一種基于zdf大鼠的糖尿病合并冠心病動(dòng)物模型的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物模型技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于ZDF大鼠的糖尿病合并冠心病動(dòng)物模型的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病改變了多種細(xì)胞的功能，包括血管的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及血小板細(xì)胞，這些均可導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈硬化、血管內(nèi)斑塊形成。并且，糖尿病伴有冠心病患者的冠狀動(dòng)脈病變更加嚴(yán)重，表現(xiàn)在病變的范圍更廣范，常為多支血管受累，每支血管彌漫性多處受累；冠狀動(dòng)脈多為嚴(yán)重狹窄，并且患糖尿病的時(shí)間越長(zhǎng)，狹窄程度更高。雖然糖尿病伴有冠心病患者的冠脈病變嚴(yán)重，但是糖尿病患者由于經(jīng)常合并神經(jīng)病變，疼痛的感覺減弱，所以常常沒有典型的冠心病心絞痛表現(xiàn)，而更多見無癥狀的心肌缺血、沒有征兆的心肌梗死，甚至猝死，對(duì)生命造成巨大的威脅。因此，糖尿病患者應(yīng)該警惕在不知不覺中發(fā)生并進(jìn)展的冠心病，做到早期預(yù)防、早期診斷、合理治療。
[0003]ZDF大鼠是常用的2型DM模型動(dòng)物，該鼠由于瘦素受體突變導(dǎo)致多食、肥胖同時(shí)伴有高胰島素血癥、高脂血癥和中度高血壓。雄性ZDF大鼠一般于8?10周出現(xiàn)DM，有DM的典型癥狀如多飲、多尿和體重增加緩慢，并可出現(xiàn)神經(jīng)病變。雄性ZDF大鼠肌肉GLUT4表達(dá)明顯降低，其胰島辟田胞GLUT2表達(dá)也明顯下調(diào)，這可能是ZDF大鼠發(fā)生2型糖尿病的機(jī)制。組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，6周齡大鼠胰島即表現(xiàn)有結(jié)構(gòu)紊亂和纖維化、胰島β細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象，同時(shí)胰島β細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)低于相同周齡的非糖尿病癥狀ZDF大鼠。
[0004]目前構(gòu)建糖尿病合并冠心病大鼠模型周期長(zhǎng)、成功率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種基于ZDF大鼠的糖尿病合并冠心病動(dòng)物模型的建立方法。
[0006]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0007]本發(fā)明的基于ZDF大鼠的糖尿病合并冠心病動(dòng)物模型的建立方法的具體步驟如下:
[0008]將患糖尿病的ZDF雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，每天皮下注射鹽酸異丙腎上腺素注射液，注射量為Img.kg—工，連續(xù)10天。
[0009]ZDF大鼠是常用的2型DM模型動(dòng)物，該鼠由于瘦素受體突變導(dǎo)致多食、肥胖同時(shí)伴有高胰島素血癥、高脂血癥和中度高血壓。雄性ZDF大鼠一般于8?10周出現(xiàn)DM，有DM的典型癥狀如多飲、多尿和體重增加緩慢，并可出現(xiàn)神經(jīng)病變。
[0010]本方法采用以下步驟構(gòu)建糖尿病冠心病動(dòng)物模型:
[0011]①大鼠分組。大鼠包括糖尿病癥狀和非糖尿病癥狀大鼠。非糖尿病大鼠作為空白對(duì)照組(n = 6)和正常對(duì)照組，糖尿病癥狀大鼠分為兩組，分別為模型組1、模型組2。
[0012]②適應(yīng)性喂養(yǎng)。非糖尿病大鼠(空白對(duì)照組和正常對(duì)照組)采用普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病癥狀ZDF組(模型組I和模型組2)采用高脂飼料喂養(yǎng)，2周后開始給藥。喂養(yǎng)飼料不變。
[0013]③給藥。采用皮下注射方式給藥糖尿病癥狀ZDF大鼠?？瞻讓?duì)照組和模型組I注射生理鹽水，正常對(duì)照組和模型組2注射鹽酸異丙腎上腺素ISO。每天上午給藥，給藥劑量Img.kg—工，連續(xù)給藥5-10天。
[0014]④模型評(píng)價(jià)。采樣點(diǎn)取樣:血清、心臟組織(切片形態(tài))。檢測(cè)血清肌酸激酶(CK)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性，觀察組織形態(tài)變化，評(píng)價(jià)模型。
[0015]本發(fā)明的積極效果如下:
[0016]本發(fā)明的糖尿病合并冠心病動(dòng)物模型的建立方法基于ZDF大鼠，采用連續(xù)給藥和高脂飼養(yǎng)相結(jié)合構(gòu)建糖尿病合并冠心病動(dòng)物模型，周期短、成模率高。
【附圖說明】
[0017]圖1是大鼠血清CK活性的變化圖；
[0018]組一:空白；組二:正常;組三:模型I;組四:模型2。
[0019]圖2是大鼠血清CK-MB活性的變化圖；
[0020]組一:空白；組二:正常;組三:模型I;組四:模型2。
[0021 ]圖3是心肌組織切片形態(tài)圖；
[0022]A.空白對(duì)照B.連續(xù)注射5天ISO模型鼠C.連續(xù)注射10天ISO模型鼠。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0024]實(shí)施例1
[0025]1.材料和方法
[0026]1.1主要試劑、材料與儀器
[0027]湘儀H2050R高壓冷凍離心機(jī)(本溪泰斯特捷生物科技有限公司)Thermo Fisher酶免分析儀(北京市海淀區(qū)天石醫(yī)療用品制作所)，肌酸激酶(CK)試劑盒，肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒均來自南京安培化工科技有限公司，鹽酸異丙腎上腺素注射液(ISO，規(guī)格:lmg/2mL，上海禾豐制藥有限公司)。
[0028]1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0029]ZDF雄性大鼠，8周齡，SPF級(jí)，包括對(duì)照鼠(未患糖尿病，體重220?240g)與模型鼠(患糖尿病，體重330?350g)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。培養(yǎng)條件:室溫(20±2)°C，濕度(50±20)%。2.實(shí)驗(yàn)方法
[0030]2.1大鼠分組及模型制作
[0031 ]大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)分成4組:
[0032]①空白對(duì)照組。未患糖尿病大鼠每天皮下注射生理鹽水，連續(xù)10天，第11天早晨采樣。
[0033]②正常對(duì)照組。未患糖尿病大鼠每天皮下注射IS0(lmg.kg—O，連續(xù)10天。分別于注射IS05天后、10天后，即實(shí)驗(yàn)開始第6天(采樣點(diǎn)I，造模5天)、第11天(采樣點(diǎn)2，造模10天)
早晨采樣。
[0034]③模型組I。患糖尿病大鼠每天皮下注射生理鹽水(Img.kg—O，連續(xù)10天，第11天早晨采樣。
[0035]④模型組2?；继悄虿〈笫蟠笫竺刻炱は伦⑸銲S0(lmg.kg—O，連續(xù)10天。分別于注射ISO 5天后、10天后，即實(shí)驗(yàn)開始第6天(采樣點(diǎn)I，造模5天)、第11天(采樣點(diǎn)2，造模10天)早晨采樣。采樣點(diǎn)1、2采集血漿進(jìn)行CK和CK-MB的測(cè)定。在采樣點(diǎn)I處死半數(shù)老鼠，在采樣點(diǎn)2處死其余老鼠，取心臟組織，制作切片觀察形態(tài)。
[0036]2.2血漿與心臟標(biāo)本采集。
[0037]采樣前大鼠禁食12h，可自由飲水。采用眼內(nèi)眥取血法，從各組ZDF大鼠均由眼眶采取血0.5ml至肝素鈉化得離心管中，1600Xg離心lOmin，轉(zhuǎn)移上層血漿，置于含有肝素的試管中，肝素抗凝血清直接用于CK和CK-MB的測(cè)定。取大鼠心臟，用于心肌組織切片的檢測(cè)。
[0038]2.3常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)
[0039]CK、CK-MB的分析分別采用CK試劑盒、CK-MB試劑盒檢測(cè)。采樣點(diǎn)采集的血樣肝素抗凝后分離血清，立即用Thermo Fisher酶免分析儀在波長(zhǎng)為450nm下測(cè)定血楽CK和CK-MBS力。
[0040]3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果[0041 ] 3.1CK含量的變化
[0042]組一、組二是未患糖尿病的ZDF大鼠，組三、組四為患糖尿病的ZDF大鼠，其CK含量在各組間的變化及實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論如下:
[0043]糖尿病鼠比正常鼠CK酶活性高(圖1)，未給藥組和給藥組第5天差異不明顯(p>
0.05)，第10天差異顯著(p<0.05)。無論患糖尿病組或未患糖尿病組，皮下注射ISO后CK酶活性均顯著增高(P<0.05)，酶活性值與給藥時(shí)間成正比，且患糖尿病鼠酶活性增高更為顯著(ρ<0.05)ο
[0044]3.2CK-MB含量的變化
[0045]無糖尿病鼠比患糖尿病鼠CK-MB酶活性高(圖2)，且給藥第5天時(shí)最為顯著(ρ<
0.05)，給藥第10天酶活性無顯著差異(ρ>0.05)。無論是糖尿病組還是正常組大鼠，給ISO后CK-MB酶活性均是先升高后降低，且降低幅度較大。
[0046]3.3組織形態(tài)變化
[0047]血清CK上升提示大鼠心肌損傷已形成。心肌病理切片結(jié)果顯示空白對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞正常(圖3A);模型大鼠在被連續(xù)注射ISO五天后即造成心肌損傷，主要病變?yōu)樾膬?nèi)膜下心肌壞死，呈多灶性條索狀、大片壞死，壞死面積超過心肌截面的1/2，壞死處細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，有少許纖維母細(xì)胞和新生小血管(圖3B);連續(xù)10天注射ISO后，心肌損傷范圍增大至心肌截面的3/4以上，壞死出炎細(xì)胞大量減少，纖維母細(xì)胞增多，出現(xiàn)肉芽組織增生修復(fù)(圖3C)。
[0048]CK、CK-MB的活性變化和心肌組織形態(tài)變化證明造模成功。經(jīng)過2周適應(yīng)性喂養(yǎng)和1天的藥物注射(共24天)，6只ZDF大鼠中的5只出現(xiàn)顯著的CK、CK-MB的活性變化和心肌組織形態(tài)變化，I只死亡。造模成功率大于80 %。
[0049]盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于ZDF大鼠的糖尿病合并冠心病動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于:所述方法的具體步驟如下: 將患糖尿病的ZDF雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，每天皮下注射鹽酸異丙腎上腺素注射液，注射量為Img.kg—、連續(xù)10天。2.如權(quán)利要求1所述的基于ZDF大鼠的糖尿病合并冠心病動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于:本方法采用以下步驟構(gòu)建糖尿病冠心病動(dòng)物模型: ①大鼠分組:大鼠包括糖尿病癥狀和非糖尿病癥狀大鼠，非糖尿病大鼠作為空白對(duì)照組(n = 6)和正常對(duì)照組，糖尿病癥狀大鼠分為兩組，分別為模型組1、模型組2; ②適應(yīng)性喂養(yǎng):非糖尿病大鼠(空白對(duì)照組和正常對(duì)照組)采用普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病癥狀ZDF組(模型組I和模型組2)采用高脂飼料喂養(yǎng)，2周后開始給藥，喂養(yǎng)飼料不變； ③給藥:采用皮下注射方式給藥糖尿病癥狀ZDF大鼠，空白對(duì)照組和模型組I注射生理鹽水，正常對(duì)照組和模型組2注射鹽酸異丙腎上腺素ISO，每天上午給藥，給藥劑量Img.kg一、連續(xù)給藥5-10天； ④模型評(píng)價(jià):采樣點(diǎn)取樣:血清、心臟組織(切片形態(tài))，檢測(cè)血清肌酸激酶(CK)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性，觀察組織形態(tài)變化，評(píng)價(jià)模型。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于ZDF大鼠的糖尿病合并冠心病動(dòng)物模型的建立方法。本發(fā)明的方法是將患糖尿病的ZDF雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，每天皮下注射鹽酸異丙腎上腺素注射液，注射量為1mg·kg-1，連續(xù)10天。通過檢測(cè)血清肌酸激酶(CK)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性，觀察組織形態(tài)變化，評(píng)價(jià)模型。本發(fā)明基于ZDF大鼠，采用連續(xù)給藥結(jié)合高脂飼養(yǎng)構(gòu)建糖尿病合并冠心病動(dòng)物模型，周期短、成模率高。
【IPC分類】A01K67/02
【公開號(hào)】CN105532564
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510867726
【發(fā)明人】朱超, 朱瑩瑩, 張志芹, 周開文, 曾強(qiáng)成, 沈亮
【申請(qǐng)人】朱超
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2015年12月3日