快速高效獲得無(wú)菌哺乳動(dòng)物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種快速高效獲得無(wú)菌哺 乳動(dòng)物的方法以及所獲得的無(wú)菌哺乳動(dòng)物的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的迅猛發(fā)展，作為生命科學(xué)支撐條件的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)也得到了前 所未有的重視，不但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究?jī)?nèi)容進(jìn)一步拓展、加深；而且對(duì)于高級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的 需求也越來(lái)越多，要求越來(lái)越嚴(yán)格。從普通級(jí)別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的被取消，到清潔級(jí)動(dòng)物，無(wú)特定 病原體動(dòng)物（Specific pathogen-free animal, SPF)的大量需求，再到無(wú)菌動(dòng)物包括各種 已知微生物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（悉生動(dòng)物），為生命科學(xué)的研究的精細(xì)化、數(shù)量化、穩(wěn)定可重復(fù)性 提供了支撐。
[0003] 然而，各種高級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須飼養(yǎng)在特定的SPF屏障系統(tǒng)中，而無(wú)菌動(dòng)物飼 養(yǎng)的條件更加嚴(yán)格，稍有不慎很容易感染細(xì)菌病毒，即使是非致病菌，也造成了微生物等級(jí) 的下滑。低級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須通過(guò)環(huán)境消毒配合生物凈化的手段來(lái)重新獲得高級(jí)別實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物。
[0004] 傳統(tǒng)的生物凈化為剖腹取胎，即將待凈化的動(dòng)物交配懷孕，等到接近臨盆的時(shí)候， 剖腹，連同子宮和胎兒通過(guò)凈化藥液進(jìn)入隔離手術(shù)操作器內(nèi)，剖開(kāi)子宮取出胎兒，待胎兒能 自由呼吸后傳送給帶奶母鼠，哺乳到斷奶。這種傳統(tǒng)的剖腹取胎的方式的缺點(diǎn)在于：1、當(dāng)發(fā) 生大規(guī)模污染時(shí)，不能盡快的恢復(fù)較大的種群，需要時(shí)間間隔較長(zhǎng)；2、剖腹取胎容易造成剖 腹過(guò)程中仔鼠死亡，主要由于仔鼠肺部不能及時(shí)張開(kāi)自主呼吸；3、剖腹取胎的仔鼠容易被 帶奶母鼠吃仔，因?yàn)閹棠甘筇烊坏哪感?，?huì)將不是自己所生的仔鼠咬死，甚至吃仔。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中雖然也有一些其它替代方法，但對(duì)于最高級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物-無(wú)菌動(dòng)物 而言，這些方法依然存在存活率低（不足50% )、凈化所需要時(shí)間周期長(zhǎng)（60天左右）、種群 大（制備代乳母鼠的雌鼠及與之交配的雄鼠；需要生物凈化的雌鼠及與之交配的雄鼠）等 缺陷。
[0006] 因此，本領(lǐng)域急需一種快速、高效、簡(jiǎn)便而且成功率高的無(wú)菌哺乳動(dòng)物制備方法， 從而能夠用于生物學(xué)或醫(yī)學(xué)研究工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種快速、高效、簡(jiǎn)便而且成功率高地制備無(wú)菌哺乳動(dòng)物的 制備方法，以及采用本發(fā)明方法制備得到無(wú)菌哺乳動(dòng)物作為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用途。
[0008] 在第一方面，本發(fā)明提供一種無(wú)菌哺乳動(dòng)物的制備方法，所述方法包括以下步 驟：
[0009] a).獲得雄性哺乳動(dòng)物的精子并使所得精子獲能；
[0010] b).獲得雌性哺乳動(dòng)物的卵子；
[0011] C).利用步驟a)獲得的精子與步驟b)獲得的卵子制備受精卵；
[0012] d).獲得無(wú)精雄性哺乳動(dòng)物；
[0013] e).制備假孕雌性哺乳動(dòng)物；
[0014] f).利用步驟c)獲得的受精卵制備胚胎；
[0015] g).獲得含有步驟f)所得胚胎的假孕雌性哺乳動(dòng)物；和
[0016] h).無(wú)菌培養(yǎng)步驟g)獲得的雌性哺乳動(dòng)物，得到無(wú)菌哺乳動(dòng)物。
[0017] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(1)、6)和〇在36°(：-37°(：的溫度以及45%-70%的濕 度下進(jìn)行。
[0018] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(1)、6)和〇在36.5°(：-37°(：的溫度以及50%-60%的 濕度下進(jìn)行。
[0019] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟b)所述的雌性哺乳動(dòng)物是超排卵雌性哺乳動(dòng)物。
[0020] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述超排卵雌性哺乳動(dòng)物是通過(guò)給予藥物獲得，或者是經(jīng) 遺傳改造獲得的，或者商品化購(gòu)得。
[0021] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟d)所述的無(wú)精雄性哺乳動(dòng)物通過(guò)給予藥物獲得，或者 是經(jīng)遺傳改造獲得，或者商品化購(gòu)得。
[0022] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟f)制備的胚胎是2-8細(xì)胞期胚胎，優(yōu)選2細(xì)胞期胚胎。
[0023] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物選自小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、狗、或猴。
[0024] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物是小鼠、大鼠或豚鼠。
[0025] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法還包括利用步驟h)獲得的無(wú)菌哺乳動(dòng)物制備悉 生哺乳動(dòng)物。
[0026] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明方法獲得無(wú)菌哺乳動(dòng)物的存活率為多30%，優(yōu)選 彡50% ;最優(yōu)選彡70%。
[0027] 在第二方面，本發(fā)明提供通過(guò)本發(fā)明第一方面所述方法制備的哺乳動(dòng)物作為標(biāo)準(zhǔn) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用途。
[0028] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物可用于研究某些疾病的病原、研究微生物與 宿主、微生物間的拮抗作用、研究病毒病、研究細(xì)菌學(xué)、免疫發(fā)生發(fā)展機(jī)制、放射醫(yī)學(xué)等等。
[0029] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物選自小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、狗、或猴；優(yōu) 選地，所述哺乳動(dòng)物是小鼠、大鼠或豚鼠。
[0030] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)在特定的溫度和濕度下，結(jié)合體 外受精-胚胎移植技術(shù)，可以迅速、方便地完成低微生物級(jí)別的生物凈化工作；由于胚胎直 接移植給高級(jí)別的假孕母獸，這樣可以讓假孕母獸自然分娩，自然哺乳，避免了剖腹取胎中 出現(xiàn)的仔獸的死亡和被死亡，從而顯著提高仔鼠的存活率。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0032] 本文所用的術(shù)語(yǔ)，"悉生動(dòng)物"（Gnotobiotic animal)，也稱(chēng)為已知菌動(dòng)物或已知 菌叢動(dòng)物（Animal with Known Bacterial Flora)，是指采用與無(wú)菌動(dòng)物相同的方法取得 飼養(yǎng)（剖腹取胎，在隔離器內(nèi)飼養(yǎng)）、但明確給予已知微生物的動(dòng)物，即，含有已知的單菌 (Monoxenie)、雙菌（Dixenie)、三菌（Trixenie)或多菌（Polyxenie)的動(dòng)物。
[0033] 悉生動(dòng)物的培育、悉生狀態(tài)的維持、悉生動(dòng)物與其體內(nèi)外棲息體或棲息體間以宿 主為載體展開(kāi)的相互競(jìng)爭(zhēng)、拮抗的復(fù)雜生態(tài)過(guò)程，以及這種過(guò)程導(dǎo)致的后果的控制和利用， 稱(chēng)為悉生動(dòng)物學(xué)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在現(xiàn)代化發(fā)展過(guò)程中，吸取悉生動(dòng)物的凈化與悉生工程的屏障 技術(shù)，發(fā)展了以控制動(dòng)物體內(nèi)外微生物寄生蟲(chóng)為核心的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的環(huán)境控制，并以這種生 物控制為標(biāo)準(zhǔn)，把實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為以下幾個(gè)級(jí)別：1)無(wú)菌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（Germ-free animal) ;2) 悉生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（Gnotobiotic animal):包括無(wú)抗體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（Antibody-free animal)、 已知微生物體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（Gnotophoric animal) ;3)無(wú)特定病原體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（Specific pathogen-free animal) ;4)清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（Cleaning animal);和5)普通級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 (Conventional animals)。2001年頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量管理辦法》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證 管理辦法》中明確不再提供普通級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須達(dá)到清潔級(jí)或以上標(biāo)準(zhǔn)。
[0034] 高級(jí)別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的運(yùn)用，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、可重復(fù)性、 精確性，并能以最小數(shù)量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得最多的、可用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，這也符合國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 領(lǐng)域一直宣傳的3R原則（減量化（reducing)，再利用（reusing)和再循環(huán)（recycling))。 清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是目前國(guó)內(nèi)科研工作主要要求的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，適用于大多數(shù)科研實(shí)驗(yàn)。 無(wú)特定病原體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（SPF)是理想的健康動(dòng)物，用它來(lái)研究，可排除疾病或病原的干擾， 適用于所有科研實(shí)驗(yàn)、生物制品生產(chǎn)及檢定，是國(guó)際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
[0035] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"無(wú)菌動(dòng)物"(GF)是指不能檢出任何活的微生物和寄生蟲(chóng)的動(dòng)物。 從微生物學(xué)的觀點(diǎn)看，通常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體內(nèi)和體外帶有寄生蟲(chóng)，體內(nèi)還常帶有細(xì)菌和病毒， 而且還都難于排除某些潛在的傳染病。此外，普通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血清中含有抗體。所以用普 通動(dòng)物進(jìn)行醫(yī)學(xué)科學(xué)研究，將會(huì)存在各種各樣的干擾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往不確切。使用無(wú)菌動(dòng) 物作實(shí)驗(yàn)就可以克服普通實(shí)驗(yàn)所存在缺點(diǎn)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果正確可靠。無(wú)菌動(dòng)物是一種非常規(guī) 動(dòng)物，僅適用于特殊研究目的，如微生物與宿主、微生物間的相互作用，免疫發(fā)生發(fā)展機(jī)制， 放射醫(yī)學(xué)等方面的研究。例如，無(wú)菌動(dòng)物可用于研究某些疾病的病原：無(wú)菌動(dòng)物可提供組 織培養(yǎng)的無(wú)菌組織