采用寡核苷酸介導(dǎo)的基因修復(fù)提高靶向基因修飾的提高的效率的效率的方法和組合物的制作方法
【專利說明】采用寡核音酸介導(dǎo)的基因修復(fù)提高祀向基因修飾的提高的 效率的效率的方法和組合物
[0001] 本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時(shí)專利申請61/801，333的優(yōu)先權(quán)，所 述專利申請?zhí)卮薟引用的方式并入。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明總體上設(shè)及用于改進(jìn)對基因組或其他核巧酸序列中的特定位置的修飾的 祀向效率的新穎方法。另外，本發(fā)明設(shè)及已經(jīng)通過本文所公開的方法修飾、突變或標(biāo)記的祀 DNA。本發(fā)明還設(shè)及已經(jīng)通過本發(fā)明的方法修飾的細(xì)胞、組織和生物體。
[000引發(fā)明背景
[0004] W下發(fā)明背景論述僅提供來幫助讀者理解本發(fā)明，且并非承認(rèn)描述或構(gòu)成本發(fā)明 的現(xiàn)有技術(shù)。
[0005] 基因組DNA的修飾一般來說對生物技術(shù)的進(jìn)步是至關(guān)重要的并且具體地說是生 物技術(shù)上基于醫(yī)學(xué)進(jìn)步的。用于位點(diǎn)定向基因組修飾的有效方法對于研究且可能地對于基 因療法應(yīng)用來說是合乎需要的。一種方法利用Ξ鏈體形成寡核巧酸（TF0)，所述寡核巧酸W 序列特異性方式結(jié)合雙鏈DNA作為第Ξ鏈W介導(dǎo)定向誘變。運(yùn)種TF0可通過遞送鍵結(jié)誘變 劑如補(bǔ)骨脂素或苯下酸氮芥（Havre等，Proc化t'lAcadSci，U.S.A. 90:7879-7883,1993; Havre等，JVirol67:7323-7331,1993;Wang等，MolCellBiol15:1759-1768,1995; Takasugi等，P;roc化t，1AcadSci,U.S.A. 88:5602-5606, 1991;Belousov等，Nucleic AcidsRes25:3440-3444, 1997)或通過W足夠親和力結(jié)合W引起易錯(cuò)修復(fù)（Wang 等，Science271:802-805,1996)來作用。
[0006] 用于基因組修飾的另一策略設(shè)及誘導(dǎo)外源性DM片段與祀基因之間的同源重 組。運(yùn)種方法已經(jīng)成功地用于祀向并破壞哺乳動(dòng)物中的選定基因并且已經(jīng)實(shí)現(xiàn)攜帶特異 性基因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生（Capeechi等，Science244:1288-1292, 1989 ;Wa即er 的美國專利號(hào)4, 873, 191)。然而，運(yùn)種方法依賴于轉(zhuǎn)移選擇性標(biāo)記物W允許所需重組 體的分離。在無選擇的情況下，典型基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染的DNA的同源與非同源整合的 比例較低，通常在1:1000或更小的范圍內(nèi)（Sedivy等，GeneTargeting,W.比Rreeman andCo.，化wYork, 1992)。同源整合的運(yùn)種低效率限制基因轉(zhuǎn)移用于實(shí)驗(yàn)用途或基因療 法的效用。同源重組的頻率可通過對來自UV照射和選定致癌物的祀位點(diǎn)的損傷（Wang 等，MolCellBiol8:196-202, 1988)?及通過位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶（Sedivy等，Gene Targeting,W.Η.FreemanandCo. ,NewYork, 1992;Rouet等，ProcNat' 1AcadSci,U. S.A. 91:6064-6068, 1994;Segal等，Proc化t，lAcadSci，U.S.A. 92:806-810,1995)來增 強(qiáng)。此外，由Ξ鏈體定向補(bǔ)骨脂素光加成物誘導(dǎo)的DNA損傷能夠刺激染色體外載體之內(nèi)和 之間的重組（Segal等，Proc化t，lAcadSci,U.S.A. 92:806-810,1995 ;Fa;r叫i等，Mol CellBiol16:6820-6828, 1996;Glazer的美國專利號(hào) 5, 962, 426)。
[0007]其他工作已經(jīng)幫助定義影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的重組的參數(shù)。一般來說，線性供體 片段比其環(huán)狀對應(yīng)物重組發(fā)生更強(qiáng)（化Iger等，MolCellBiol2:1372-1387,1982)。重 組還受供體與祀部位兩者之間的不間斷同源性的長度影響，其中較短片段似乎是對于重 組的無效底物（Rubnitz等，MolCellBiol4:2253-2258,1984)。然而，一些最近努力集 中于使用DNA或DNA/RNA雜合體的較短片段用于基因校正。（Kunzelmann等，Gene化er 3:859-867, 1996)。
[0008] TF0的序列特異性結(jié)合特性已經(jīng)用于將一系列不同分子遞送至DNA中的祀位 點(diǎn)。例如，用于檢查Ξ鏈體相互作用的診斷方法利用偶聯(lián)至化-邸TA(-種DNA裂解 劑）的TF0(Moser等，Science238:645-650,1987)。其他已經(jīng)在生物學(xué)上將活性酶 像微球菌核酸酶和鏈球菌核酸酶與TF0相聯(lián)系并且展示DNA的位點(diǎn)特異性裂解（Pei 等'Proc化t，1AcadSciU.S.A. 87:9858-9862, 1990;Landgraf等，Biochemishy 33:10607-10615, 1994)。此外，位點(diǎn)定向DNA損傷和誘變可使用綴合至補(bǔ)骨脂素化avre 等，Proc化t，1AcadSciU.S.A. 90:7879-7883，1993;Takasurgi等，Proc化t，1 AcadSciU.S.A. 88:5602-5606,1991)或燒化劑度elousov等，NucleicAcidsRes 25:3440-:3444, 1997;化svic等，JAmChemSoc112:9428-9430,1990)的TFO來實(shí)現(xiàn)。
[0009] WIPO專利申請WO/2001/025460描述了用于突變植物的祀DNA序列的方法，所述 方法包括W下步驟：（1)將重組基因寡核堿基電穿孔至所述植物的小抱子中，所述寡核堿 基含有第一同源區(qū)，所述第一同源區(qū)具有與祀DNA序列的第一片段的至少6個(gè)堿基對的序 列相同的序列；和第二同源區(qū)，所述第二同源區(qū)具有與祀DNA序列的第二片段的至少6個(gè)堿 基對的序列相同的序列；W及插入?yún)^(qū)，所述插入?yún)^(qū)含有至少1個(gè)與祀DNA序列異源的核堿 基，所述插入?yún)^(qū)連接所述第一同源區(qū)和所述第二同源區(qū)；（2)培養(yǎng)小抱子W產(chǎn)生胚芽；并且 (3)從所述胚芽產(chǎn)生具有位于所述祀DNA序列的第一片段與第二片段之間的突變的植物， 例如通過胚芽所述小抱子W產(chǎn)生體細(xì)胞胚且從所述胚芽再生植物。在本發(fā)明的不同實(shí)施方 案中，重組基因寡核堿基是MD0N并且所述同源區(qū)各自含有至少6個(gè)RNA型核巧酸的RNA區(qū) 段；所述插入?yún)^(qū)是至少3個(gè)核巧酸長；所述第一和或第二RNA區(qū)段含有至少8個(gè)連續(xù)2' -取 代的核糖核巧酸。
[0010] 生物學(xué)研究的主要目標(biāo)之一是基因組的祀向修飾。如上所述，雖然用于將基因遞 送至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的方法是發(fā)展良好的，但修飾和/或同源重組的頻率受限制（Hanson 等，MolCellBiol15:45-511995)。因此，基因的修飾是費(fèi)時(shí)的過程。已經(jīng)考慮或嘗試了 多種方法來增強(qiáng)供體與基因組DNA之間的修飾和/或重組。然而，當(dāng)前技術(shù)經(jīng)常展示較低 修飾和/或重組率，或者修飾和/或重組率的不一致性，從而妨礙研究和基因療法技術(shù)。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 本發(fā)明提供用于提高對基因組或其他核巧酸序列中的特定位置的修飾的祀向效 率的新穎方法和組合物。如下文所述，引導(dǎo)對基因組的特異性變化的核酸可與不同方法組 合W增強(qiáng)存在于被祀向W用于修飾的細(xì)胞中的天然修復(fù)系統(tǒng)的組分的可用性。
[0013] 在第一方面，本發(fā)明設(shè)及用于將基因修復(fù)寡核堿基（GR0N)介導(dǎo)的突變引入至植 物細(xì)胞中的祀脫氧核糖核酸值NA)序列中的方法。所述方法尤其包括在將GR0N遞送至植 物細(xì)胞中之前和/或同時(shí)在增加一種或多種細(xì)胞DNA修復(fù)過程的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；和/或 將GR0N遞送至大于55個(gè)堿基長的植物細(xì)胞中，所述GR0N任選地包含用于引入至祀DNA中 的兩個(gè)或更多個(gè)突變位點(diǎn)。
[0014] 在某些實(shí)施方案中，增加一種或多種細(xì)胞DNA修復(fù)過程的條件包括W下中的一種 或多種：將一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)引入至GRON中或至植物細(xì)胞DM中，所述位點(diǎn)是用于堿基切除 修復(fù)的祀標(biāo)；將一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)引入至GR0N中或至植物細(xì)胞DNA中，所述位點(diǎn)是用于非同 源末端連接的祀標(biāo)；將一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)引入至GR0N中或至植物細(xì)胞DNA中，所述位點(diǎn)是用 于微同源介導(dǎo)的末端連接的祀標(biāo)；將一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)引入至GR0N中或至植物細(xì)胞DNA中， 所述位點(diǎn)是用于同源重組的祀標(biāo)；W及將一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)引入至GR0N中或至植物細(xì)胞DNA 中，所述位點(diǎn)是用于推動(dòng)修復(fù)的祀標(biāo)。
[0015] 如下文所述，用于本發(fā)明的GR0N可包含來自常規(guī)RNA和DNA核巧酸的W下改變中 的一種或多種：
[0016] 一個(gè)或多個(gè)無堿基核巧酸；
[0017] -個(gè)或多個(gè)8'氧代dA和/或8'氧代dG核巧酸；
[001引在其3'端處的反向堿基；
[0019] 一個(gè)或多個(gè)2' 0-甲基核巧酸；
[0020] 在其5'端處的一個(gè)或多個(gè)2' 0-甲基RNA核巧酸，并且優(yōu)選2、3、4、5、6、7、8、9、10 個(gè)或更多個(gè)；
[0021] 嵌入染料；
[002引 5,末端帽；
[0023] 選自由W下組成的組的主鏈修飾：硫代憐酸醋修飾、麟酸甲醋修飾、鎖核酸（LNA) 修飾、0-(2-甲氧基乙基）（M0巧修飾、二PS修飾W及膚核酸（PNA)修飾；
[0024] -個(gè)或多個(gè)鏈內(nèi)交聯(lián)；
[0025] 綴合至其、優(yōu)選地在所述GR0N的5'或3'端處的一種或多種巧光染料；W及
[0026] 增加雜交能量的一個(gè)或多個(gè)堿基。此列表不意圖是限制性的。
[0027] 如下文所述，在某些實(shí)施方案中，GR0N質(zhì)量和轉(zhuǎn)化效率可通過使用改進(jìn)其純度的 核巧酸多聚體如二聚體、Ξ聚體、四具體等合成GR0N的全部或一部分來改進(jìn)。
[0028] 在某些實(shí)施方案中，祀脫氧核糖核酸值NA)序列是在植物細(xì)胞基因組內(nèi)。植物細(xì) 胞可W是非轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因的，并且祀DNA序列可W是所述植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因或內(nèi)源基 因。
[0029] 在某些實(shí)施方案中，增加一種或多種細(xì)胞DNA修復(fù)過程的條件包括引入一種或多 種化合物，所述化合物在將GR0N遞送至植物細(xì)胞中之前或同時(shí)誘導(dǎo)單或雙DNA鏈分解至植 物細(xì)胞中。示例性化合物在下文描述。
[0030] 本文所述的方法和組合物適用于一般植物。僅作為舉例，植物物種可選自由W下 組成的組：芥花、向日葵、玉米、煙草、甜菜、棉花、玉米、小麥、大麥、水稻、首猜（alfafa)、大 麥、高梁、西紅柿、芒果、桃子、蘋果、梨、草替、香蕉、甜瓜、上豆、胡蘿K窩宦、洋蔥、大豆、 大豆屬、甘薦、魏豆、鷹嘴豆、紫花魏豆（fieldbean)、蠶豆、扁豆、蘿K憲菁甘藍(lán)、球芽甘 藍(lán)化russelsprouts)、羽扇豆、花挪菜、羽衣甘藍(lán)、菜豆、楊樹、松樹、按樹、葡萄、相橘、黑 小麥、首猜、黑麥、燕麥、草皮和牧草、亞麻、油菜、芥菜、黃瓜、牽?；?、香脂、辣椒、茄子、萬壽 菊、蓮花、卷屯、菜、菊花、康乃馨、郁金香、尊尾W及百合。運(yùn)些還可全部或部分地適用于所有 其他生物系統(tǒng)，包括但不限于細(xì)菌、真菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞W及甚至其細(xì)胞器（例如，線粒體 和葉綠體）。
[0031] 在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括從植物細(xì)胞再生具有通過GR0N引入的突變 的植物，并且可包括從所述植物采集種子。
[0032] 在相關(guān)方面，本發(fā)明設(shè)及包含根據(jù)本文所述的方法通過GR0N引入的基因組修飾 的植物細(xì)胞，包含根據(jù)本文所述的方法通過GR0N引入的基因組修飾的植物，或包含根據(jù)本 文所述的方法通過GR0N引入的基因組修飾的種子。
[0033] 本發(fā)明的其他實(shí)施方案將是從W下詳述、示例性實(shí)施方案和權(quán)利要求書顯而易見 的。
[0034] 附圖簡述
[0035] 圖1描繪通過硫代憐酸醋（P巧標(biāo)記的GR0N(在GR0N的每一端具有3PS部分）和 5'切3/3'idC標(biāo)記的GR0N介導(dǎo)的BFP至GFP轉(zhuǎn)化。
[0036] 圖2描繪包含RNA/DNA的GR0N(本文被稱為"岡崎片段GR0N")。
[0037] 發(fā)明詳述
[0038] 在過去幾年內(nèi)發(fā)展，通過寡核巧酸介導(dǎo)的祀向遺傳修飾已被證明是用于DNA的短 鏈段的特異性改變W產(chǎn)生缺失、短插入和點(diǎn)突變的有價(jià)值的技術(shù)。運(yùn)些方法設(shè)及DNA配對/ 退火，接著DNA修復(fù)/重組事件。首先，核酸在由細(xì)胞蛋白質(zhì)因子介導(dǎo)的過程中與雙鏈DNA 中的其互補(bǔ)鏈退火。運(yùn)種退火產(chǎn)生位于中屯、的錯(cuò)配堿基對（在點(diǎn)突變的情況下），從而導(dǎo)致 最可能刺激內(nèi)源性蛋白質(zhì)機(jī)器W起始修復(fù)過程的第二階段的結(jié)構(gòu)微擾：染色體序列和甚至 其細(xì)胞器（例如，線粒體和葉綠體）的位點(diǎn)特異性修飾。運(yùn)種新引入的錯(cuò)配誘導(dǎo)DNA修復(fù) 機(jī)器進(jìn)行第二修復(fù)事件，從而導(dǎo)致祀位點(diǎn)的最終修改。本方法通過提供創(chuàng)新穎方法來改進(jìn) 運(yùn)些方法，所述方法增加DNA修復(fù)組分的可用性，從而增加對祀核酸的基因修復(fù)介導(dǎo)的修 飾的效率和可再現(xiàn)性。
[0039] 定女
[0040] 為了有助于理解本發(fā)明，在下文定義多個(gè)術(shù)語。
[0041] 如本文所用的"核酸序列"、"核巧酸序列"和"多核巧酸序列"是指寡核巧酸或多 核巧酸化及其片段或部分，并且是指基因組或合成來源的DNA或RNA，其可W是單鏈或雙鏈 的并且表示有義鏈或反義鏈。
[0042] 如本文所用，術(shù)語"寡核巧酸"和"寡聚物"是指至少約10個(gè)核巧酸且多達(dá)約201 個(gè)核巧酸、優(yōu)選約15至30個(gè)核巧酸且更優(yōu)選約20-25個(gè)核巧酸的核酸序列，其可用作探針 或擴(kuò)增引物。
[004引如本文所用的術(shù)語"DNA修飾分子"和"DNA修飾試劑"是指能夠識(shí)別且特異性地結(jié) 合細(xì)胞基因組中的核酸序列并且能夠修飾基因組內(nèi)的祀核巧酸序列的分子，其中DNA修飾 分子識(shí)別和特異性結(jié)合核酸序列是蛋白質(zhì)獨(dú)立性的。如本文結(jié)合DNA修飾分子所用的術(shù)語 "蛋白質(zhì)獨(dú)立性的"意指DNA修飾分子不需要蛋白質(zhì)和/或酶的存在和/或活性來用于識(shí)別 和/或特異性地結(jié)合核酸序列。DNA修飾分子舉例說明但不限于Ξ鏈體形成寡核巧酸、膚核 酸、聚酷胺和寡核巧酸，其意圖促進(jìn)基因轉(zhuǎn)換。本發(fā)明的DNA修飾分子與用于同源重組的現(xiàn) 有技術(shù)核酸序列[Wong&Capecchi，Molec.Cell.Biol. 7:2294-2295, 1987]的區(qū)別在于用于 同源重組的現(xiàn)有技術(shù)核酸序列是蛋白質(zhì)依賴性的。如本文結(jié)合分子所用的術(shù)語"蛋白質(zhì)依 賴性的"意指分子需要蛋白質(zhì)和/或酶的存在和/或活性來用于分子對核酸序列的識(shí)別和 /或特異性地結(jié)合。用于確定DNA修飾分子是否需要蛋白質(zhì)和/或酶的存在和/或活性來 識(shí)別和/或特異性地結(jié)合核酸序列的方法在本領(lǐng)域的技術(shù)內(nèi)[參見例如，Dennis等Nucl. AcidsRes. 27:4734-4742, 1999]。例如，DM修飾分子可在不存在任何蛋白質(zhì)和/或酶的 情況下在體外與核酸序列一起解育。DNA修飾分子與核酸序列之間的特異性結(jié)合的檢測證 明DNA修飾分子是蛋白質(zhì)獨(dú)立性的。另一方面，DNA修飾分子與核酸序列之間的特異性結(jié) 合的不存在證明DNA修飾分子是蛋白質(zhì)依賴性的和/或需要另外的因子。
[0044] "Ξ鏈體形成寡核巧酸"燈F0)被定義為能夠結(jié)合在雙鏈DNA或RNA螺旋的大溝中 W形成Ξ螺旋的DNA或RNA的序列。雖然TF0不限于任何具體長度，但TF0的優(yōu)選長度是 200個(gè)核巧酸或更少，更優(yōu)選100個(gè)核巧酸或更少，仍然更優(yōu)選地5至50個(gè)核巧酸，甚至更 優(yōu)選10至25個(gè)核巧酸，并且最優(yōu)選15至25個(gè)核巧酸。雖然TF0與雙鏈DNA之間的序列 特異性程度對于Ξ螺旋的形成來說是必要的，但不需要特定特異性程度，只要Ξ螺旋能夠 形成即可。同樣，不需要TF0與雙螺旋之間的特定親合力或親和力程度，只要Ξ螺旋能夠 形成即可。雖然不意圖限制在一個(gè)實(shí)施方案中TF0所特異性地結(jié)合的核巧酸序列的長度， 但TF0所特異性結(jié)合的核巧酸序列是1至100、更優(yōu)選5至50、仍然更優(yōu)選10至25且最優(yōu) 選15至25個(gè)核巧酸。此外，"Ξ螺旋"被定義為具有結(jié)合至雙螺旋核酸內(nèi)的祀序列的寡核 巧酸的雙螺旋核酸。"雙螺旋"核酸可W是任何雙鏈核酸，包括雙鏈DNA、雙鏈RNA和DNA與 RNA的混合雙鏈。雙鏈核酸不限于任何具體長度。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，它具有大于 5(K)bp、更優(yōu)選大于化b且最優(yōu)選大于約5化的長度。在許多應(yīng)用中，雙螺旋核酸是細(xì)胞、基 因組核酸。Ξ鏈體形成寡核巧酸可W平行或反平行方式結(jié)合祀序列。
[0045]"膚核酸"、"聚酷胺"或"PNA"是其中憐酸主鏈被基于N-氨基乙基甘氨酸的聚酷胺 結(jié)構(gòu)置換的核酸。PNA具有比遵循沃森-克里克（Watson-化ick)堿基配對規(guī)則的其天然對 應(yīng)物對于互補(bǔ)核酸的更高親和力。PNA可形成具有W下化學(xué)計(jì)量學(xué)的DNA的高度穩(wěn)定的Ξ 螺旋結(jié)構(gòu)：(PNA) 2.DNA。雖然膚核酸和聚酷胺不限于任何具體長度，但膚核酸和聚酷胺的優(yōu) 選長度是200個(gè)核巧酸或更少，更優(yōu)選100個(gè)核巧酸或更少，且最優(yōu)選5至50個(gè)核巧酸長。 雖然不意圖限制在一個(gè)實(shí)施方案中膚核酸和聚酷胺所特異性地結(jié)合的核巧酸序列的長度， 但膚核酸和聚酷胺所特異性地結(jié)合的核巧酸序列是1至100、更優(yōu)選5至50、仍然更優(yōu)選5 至25且最優(yōu)選5至20個(gè)核巧酸。
[0046] 術(shù)語"細(xì)胞（cell)"是指單個(gè)細(xì)胞。術(shù)語"細(xì)胞（cells)"是指細(xì)胞的群體。群體 可W是包含一種細(xì)胞類型的純?nèi)后w。同樣，群體可包含多于一種細(xì)胞類型。在本發(fā)明中，關(guān) 于細(xì)胞群體可包含的細(xì)胞類型的數(shù)目不存在限制。
[0047] 當(dāng)提及細(xì)胞的樣品時(shí)術(shù)語"同步"或"同步的"，或"同步細(xì)胞"或"同步細(xì)胞群體" 是指已經(jīng)處理W引起細(xì)胞群體處于細(xì)胞周期的同一階段的多個(gè)細(xì)胞。樣品中的所有細(xì)胞不 必要是同步的。一小部分細(xì)胞可能不與樣品中的大多數(shù)細(xì)胞同步。同步細(xì)胞的優(yōu)選范圍是 10%-100%之間。更優(yōu)選的范圍是30%-100%之間。此外，細(xì)胞不必是單一細(xì)胞類型的純 群體。多于一種細(xì)胞類型可包含于樣品中。在此方面，如與樣品中的另一種細(xì)胞類型相比， 僅一種細(xì)胞類型可同步或可處于細(xì)胞周期的不同階段。
[0048]當(dāng)提及單個(gè)細(xì)胞時(shí)術(shù)語"同步細(xì)胞"意指細(xì)胞已進(jìn)行操作W使得其處于與在操作 之前細(xì)胞的細(xì)胞周期階段不同的細(xì)胞周期階段?；蛘?，"同步細(xì)胞"是指已進(jìn)行操作W在與 對照細(xì)胞（例如，不存在操作的細(xì)胞）相比時(shí)改變（即，增加或減少）在操作之前細(xì)胞所處 的細(xì)胞周期階段的持續(xù)時(shí)間。
[0049] 術(shù)語"細(xì)胞周期"是指當(dāng)分裂（即增殖）時(shí)細(xì)胞所經(jīng)歷的變化的生理學(xué)和形態(tài)學(xué) 進(jìn)展。細(xì)胞周期通常被認(rèn)為包括被稱為?'司期"、"前期"、"中期"、"后期"和"末期"的階段。 此外，細(xì)胞周期的部分可被稱為"Μ(有絲分裂）"、"S(合成）"、"G0"、"G1 (間隙1期）"和 "G2(間隙2期）"。此外，細(xì)胞周期包括W上所述階段中間的進(jìn)展時(shí)期。
[0050]術(shù)語"細(xì)胞周期抑制"是指細(xì)胞或細(xì)胞群體中細(xì)胞周期進(jìn)展的終止。細(xì)胞周期抑 制通常通過使細(xì)胞暴露于干擾細(xì)胞生理學(xué)的方面W防止細(xì)胞周期繼續(xù)的藥劑（化學(xué)的、蛋 白質(zhì)的或其他）來誘導(dǎo)。
[0051]"增殖"或"細(xì)胞生長"是指親本細(xì)胞重復(fù)地分裂成兩個(gè)子代細(xì)胞、從而導(dǎo)致群體中 細(xì)胞的總體增加的能力。細(xì)胞群體可處于生物體或培養(yǎng)設(shè)備中。
[005引術(shù)語"能夠修飾DNA"或"DNA修飾方式"是指具有誘導(dǎo)或能夠幫助誘導(dǎo)DNA的祀 向區(qū)段的核巧酸序列的變化的工序W及內(nèi)源性或外源性藥劑或試劑。運(yùn)類變化可通過基于 祀向DNA區(qū)段一個(gè)或多個(gè)的缺失、添加或取代來進(jìn)行。DNA序列變化不必賦予由祀向序列編 碼的任何基因的功能性變化。此外，DNA的變化不必對任何特定部分或百分比的細(xì)胞進(jìn)行。
[0053]術(shù)語"目標(biāo)核巧酸序列"是指任何核巧酸序列，所述核巧酸序列的操作可出于任何 原因由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員認(rèn)為是合乎需要的。運(yùn)類核巧酸序列包括但不限于結(jié)構(gòu)基因 (例如，報(bào)道基因、選擇性標(biāo)志物基因、致癌基因、耐藥基因、生長因子等）的編碼序列W及 不編碼mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的非編碼調(diào)控序列（例如，啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列、聚腺巧酸化 序列、終止序列、調(diào)控RNA如miRNA等）。
[0054]"氨基酸序列"、"多膚序列"、"膚序列"和"膚"在本文中可互換使用來指代氨基酸 的序列。
[00巧]如本文所用的"祀序列"是指包含長度優(yōu)選大于8個(gè)核巧酸但長度少于201個(gè)核 巧酸的序列的雙螺旋核酸。在一些實(shí)施方案中，祀序列優(yōu)選地在8至30個(gè)堿基之間。一般 來說，祀序列由雙螺旋核酸上的鏈之一上的核巧酸序列限定。
[0056]如本文所用，當(dāng)提及雙螺旋核酸序列的鏈之一上的核巧酸序列時(shí)，"富含嚷嶺的序 列"或"多嚷嶺序列"被定義為核巧酸的連續(xù)序列，其中祀序列的多于50%的核巧酸包含嚷 嶺堿基。然而，優(yōu)選的是，富含嚷嶺的祀序列含有多于60%的嚷嶺核巧酸，更優(yōu)選多于75% 的嚷嶺核巧酸，下一最優(yōu)選多于90%的嚷嶺核巧酸且最優(yōu)選100%嚷嶺核巧酸。
[0057]如本文所用，當(dāng)提及雙螺旋核酸序列的鏈之一上的核巧酸序列時(shí)，"富含喀晚的序 列"或"多喀晚序列"被定義為核巧酸的連續(xù)序列，其中祀序列的多于50%的核巧酸包含喀 晚堿基。然而，優(yōu)選的是，富含喀晚的祀序列含有多于60%的喀晚核巧酸，且更優(yōu)選地多于 75%的喀晚核巧酸。在一些實(shí)施方案中，序列含有優(yōu)選多于90%的喀晚核巧酸并且在其他 實(shí)施方案中最優(yōu)選100%的喀晚核巧酸。
[0058] 第一核巧酸序列的"變體"被定義為與所述第一核巧酸序列不同的核巧酸序列 (例如，通過具有可使用雜交測定或使用DNA測序檢測的一個(gè)或多個(gè)缺失、插入或取代）。檢 測第一核巧酸序列的基因組序列的改變或修飾包括在此定義內(nèi)。例如，雜交測定可用于檢 測：（1)當(dāng)包含在基因組中時(shí)能夠與第一核巧酸序列雜交的限制酶片段的模式的改變（即， RFLP分析），（2)第一核巧酸序列的選定部分不能與含有第一核巧酸序列的基因組DNA的 樣品雜交（例如，使用等位基因特異性寡核巧酸探針），（3)不適當(dāng)或出人意料的雜交，如 與除第一核巧酸序列的正常染色體基因座之外的基因座雜交（例如，使用巧光原位雜交法 (FISH)用于中期染色體播散等）。變體的一個(gè)實(shí)例是突變的野生型序列。
[0059] 如本文所用的術(shù)語"核酸"和"未修飾的核酸"是指已知的四種脫氧核糖核酸堿基 (即鳥嚷嶺、腺嚷嶺、胞喀晚和胸腺喀晚）中的任一種。術(shù)語"修飾的核酸"是指其結(jié)構(gòu)相對 于未修飾的核酸的結(jié)構(gòu)改變的核酸。運(yùn)類修飾的示例性將是堿基的置換共價(jià)修飾，如氨基 和環(huán)氮的烷基化W及雙鍵的飽和。
[0060] 如本文所用，當(dāng)用于提及核酸序列時(shí)術(shù)語"突變"和"修飾"W及其語法等效物可 互換地用來指代缺失、插入、取代、鏈分解和/或加合物的引入。"缺失"被定義為其中一個(gè) 或多個(gè)核巧酸不存在的核酸序列的變化。"插入