一種幾丁質合成抑制類殺蟲劑及其制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于昆蟲控制領域，具體涉及一種幾丁質合成抑制類殺蟲劑，以及該殺蟲 劑的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 幾丁質（chitin)，又稱甲殼素，是N-乙酰氨基葡萄糖的多聚糖，廣泛存在于真菌和 節(jié)肢動物中，是昆蟲外骨豁、氣管與中腸圍食膜（peritrophic matrix，PM)的重要組分 (Cohen，2001 ;Merzendorfer ,2006)。目前也有研究表明幾丁質也是部分昆蟲蟲卵的重要組 分，比如埃及伊蚊（Aedes aegypti)、赤擬谷盜（Tribolium castaneum)和長紅獵蝽 (Rhodnius prolixus)(Arakane et al.,2008；Mansur et al.,2014；Moreira et al., 2007)。昆蟲幾丁質的生物合成通路始于海藻糖，終止于幾丁質(Candy et al.，1962)，其中 涉及了8個酶的參與，最后一個酶為幾丁質合成酶(Chitin synthase ,CHS)。在其作用下，幾 丁質前體物尿苷二磷酸酯-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)合成為幾丁質。昆蟲生長中要 經(jīng)歷蛻皮和變態(tài)過程，而這些過程中涉及新幾丁質的形成和舊幾丁質的降解。同時幾丁質 強化昆蟲的外骨骼，起到良好的支持作用，并在昆蟲及其蟲卵應對外界環(huán)境壓力和病原侵 害時具有重要的防護功能（Kramer and Koga, 1986;Merzendorfer and Zimoch, 2003; Moussian et al. ,2005)。因此幾丁質合成酶CHS對于昆蟲的生長發(fā)育和繁殖有著非常重要 的作用，下面主要就昆蟲中CHSA的結構和功能作簡要概述。
[0003]昆蟲中存在2個幾丁質合成酶基因，分別為幾丁質合成酶A基因（CHSA)和幾丁質合 成酶B基因（CHSB)。在銅綠果繩(Lucilia cuprina)中克隆得到了第一個昆蟲幾丁質合成酶 基因，后經(jīng)分析為A基因 （Tellam et al.，2000)，而后幾丁質合成酶基因在許多昆蟲中克隆 并得以研究。通過對多個物種的幾丁質合成酶基因的研究，發(fā)現(xiàn)幾丁質合成酶A主要在表皮 和氣管中表達，負責表皮和氣管幾丁質的合成;而幾丁質合成酶B基因僅在中腸中表達，負 責中腸圍食膜幾丁質的合成（Arakane et al.，2004;Merzendorfer and Zimoch，2003;Qu &11(1￥&1^，2011)。在半翅目昆蟲中，如褐飛風（附1&。&1'￥&七&1耶6118)、灰飛風（1^〇(16]^]1&叉 striatellus)、長紅獵蝽僅克隆得到幾丁質合成酶A，并且研究表明半翅目昆蟲的中腸沒有 圍食膜的存在，僅有圍微絨毛膜(perimicroviliar membrane)，是一類包圍中腸微絨毛的 胞外脂蛋白膜(Mansur et al.，2014;Wang et al. ,2012)。這說明在褐飛虱這一類半翅目 昆蟲中，CHSA是最重要的幾丁質合成基因。
[0004]幾丁質合成酶參與幾丁質合成的最后一個環(huán)節(jié)，昆蟲中對其功能已有大量研究。 Moussian等通過果繩krotzkopf verkehrt(kkv，即果繩的CHSA)突變體的研究和RNAi實驗， 發(fā)現(xiàn)昆蟲的發(fā)育是基于幾丁質合成酶的精確表達(Moussian et al. ,2005)。通過RNAi技術 干涉赤擬谷盜幾丁質合成酶基因的表達，顯著降低了幼蟲和成蟲的表皮與中腸中的幾丁質 含量。不同時期的蟲體注射CHSA的dsRNA后，會導致赤擬谷盜在胚胎的孵化障礙和幼蟲、化 蛹及羽化時的蛻皮障礙(Arakane et al.，2005);并且赤擬谷盜成蟲在CHSA被干涉后，蟲卵 的幾丁質含量嚴重下降，導致其無法孵化(Arakane et al. ,2008)。被注射dsCHSA的長紅獵 蝽，卵巢發(fā)育受到影響，同時卵粒出現(xiàn)大量干癟和發(fā)暗的現(xiàn)象，成為死卵(Mansur et al.， 2014;Souza-Ferreira et al. ,2014)。甜菜夜蛾的CHSA基因被干涉后，存活率顯著下降，并 且出現(xiàn)銳皮障礙、無法化蛹和表皮幾丁質層無法形成(Chen et al. ,2008)。
[0005] 由于CHSA在昆蟲生長發(fā)育中的重要性和幾丁質存在的特殊性，許多幾丁質合成酶 抑制劑被開發(fā)用于害蟲控制。這些主要為核苷肽類化合物，如尼克霉素(nikkomycins)類化 合物。此外，還有一類幾丁質合成抑制劑，如苯甲酰基脲類化合物（benzoylphenyIurea， BPU)，雖然其幾丁質合成抑制的作用機制仍有待闡述，但是已經(jīng)有成功商品化的 Diflubenzuron(DFB)和Lufenuron(LFN) (Gangishetti et al ·，2009)。這些殺蟲劑的重要 優(yōu)點是對環(huán)境安全友好。但由于昆蟲抗藥性的增加，以及新型結構研發(fā)難度大，這極大地限 制了此類殺蟲劑的使用，對基于CHSA的昆蟲生長發(fā)育的機理進行深入研究，將有助于我們 尋找到新的幾丁質合成抑制類殺蟲劑。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點和不足，提供一種針對褐飛虱防治效果顯 著的幾丁質合成抑制類殺蟲劑。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供所述幾丁質合成抑制類殺蟲劑的制備方法。
[0008] 本發(fā)明的再一個目的是提供所述幾丁質合成抑制類殺蟲劑在制備用于防治褐飛 虱的藥物中的應用。
[0009] 本發(fā)明的又一個目的是提供使用所述幾丁質合成抑制類殺蟲劑防治褐飛虱的方 法。
[0010] 本發(fā)明的又一個目的是提供含有所述幾丁質合成抑制類殺蟲劑的組合物。
[0011] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術方案：
[0012] -種幾丁質合成抑制類殺蟲劑，包括作為活性成分的雙鏈RNA，所述雙鏈RNA的轉 錄模板的正義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0013] 本發(fā)明還提供了所述幾丁質合成抑制類殺蟲劑的制備方法，包括以下步驟：
[0014] 1)提取褐飛虱總RNA:取若蟲，于液氮中研磨，用TRIzoI法提取總RNA;
[0015] 2)合成CDNA第一鏈:將Iyg總RNA反轉錄為CDNA;
[0016] 3)制備褐飛虱幾丁質合成酶A基因中間片段，以及含有該中間片段的載體；
[0017] 4)以所述步驟3)的含有褐飛虱幾丁質合成酶A基因中間片段的載體為模板，擴增， 得到目的片段。
[0018] 具體地，步驟3)的具體操作如下：
[0019] 步驟1、聚合酶鏈式反應:試劑為模板cDNA 1μL、10μΜ的褐飛虱幾丁質合成酶A基因 特異性上游引物NlCHSA-F 1μL、10μΜ的褐飛虱幾丁質合成酶A基因特異性下游引物犯0^八-R lyL、2XHiFi Taq PCR mix 12.5yL、雙蒸水9.5yL，總體積為25yL;上述聚合酶鏈式反應 的具體步驟如下:將上述混合液95°C預變性5min，然后進入下列循環(huán):95°C變性30s，55°C退 火30s，72°C延伸60s，共35個循環(huán)，最后72°C再延伸IOmin;其中，擴增褐飛虱幾丁質合成酶A 基因特異性片段的上游引物NICHSA-F的序列為:5 ' -GAAGACAAGGCTGAGAAGG-3 ' ；下游引物 NlCHSA-R的序列為：5' -GGAATCGITTGCGGAAGG-3' ；
[0020]步驟2、擴增產(chǎn)物純化:使用Magen凝膠回收試劑盒純化PCR擴增片段；
[0021 ]步驟3、中間載體獲得:將純化產(chǎn)物按照下列連接反應體系，克隆到pMD-18T載體， 轉化大腸桿菌DH5a，在含有100微克/毫升氨節(jié)青霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)；
[0022]連接反應體系： 純化產(chǎn)物 3pL PMDl 8-T
[0023] 連接緩沖液5pL 雙蒸水補足1〇μL
[0024] 步驟4、質粒純化:將菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37 °C搖床過夜培養(yǎng)后收取菌液，抽 提質粒。
[0025] 具體地，所述步驟4)的具體操作如下：
[0026]步驟1、設計以下特異性引物：
[0027] dsCHSA-F:5 '-GAAGACAAGGCTGAGAAGG-3，
[0028] dsCHSA-R:5 '-GGAATCGTTTGCGGAAGG-3 '
[0029] dsCHSA-T7F:5 '-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAAGACAAGGCTGAGAAGG-3，
[0030] dsCHSA-T7R:5 '-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGGAATCGTTTGCGGAAGG-3 '
[0031]步驟2、含有褐飛虱幾丁質合成酶A基因的質粒命名為pMDT-CHSA，以其為模板，使 用上述引物分別按照以下反應條件擴增，得到目的片段：
[0032] A反應體系如下： 2 X HiFi PCR mix 1.2.5pL， pMDT-CHSA 質粒 DNA IgL, ΙΟμΜ dsCHSA-F 引物 lpiL，
[0033] 1 ΟμΜ dsCHSA-T7R 引物 1 μι， 雙蒸水 9:5μ：?， 總體積 25pL;
[0034] B反應體系如下： 2xHiFi PCR mix 12 5μ?！梗?pM DT-CHSA ItiiIA DNA IgL, l_MdsCHSA-T7-F 引物 WL,
[0035] IC^M dsCHSA-R 引物 ΙμL， 雙蒸水 9 5μΙ， 總:體積 25pL..,
[0036] PCR儀擴增程序：94°C預變性5min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s，30個 循環(huán);72 °C再延伸IOmin;
[0037] 通過dsRNA合成試劑盒合成幾丁質合成酶基因對應的雙鏈RNA。
[0038] 本發(fā)明還提供了所述幾丁質合成抑制類殺蟲劑在制備用于防治褐飛虱的藥物中 的應用。
[0039] 本發(fā)明還提供了使用所述幾丁質合成抑制類殺蟲劑防治褐飛虱的方法，其包括： 將所述幾丁質合成抑制類殺蟲劑單獨混在飼料中，對褐飛虱進行飼喂。
[0040] 優(yōu)選地，所述雙鏈RNA在飼料中的終濃度為0.1 ygAiL至0.5yg/yL。
[0041] 本發(fā)明還提供了含有所述幾丁質合成抑制類殺蟲劑的組合物。
[0042] 目前防治褐飛虱的主要辦法包括農(nóng)業(yè)防治、化學防治和生物防治，由于化學藥物 帶來的抗性作用以及環(huán)境污染等問題，使得褐飛虱防治工作難以得到持續(xù)性發(fā)展。本發(fā)明 的幾丁質合成抑制殺蟲劑的主要活性成分為雙鏈RNA(dsRNA)，該雙鏈RNA的轉錄模板為褐 飛虱幾丁質合成酶A基因（NlCHSA)。本發(fā)明通過利用褐飛虱幾丁質合成通路上的重要基因， 篩選得到雙鏈RNA，將其用以褐飛虱防治，可有效阻礙幾丁質的合成，從而阻礙褐飛虱的正 常發(fā)育和繁殖，防治效果顯著，而且不會產(chǎn)生抗藥性和環(huán)境污染，不破壞生態(tài)環(huán)境，安全環(huán) 保。
【附圖說明】
[0043]圖1是飼喂dsCHSA后褐飛虱的存活率圖。
[0044]圖2是飼喂dsCHSA后褐飛虱的表型變化圖。
[0045]圖3是注射dsCHSA后褐飛虱的后代孵化率圖。
[0046] 圖4是飼喂dsCHSA后褐飛虱的mRNA表達量圖。
[0047]圖5是飼喂dsCHSA后褐飛虱的幾丁質含量圖。
【具體實施方式】
[0048] 下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0049] 實施例1
[0050] 按照以下步驟制備dsRNA:
[0051] 1.選取褐飛虱各齡期若蟲
[0052] 2.總RNA的提取:取20頭若蟲，液氮中研磨，用TRI zol法提取總RNA。
[0053] 3.cDNA第一鏈的合成：按照使用Takara公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書，將Iyg總RNA反轉錄為cDNA。
[0054] 4.下面描述NlCHSA中間片段制備過程。
[0055] (1)聚合酶鏈式反應(PCR)試劑(GenestarTaq DNA聚合酶HiFi)和反應條件： 模板 cDNA I^L NlCHSA特異性上游弓丨物NlCHSA-F(K^m) I^iL NlCHSA 特異性下游引物 MCHSA-R(K^im)