg/LVB5和0. 5mg/LVB6。其它與一至 五之一相同。
【具體實施方式】 [0027] 屯：本實施方式利用提高長白落葉松體細胞胚發(fā)生和植株再生效率 的過渡培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的方法為：
[0028] 將長白落葉松胚性愈傷組織接種于提高長白落葉松體細胞胚發(fā)生和植株再生效 率的過渡培養(yǎng)基中，于22-25Γ、暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)l-28d。
【具體實施方式】 [0029] 八：本實施方式與屯不同的是：暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時 間為7-21d。其它與屯相同。
【具體實施方式】 [0030] 九：本實施方式與屯不同的是：暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時 間為14d。其它與屯相同。
[0031] 為驗證本發(fā)明的有益效果進行W下試驗：
[0032] 實施例1 :
[0033] 本實施例提高長白落葉松體細胞胚發(fā)生和植株再生效率的過渡培養(yǎng)基的配方如 下：
[0034]
[0035] 將由未成熟合子胚在含有2, 4-D、BA等的BM培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的長白落葉松胚性愈傷 組織（圖1)，接種于含有30-90g/L薦糖的本實施例的培養(yǎng)基中過渡培養(yǎng)14d后，再經(jīng)體胚 誘導(dǎo)，每克胚性愈傷組織可形成的體細胞胚胎（圖2)數(shù)量及形成體胚的萌發(fā)率、植株再生 率如下表所示：
[0036] 表1.薦糖濃度對體胚發(fā)生數(shù)量、體胚萌發(fā)率及植株再生率的影響
[0037]
[003引從上表我們可W看出，該培養(yǎng)基中添加60g/L薦糖時，每克愈傷組織可W誘導(dǎo) 出的體細胞胚胎數(shù)最多，并且體胚的萌發(fā)率及植株再生率也最大可分別達到100 %與 45. 00%。
[0039] *注：上述體胚萌發(fā)率指接入無激素WPM培養(yǎng)基中，萌發(fā)的體胚（圖3)即子葉變 綠且伸長的體胚在全部接種的體胚中所占的比例；植株再生率指接入WPM培養(yǎng)基中，生根 的體胚（圖4)即胚根端生長出紅色胚根的體胚在全部接種的體胚中所占的比例。
[0040] 實施例2 :
[0041] 將實施例1中所述的胚性愈傷組織接種于含有l(wèi)-15g/L肌醇，其他條件同實施例 1的培養(yǎng)基中，胚性愈傷組織經(jīng)過誘導(dǎo)后，每克胚性愈傷組織可形成的體細胞胚胎數(shù)及形成 體胚的萌發(fā)率、植株再生率如下表所示：
[0042] 表2.肌醇濃度對體胚發(fā)生數(shù)量、體胚萌發(fā)率及植株再生率的影響
[0043]
[0044] 從上表我們可W看出，在特定范圍內(nèi)，胚性愈傷組織形成的體細胞胚胎的數(shù)量隨 該培養(yǎng)基中肌