血液中dc細(xì)胞及cik種子細(xì)胞的凍存方法及制備的細(xì)胞與用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血液中DC細(xì)胞及CIK種子細(xì)胞的凍存方法及制備的細(xì)胞與用途，將外周血或者臍帶血中的單個(gè)核細(xì)胞通過適當(dāng)?shù)奶幚砗?，凍存在自體血清中，配合細(xì)胞凍存保護(hù)劑使細(xì)胞的存活率達(dá)到80％。復(fù)蘇后的細(xì)胞能夠滿足同時(shí)制備DC?細(xì)胞和CIK細(xì)胞，并最終制備成能夠滿足臨床應(yīng)用需求的DC?CIK細(xì)胞制劑。這樣就能夠?qū)崿F(xiàn)單次采血進(jìn)行多次DC?CIK臨床治療的需求，從而為免疫細(xì)胞治療的規(guī)?；l(fā)展提了支持。
【專利說明】
血液中DC細(xì)胞及CIK種子細(xì)胞的凍存方法及制備的細(xì)胞與用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，尤其是一種血液中DC細(xì)胞及CIK種子細(xì)胞的凍存方法及制備的細(xì)胞與用途。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫細(xì)胞治療作為目前公認(rèn)的對(duì)抗腫瘤的第四種醫(yī)療手段，因其安全，有效、無副作用等優(yōu)勢(shì)而逐漸被主流醫(yī)學(xué)界所接受。目前的免疫細(xì)胞制備方法主要是采集患者的外周血，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。這種方法存在的最大問題是每次治療均需要采集外周血，這就為患者帶來重復(fù)的損傷，并且在某些情況下患者是不適宜采集外周血的。所以，這就需要一種能夠單次采集后長(zhǎng)期保存細(xì)胞，并能夠滿足多次使用的細(xì)胞存儲(chǔ)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種利用自體血清的血液中DC細(xì)胞及CIK種子細(xì)胞的凍存方法及制備的細(xì)胞與用途。
[0004]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種血液中DC細(xì)胞及CIK種子細(xì)胞的凍存方法，將外周血或者臍帶血中的單個(gè)核細(xì)胞通過處理后，配合細(xì)胞凍存保護(hù)液凍存在自體血清中。
[0005]包括以下步驟:
[0006]I)自體血清的制備:
[0007]a.采集80_120ml外周血或者臍帶血，按照體積比1:1的比例加入生理鹽水，混合均勻后通過Ficol I淋巴細(xì)胞分離液處理分離出血漿和單個(gè)核細(xì)胞；
[0008]b.將血漿在55-58°C條件下滅活30min，滅活后的血漿在4500g-6000g的條件下離心8-12min，以0.22um濾膜過濾上清并最終制備出自體血清；
[0009]2)單個(gè)核細(xì)胞的凍存:
[0010]a.分離出的單個(gè)核細(xì)胞以含體積分?jǐn)?shù)I %FBS的生理鹽水清洗一次后，以免疫細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)；
[0011]b.配制DC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基:免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中含體積分?jǐn)?shù)5-8%的FBS，終濃度50-100IU/ml 的 IL-4、終濃度 500-1500IU/ml 的 GM-CSF ；
[0012]c.按照細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果取(1-2) X 17個(gè)細(xì)胞接種于T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加入40mlDC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，混合均勻后孵育；
[0013]d.誘導(dǎo)培養(yǎng)0.5-2h后輕輕吸取培養(yǎng)上清及未貼壁的細(xì)胞至50ml離心管中，300-320g條件下離心8-10min，將離心上清重新加入到DC細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0014]e.細(xì)胞凍存液的配制:將制備的自體血清與DEX-40細(xì)胞凍存液按照體積比4:1的比例混合均勻后放置在4 V冰箱中備用；
[0015]f.離心的沉淀細(xì)胞加入到未使用的單個(gè)核細(xì)胞中，混合均勻后計(jì)數(shù)，然后300-320g條件下離心8-10min，離心后棄掉上清，按照細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果以細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞的終濃度達(dá)到I X 107/ml，按照3-4ml/管加入到細(xì)胞凍存管中，將細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80°C中，12-72h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存；
[0016]g.DC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3-5天，將培養(yǎng)上清以及懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，以PBS清洗細(xì)胞并將清洗液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)50ml離心管中，以Tryple消化液消化細(xì)胞3-7min，以PBS沖洗并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，將兩個(gè)離心管300-320g條件下離心8-10min，棄上清并以細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2 X 1Vml，按照2-3ml/管加入到細(xì)胞凍存管中，將細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80°C中，12-72h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存。
[0017]所述的血液中DC細(xì)胞及CIK種子細(xì)胞的凍存方法得到的DC細(xì)胞和CIK種子細(xì)胞。
[0018]所述的血液中DC細(xì)胞及CIK種子細(xì)胞的凍存方法得到的DC細(xì)胞和CIK種子細(xì)胞復(fù)蘇后制備DC-CIK制劑的用途。
[0019]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明從外周血或者臍帶血中分離出自體血清以及單個(gè)核細(xì)胞，通過將單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分別處理后重懸于自體血清及細(xì)胞凍存保護(hù)液配制的凍存試劑中，并將細(xì)胞在-196°C液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存的方法。以這種方法凍存的細(xì)胞，復(fù)蘇后的細(xì)胞回收率能夠達(dá)到80% ο并且能夠滿足多次制備達(dá)到臨床治療標(biāo)準(zhǔn)的DC-CIK制劑的需求。并且，在單個(gè)核細(xì)胞的存儲(chǔ)過程中自體血漿是副產(chǎn)物，一般會(huì)廢棄，本發(fā)明通過簡(jiǎn)單的方法制備自體血清并用于單個(gè)核細(xì)胞的凍存，既避免了 FBS的使用，又能夠更好的提高單個(gè)核細(xì)胞的回收效率。
【附圖說明】
[0020]圖1是誘導(dǎo)7天的DC細(xì)胞及CIK細(xì)胞(左圖是DC細(xì)胞，右圖是CIK細(xì)胞)。
[0021]圖2是CIK細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明:
[0023]自體血清的制備:
[0024]采集80_120ml外周血或者臍帶血，按照體積比1:1的比例加入生理鹽水，混合均勻后通過Ficol I淋巴細(xì)胞分離液處理分離出血漿和單個(gè)核細(xì)胞；
[0025]將血漿在55-58°C條件下滅活30min，滅活后的血漿在4500g-6000g的條件下離心8-12min，以0.22um濾膜過濾上清并最終制備出自體血清；
[0026]單個(gè)核細(xì)胞的凍存:
[0027]1.分離出的單個(gè)核細(xì)胞以含I %FBS的生理鹽水清洗一次后，以免疫細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)；
[0028]2.配制DC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基:免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中含體積分?jǐn)?shù)5-8%的FBS，終濃度50-100IU/ml 的 IL-4、終濃度 500-1500IU/ml 的 GM-CSF ；
[0029]3.按照細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果取1-2*107個(gè)細(xì)胞接種于T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加入40mlDC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，混合均勻后孵育；
[0030]4.誘導(dǎo)培養(yǎng)0.5-2h后輕輕吸取培養(yǎng)上清及未貼壁的細(xì)胞至50ml離心管中，300-320g條件下離心8-10min，將離心上清重新加入到DC細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0031 ] 5.細(xì)胞凍存液的配制:將制備的自體血清與DEX-40細(xì)胞凍存液按照體積比4:1的比例混合均勻后放置在4 V冰箱中備用；
[0032]6.離心的沉淀細(xì)胞加入到未使用的單個(gè)核細(xì)胞中，混合均勻后計(jì)數(shù)，然后300-320g條件下離心8-10min，離心后棄掉上清，按照細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果以細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞的終濃度達(dá)到l*107/ml，按照3-4ml/管加入到細(xì)胞凍存管中，將細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80°C中，12-72h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存；
[0033]7.DC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3-5天，將培養(yǎng)上清以及懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，以PBS清洗細(xì)胞并將清洗液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)50ml離心管中，以Tryple消化液消化細(xì)胞3-7min，以PBS沖洗并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，將兩個(gè)離心管300-320g條件下離心8-10min，棄上清并以細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2*106/ml，按照2-3ml/管加入到細(xì)胞凍存管中，將細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80°C中，12-72h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存；
[0034]DC-CIK細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng):
[0035]1.CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制:免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中含有體積分?jǐn)?shù)4-8%的FBS，終濃度200-1000IU的IL-2;
[0036]2.在一個(gè)T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入5ml含有5-10ng CD3Mab的CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，
4°C冰箱包被過夜；
[0037]3.復(fù)蘇一支凍存的單個(gè)核細(xì)胞，將融化后的細(xì)胞懸液加入到15_20ml的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中，300-320g條件下離心8-10min，棄上清并加入CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基至終體積45ml，重懸細(xì)胞后加入預(yù)先包被的T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并按照300-1000IU/ml的終濃度加入IFN-r，混合均勾后開始誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0038]4.按照每隔一天加入培養(yǎng)體系中等體積的CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基的方法對(duì)CIK細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；
[0039]5.在CIK細(xì)胞誘導(dǎo)的第4天復(fù)蘇一支凍存的DC細(xì)胞，將融化后的細(xì)胞懸液加入到15-20ml的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中，300-320g條件下離心8-10min，棄上清并加入DC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基至終體積40ml，重懸細(xì)胞后加入T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中誘導(dǎo)培養(yǎng)，24-36h后在DC細(xì)胞誘導(dǎo)體系中按照終濃度400-1200IU/ml加入TNF-a，24-48h后將誘導(dǎo)的DC細(xì)胞收集后加入到CIK細(xì)胞誘導(dǎo)體系中共培養(yǎng)；
[0040]6.在CIK細(xì)胞誘導(dǎo)的第14-16天收集所有細(xì)胞。
[0041 ] 實(shí)施例1:
[0042]自體血清的制備:
[0043]1.采集120ml外周血，按照體積比1:1的比例加入生理鹽水，混合均勻后通過Ficol I淋巴細(xì)胞分離液處理分離出血漿和單個(gè)核細(xì)胞；
[0044]2.將血漿在56°C條件下滅活30min，滅活后的血漿在4500gg的條件下離心12min，以0.22um濾膜過濾上清并最終制備出223ml自體血清；
[0045]單個(gè)核細(xì)胞的凍存:
[0046]1.分離出的單個(gè)核細(xì)胞以30ml含1%FBS的生理鹽水清洗一次后，以20ml免疫細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)獲得1.98*108個(gè)細(xì)胞；
[0047]2.配制DC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基:免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中含體積分?jǐn)?shù)5 %的FBS，終濃度100IU/ml 的 IL-4、終濃度 1000IU/ml 的 GM-CSF;
[0048]3.按照細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果取2*107個(gè)細(xì)胞接種于T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加入40mlDC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，混合均勻后孵育；
[0049]4.誘導(dǎo)培養(yǎng)2h后輕輕吸取培養(yǎng)上清及未貼壁的細(xì)胞至50ml離心管中，300-320g條件下離心8-10min，將離心上清重新加入到DC細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0050]5.細(xì)胞凍存液的配制:將制備的自體血清與DEX-40細(xì)胞凍存液按照體積比4:1的比例混合均勻后放置在4 V冰箱中備用；
[0051 ] 6.離心的沉淀細(xì)胞加入到未使用的單個(gè)核細(xì)胞中，混合均勻后計(jì)數(shù)，然后300g條件下離心1min，離心后棄掉上清，按照細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果以細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞的終濃度達(dá)到l*107/ml，按照4ml/管加入到細(xì)胞凍存管中，將細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80°C冰箱中，72h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存；
[0052]7.DC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3天，將培養(yǎng)上清以及懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，以PBS清洗細(xì)胞并將清洗液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)50ml離心管中，以3ml Tryple消化液消化細(xì)胞5min，以PBS沖洗并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，將兩個(gè)離心管300g條件下離心lOmin，棄上清并以細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2*106/ml，按照3ml/管加入到細(xì)胞凍存管中，將細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80°C中，72h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存；
[0053]DC-CIK細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng):
[0054]1.CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制:免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中含有體積分?jǐn)?shù)5%的FBS，終濃度500IU的IL-2;
[0055]2.在一個(gè)T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入5ml含有5ng CD3Mab的CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，4°C冰箱包被過夜；
[0056]3.復(fù)蘇一支凍存的單個(gè)核細(xì)胞，將融化后的細(xì)胞懸液加入到20ml的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中，300g條件下離心8min，棄上清并加入CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基至終體積45ml，重懸細(xì)胞后加入預(yù)先包被的T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并按照1000IU/ml的終濃度加入IFN-r，混合均勻后開始誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0057]4.按照每隔一天加入培養(yǎng)體系中等體積的CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基的方法對(duì)CIK細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；
[0058]5.在CIK細(xì)胞誘導(dǎo)的第4天復(fù)蘇一支凍存的DC細(xì)胞，將融化后的細(xì)胞懸液加入到20ml的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中，300g條件下離心1min，棄上清并加入DC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基至終體積40ml，重懸細(xì)胞后加入T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中誘導(dǎo)培養(yǎng)，36h后在DC細(xì)胞誘導(dǎo)體系中按照終濃度1000IU/ml加入TNF-a，48h后將誘導(dǎo)的DC細(xì)胞收集后共獲得1.4*107個(gè)細(xì)胞(圖1)，將全部細(xì)胞加入到CIK細(xì)胞誘導(dǎo)體系中共培養(yǎng)；
[0059]6.在CIK細(xì)胞誘導(dǎo)的第16天收集所有細(xì)胞，共獲得2.82*19個(gè)細(xì)胞(圖2)。
[0060]實(shí)施例2
[0061 ]自體血清的制備:
[0062]1.采集80ml外周血或者臍帶血，按照體積比1:1的比例加入生理鹽水，混合均勻后通過Ficol I淋巴細(xì)胞分離液處理分離出血漿和單個(gè)核細(xì)胞；
[0063]2.將血漿在55°C條件下滅活30min，滅活后的血漿在5000g的條件下離心8min，以
0.22um濾膜過濾上清并最終制備出自體血清；
[0064]單個(gè)核細(xì)胞的凍存:
[0065]1.分離出的單個(gè)核細(xì)胞以20ml含I %FBS的生理鹽水清洗一次后，以免疫細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)獲得1.5*108個(gè)細(xì)胞；
[0066]2.配制DC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基:免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中含體積分?jǐn)?shù)6 %的FBS，終濃度50IU/ml 的 IL-4、終濃度 500IU/ml 的 GM-CSF ；
[0067]3.按照細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果取1*107個(gè)細(xì)胞接種于T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加入40mlDC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，混合均勻后孵育；
[0068]4.誘導(dǎo)培養(yǎng)0.5h后輕輕吸取培養(yǎng)上清及未貼壁的細(xì)胞至50ml離心管中，300g條件下離心Smin，將離心上清重新加入到DC細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0069]5.細(xì)胞凍存液的配制:將制備的自體血清與DEX-40細(xì)胞凍存液按照體積比4:1的比例混合均勻后放置在4 V冰箱中備用；
[0070]6.離心的沉淀細(xì)胞加入到未使用的單個(gè)核細(xì)胞中，混合均勻后計(jì)數(shù)，然后320g條件下離心Smin，離心后棄掉上清，按照細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果以細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞的終濃度達(dá)到l*107/ml，按照3ml/管加入到細(xì)胞凍存管中，將細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80°C中，12h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存；
[0071]7.DC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的第5天，將培養(yǎng)上清以及懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，以PBS清洗細(xì)胞并將清洗液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)50ml離心管中，以3ml Tryple消化液消化細(xì)胞3min，以PBS沖洗并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，將兩個(gè)離心管300g條件下離心lOmin，棄上清并以細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2*106/ml，按照2ml/管加入到細(xì)胞凍存管中，將細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80°C中，12h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存；
[0072]DC-CIK細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng):
[0073]1.CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制:免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中含有體積分?jǐn)?shù)4%的FBS，終濃度200IU的IL-2;
[0074]2.在一個(gè)T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入5ml含有1ng CD3Mab的CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，4°(:冰箱包被過夜；
[0075]3.復(fù)蘇一支凍存的單個(gè)核細(xì)胞，將融化后的細(xì)胞懸液加入到15ml的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中，320g條件下離心8min，棄上清并加入CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基至終體積45ml，重懸細(xì)胞后加入預(yù)先包被的T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并按照300IU/ml的終濃度加入IFN-r，混合均勻后開始誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0076]4.按照每隔一天加入培養(yǎng)體系中等體積的CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基的方法對(duì)CIK細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；
[0077]5.在CIK細(xì)胞誘導(dǎo)的第4天復(fù)蘇一支凍存的DC細(xì)胞，將融化后的細(xì)胞懸液加入到20ml的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中，320g條件下離心8min，棄上清并加入DC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基至終體積40ml，重懸細(xì)胞后加入T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中誘導(dǎo)培養(yǎng)，24h后在DC細(xì)胞誘導(dǎo)體系中按照終濃度500 IU/ml加入TNF-a，24h后將誘導(dǎo)的DC細(xì)胞收集后計(jì)數(shù)共獲得1.2*107個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞全部加入到CIK細(xì)胞誘導(dǎo)體系中共培養(yǎng)；
[0078]6.在CIK細(xì)胞誘導(dǎo)的第14天收集所有細(xì)胞，共獲得2.2* 19個(gè)細(xì)胞。
[0079]綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種血液中DC細(xì)胞及CIK種子細(xì)胞的凍存方法，其特征在于，將外周血或者臍帶血中的單個(gè)核細(xì)胞通過處理后，配合細(xì)胞凍存保護(hù)液凍存在自體血清中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血液中DC細(xì)胞及CIK種子細(xì)胞的凍存方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)自體血清的制備: a.采集80-120ml外周血或者臍帶血，按照體積比1:1的比例加入生理鹽水，混合均勻后通過Ficol I淋巴細(xì)胞分離液處理分離出血漿和單個(gè)核細(xì)胞； b.將血漿在55-58°C條件下滅活30min，滅活后的血漿在4500g-6000g的條件下離心8-12min，以0.22um濾膜過濾上清并最終制備出自體血清； 2)單個(gè)核細(xì)胞的凍存: a.分離出的單個(gè)核細(xì)胞以含體積分?jǐn)?shù)I%FBS的生理鹽水清洗一次后，以免疫細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)； b.配制DC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基:免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中含體積分?jǐn)?shù)5-8%的FBS，終濃度50-100IU/ml 的 IL-4、終濃度 500-1500IU/ml 的 GM-CSF ； c.按照細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果取(1-2)X 17個(gè)細(xì)胞接種于T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加入40mlDC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，混合均勻后孵育； d.誘導(dǎo)培養(yǎng)0.5-2h后輕輕吸取培養(yǎng)上清及未貼壁的細(xì)胞至50ml離心管中，300-320g條件下離心8-10min，將離心上清重新加入到DC細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，誘導(dǎo)培養(yǎng)； e.細(xì)胞凍存液的配制:將制備的自體血清與DEX-40細(xì)胞凍存液按照體積比4:1的比例混合均勾后放置在4 C冰箱中備用； f.離心的沉淀細(xì)胞加入到未使用的單個(gè)核細(xì)胞中，混合均勻后計(jì)數(shù)，然后300-320g條件下離心8-lOmin，離心后棄掉上清，按照細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果以細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞的終濃度達(dá)到I X 107/ml，按照3-4ml/管加入到細(xì)胞凍存管中，將細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80°C中，12-72h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存； g.DC細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3-5天，將培養(yǎng)上清以及懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，以PBS清洗細(xì)胞并將清洗液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)50ml離心管中，以Tryple消化液消化細(xì)胞3-7min，以PBS沖洗并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，將兩個(gè)離心管300-320g條件下離心8-10min，棄上清并以細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2 X1Vml，按照2-3ml/管加入到細(xì)胞凍存管中，將細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入_80°C中，12-72h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存。3.如權(quán)利要求1或2所述的血液中DC細(xì)胞及CIK種子細(xì)胞的凍存方法得到的DC細(xì)胞和CIK種子細(xì)胞。4.如權(quán)利要求1或2所述的血液中DC細(xì)胞及CIK種子細(xì)胞的凍存方法得到的DC細(xì)胞和CIK種子細(xì)胞復(fù)蘇后制備DC-CIK制劑的用途。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK105831106SQ201610309131
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月10日
【發(fā)明人】韓洪起, 魯振宇, 劉俊江, 張冰晶, 秦臻, 徐悅
【申請(qǐng)人】天津普瑞賽爾生物科技有限公司