一種大花蕙蘭人工種子制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領域，具體涉及一種大花蕙蘭人工種子制作方法。
【背景技術】
[0002]大花蕙蘭(CymbidiumHybrid)為蘭科蘭屬植物中的部分大花型附生種的雜交種，是世界上銷量最高的洋蘭之一。大花蕙蘭花色鮮艷、花期長，觀賞性極高，深受世界蘭花愛好者的歡迎。由于大花蕙蘭多為雜交品種，種子自然結(jié)實率相當?shù)?，且種子發(fā)育不完全，沒有胚乳，常規(guī)情況下極難萌發(fā)，需要采用無菌播種技術才能萌發(fā)，后代萌發(fā)種子多出現(xiàn)性狀分離，加之大花蕙蘭分株能力弱，因而繁殖困難，繁殖速度慢，遠遠不能滿足商品化生產(chǎn)的要求，而組織培養(yǎng)技術已成為大花蕙蘭規(guī)?；敝撑c生產(chǎn)的重要手段(陳璋，2004)。國內(nèi)研究大花蕙蘭快速繁殖體系的報道雖多，但多集中在無菌苗增殖等方面，而采用類原球莖液體震蕩培養(yǎng)對大花蕙蘭增殖和人工種子包埋尚未見報道。
[0003]大花蕙蘭常規(guī)組培苗工廠化生產(chǎn)，通常采用不定芽增殖和生根培養(yǎng)技術，操作步驟繁瑣，生長周期長，機械化程度低，費工費時，能耗高，生產(chǎn)成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種大花蕙蘭人工種子制作方法，以克服現(xiàn)有技術的上述缺陷。
[0005]本發(fā)明的技術方案如下:
[0006]—種大花蕙蘭人工種子制作方法，包括以下步驟:
[0007]a)類原球莖誘導:以大花蕙蘭無菌苗莖尖為材料接種于類原球莖誘導培養(yǎng)基生長，誘導形成類原球莖；
[0008]b)原球莖增殖:步驟a)得到的類原球莖在固體增殖培養(yǎng)基生長20-30天后，轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基進行增殖生長20-30天，增殖之后的大花蕙蘭類原球莖用于人工種子制作和包埋；
[0009]c)大花蕙蘭人工種子制作與萌發(fā):將步驟b)得到的類原球莖切分成單個類原球莖，采用海藻酸鈉溶液和CaCl2包埋，凝固形成的人工種子經(jīng)過無菌和溫室萌發(fā)。
[0010]所述步驟a)中類原球莖誘導為將無菌苗莖尖接種到l/2MS+NAA0.5-2.0mg.L—工+椰乳50-150ml.L一W蔗糖30-40g.L—k瓊脂5.5-7.0g.L-1+活性炭1.0g.L—1的培養(yǎng)基上誘導形成類原球莖。
[0011]所述步驟b)中大花蕙蘭類原球莖的固體增殖的步驟為:挑選生長狀態(tài)接近的類原球莖，接種到 1/2MS固體培養(yǎng)基添加NAA 1.0-2.5mg.L_1+6-BA 0.5-1.0mg.L一1 生長20-30天.’
[0012]所述步驟b)中大花蕙蘭類原球莖的液體增殖的步驟為:選用容積為100-500ml的三角瓶為培養(yǎng)容器，將類原球莖接種到l/2MS+NAA2.0-2.5mg0.5-1.0mg.L—1液體培養(yǎng)基中，每瓶接種2.0g，培養(yǎng)時間為20-30天，液體生長20天的類原球莖用于人工種子包埋。
[0013]所述步驟c)大花蕙蘭人工種子制作與萌發(fā)包括以下步驟:
[0014]將海藻酸鈉溶解于1/2MS培養(yǎng)液中，配制成質(zhì)量濃度為2%_3%的海藻酸鈉溶液，高溫高壓滅菌。在無菌條件下，選擇飽滿硬脆的綠色類原球莖，分離直徑5.0mm左右的顆粒置于海藻酸鈉溶液中，然后用滴管吸取含有類原球莖的溶液滴入作為凝聚劑的2%CaCl2溶液中，形成直徑8.0mm左右的凝膠顆粒，20min后取出，以無菌水沖洗三次，置于培養(yǎng)皿中貯存?zhèn)溆?此外，人工種皮中需添加NAA0.5-2.0mg.^+Θ-ΒΑΟ.5-1.0mg.L—1;
[0015]挑取未萌發(fā)的類原球莖，將類原球莖接種到鋪有干燥濾紙的培養(yǎng)皿及鋪有以無菌水濕潤的濾紙的培養(yǎng)皿中，恒溫培養(yǎng)20天。以不加有機元素的1/2MS+NAA0.5-2.0mg.1^+6-BAl.0-2.0mg.L—1配置2%的海藻酸鈉溶液，包埋上述類原球莖。得到的人工種子置于純瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，萌發(fā)率達到90 %以上；
[0016]人工種子萌發(fā):包埋形成的人工種子接種在無激素無營養(yǎng)培養(yǎng)基中統(tǒng)計萌發(fā)率，萌發(fā)率可達90 %以上;直接播種萌發(fā)，萌發(fā)率可達到80 %以上。
[0017]以上條件所用培養(yǎng)基除注明外，均添加3%的蔗糖和100_150ml.L_1椰子汁，活性炭1-2%，pH值調(diào)至5.4-5.6，培養(yǎng)條件為光照1000Ix，16h光周期，25°C培養(yǎng)。
[0018]本發(fā)明的有益效果是:
[0019]迄今為止，蘭科花卉人工種子制作技術的研究在石斛蘭、文心蘭、黃蟬蘭等已有報道，但關于大花蕙蘭人工種子的制作技術在國內(nèi)外尚未見報道。本發(fā)明建立了大花蕙蘭類原球莖液體培養(yǎng)基中快速增殖的基礎上，以類原球莖為材料采用海藻酸鈉和CaCl2為人工種皮進行人工種子的制作，包埋的人工種子能正常萌發(fā)和成苗，該技術的進一步應用可以促進大花蕙蘭優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率，降低種苗生產(chǎn)成本。
[0020]而人工種子作為繁殖材料較無菌苗移栽具有更多的優(yōu)越性。將類原球莖包埋制成人工種子則可以適用于種苗的機械化生產(chǎn)，縮短組織培養(yǎng)周期，提高種苗生產(chǎn)效率，降低成本，提高種苗發(fā)芽率和整齊度，提高生產(chǎn)效率。
[0021]本發(fā)明方法可以用于不同大花蕙蘭品種的人工種子的制作，溫室播種萌發(fā)后形成的種苗可以代替常規(guī)組培苗進行大花蕙蘭種苗的生產(chǎn)，降低大花蕙蘭種苗生產(chǎn)成本。
[0022]本發(fā)明以大花蕙蘭莖尖誘導形成的類原球莖為材料，進行人工種子制作和包埋。類原球莖采用固體和液體兩種培養(yǎng)基交替培養(yǎng)，生長速度快，增殖系數(shù)高，以液體培養(yǎng)增殖的類原球莖為材料，采用海藻酸鈉和氯化鈣進行人工種子包埋，人工種子種皮穩(wěn)定，質(zhì)量高，進一步培養(yǎng)萌發(fā)率高。
【具體實施方式】
[0023]下面對本發(fā)明作進一步描述:
[0024]實施例一:以大花蕙蘭品種‘4073’為材料進行下列操作。
[0025](1)供試材料:大花蕙蘭莖尖誘導類原球莖，接種到1/21^+嫩40.511^.L—工+椰乳10ml.L—4蔗糖30g.L—1+瓊脂6.0g.L—1+活性炭1.0g.L—1的培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導出的類原球莖；
[0026]大花蕙蘭類原球莖固體增殖:挑選生長狀態(tài)接近的類原球莖，在無菌條件下稱重，接種到1/2MS添加NAA 2.0mg.L^+e-BAl.0mg.L—S生長30天后進行固體培養(yǎng)增殖；
[0027]選用容積為10ml的三角瓶為培養(yǎng)容器，將類原球莖接種到1/2MS+NAA2.0mg.L"1+6-BA0.5mg.L—1液體培養(yǎng)基上，每瓶接種2.0g;
[0028]將類原球莖接種到l/2MS+NAA2.0mg.L^+6-BAl.0mg.L—1液體培養(yǎng)基上，對其進行20d的培養(yǎng)，每瓶接種2.0g。
[0029](2)大花蕙蘭人工種子制作與萌發(fā)
[0030]將海藻酸鈉溶解于1/2MS液體培養(yǎng)基中，配制質(zhì)量濃度為2%的海藻酸鈉溶液，高溫高壓蒸汽滅菌。在無菌條件下，選擇飽滿硬脆的綠色類原球莖，分離直徑5.0mm左右的顆粒置于質(zhì)量濃度分別為2%的海藻酸鈉溶液中，然后用滴管吸取溶液滴入作為凝聚劑的質(zhì)量濃度為2%的CaCl2溶液中，形成直徑8.0mm左右的凝膠顆粒，20min后取出，制作成類原球莖人工種子。以無菌水沖洗三次，平置于純瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。
[0031]在種皮中添加NAA0.5mg.L^+6-BAl.0mg.L—1，除了以上成分外，種皮中都添加2%海藻酸鈉。
[0032]挑取未萌發(fā)的類原球莖，分別接種添加l/2MS+2.0mg.L^NAA+6-BAl.0mg.L—1的固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；同時將類原球莖接種到鋪有干燥濾紙的培養(yǎng)皿及鋪有以無菌水濕潤的濾紙的培養(yǎng)皿中，恒溫培養(yǎng)2O天。以不加有機元素的I /2MS+NAA0.5mg.L—1+6-B