凍存腫瘤組織的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及凍存腫瘤組織的方法，其包括將所述來源于腫瘤患者的腫瘤組織剪切成1mm±0.2×1±0.2mm×3±0.6mm大小，然后將剪切后的組織塊凍存25±2周。任選地，將凍存25±2周的組織用于PDTT移植瘤模型建立或用于體內或體外傳代培養(yǎng)。本發(fā)明的凍存方法具有成瘤率高、移植瘤能比較完整地保留患者來源組織的形態(tài)和分子特征等特點。
【專利說明】
凍存腫瘤組織的方法
技術領域：
[0001] 本發(fā)明屬于與生物組織或細胞的保存相關的領域，涉及一種用于凍存腫瘤組織的 方法。
【背景技術】：
[0002] 在藥物開發(fā)和特異性治療途徑或用藥等的開發(fā)過程中，需要對生物組織(例如通 過手術切除或通過穿刺獲得的生物組織，特別是腫瘤組織）進行保存，以用于后續(xù)的治療、 檢測或科學研究等工作。目前普遍采用的保存生物組織的方法是低溫凍存，同時低溫凍存 對生物組織也有一系列的影響。例如Zhang JN,Yu YY，Ji J，et al .Effect of time of freeze-preserving on biological macromolecules of tumor tissue[J]?Journal of Diagnostics Concepts&Practice,2009,8(1) :38_42探討了低溫凍存時間對腫瘤組織的生 物大分子DNA、RNA及蛋白質的影響。
[0003] 腫瘤動物模型一直以來是抗腫瘤藥物臨床前療效預測和可能的毒性評價的有效 工具。促使一個實驗室候選藥物進入臨床試驗的前提是來自動物模型的研究數(shù)據(jù)能夠預測 該藥物在臨床應用時的療效。當藥物研發(fā)人員開發(fā)一個新型藥物時，擺在他們面前的其中 一個最大的障礙是從動物實驗中獲得的藥敏和毒理數(shù)據(jù)有時并不能完全驗證在患者身上。 目前用于藥物篩選的腫瘤模型基本采用的是將成熟的腫瘤細胞系接種于免疫缺陷小鼠獲 得的。這種模型已經(jīng)用于抗腫瘤新藥的篩選達數(shù)十年之久。雖然這種模型在揭示腫瘤轉移 的細胞和分子機制中顯示出其優(yōu)點，但是在預測抗腫瘤藥物的臨床治療敏感性時，這種模 型的價值卻非常有限。經(jīng)過體外幾十代的培養(yǎng)，惡性腫瘤細胞已經(jīng)呈現(xiàn)出高度未分化的狀 態(tài)，細胞系在體外培養(yǎng)的選擇壓力下表現(xiàn)出均一的組織學特征，其生物學特性和分子特征 已經(jīng)和原發(fā)腫瘤相差甚遠。而且體外培養(yǎng)的細胞系缺乏腫瘤的間質成分，而這種間質成分 被認為在腫瘤轉移的病理過程中起到很關鍵的作用。鑒于此，很多研究小組開始嘗試建立 一種直接接種來源于腫瘤患者新鮮腫瘤組織(patient-derived tumor tissue，PDTT)的裸 鼠移植瘤模型，即PDTT移植瘤模型。這種H)TT移植瘤模型將患者的新鮮腫瘤組織（穿刺標本 或手術標本)接種于免疫缺陷小鼠皮下或腎包膜下形成腫瘤。PDTT模型比傳統(tǒng)的細胞系模 型更能反映人類腫瘤的生物學特征，這種模型不僅保留了與原發(fā)腫瘤組織相似的增殖和組 織病理學特征，而且在生物學行為上，包括腫瘤的基因，蛋白質等分子特征與來源腫瘤組織 具有高度的一致性。由于PDTT模型比細胞系模型更能反映體內狀況，因此被有效地應用于 潛在抗腫瘤藥物的特異性快速篩選。
[0004] 建立和使用PDTT移植瘤模型用于臨床前抗腫瘤藥物篩選的前提是移植瘤能比較 完整地保留患者來源組織的形態(tài)和分子特征。另外，PDTT移植瘤模型的建立通常需要腫瘤 患者新鮮腫瘤組織的凍存，因為這樣可以在由于污染等情況丟失組織時有備份可用。但是， 在現(xiàn)有技術中，鮮有報道如何凍存腫瘤患者的腫瘤組織，以使得移植瘤能比較完整地保留 患者來源組織的形態(tài)和分子特征，同時具有較高的成瘤率。

【發(fā)明內容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是針對以上要解決的技術問題，提供一種凍存腫瘤組織的方法。本 發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過長期堅持不懈的努力，利用結腸癌患者新鮮腫瘤組織來源的多病灶roTT 移植瘤模型獲得了新型的凍存腫瘤組織的方法，該方法具有成瘤率高、移植瘤能比較完整 地保留患者來源組織的形態(tài)和分子特征等特點。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過本發(fā)明的凍存方法凍存 的腫瘤組織的成瘤率可高達100%、且患者來源腫瘤組織的組織形態(tài)學和分子特征在移植 瘤模型腫瘤組織中得到有效保存。
[0006] 本發(fā)明一方面提供了一種凍存來源于腫瘤患者的腫瘤組織的方法，其包括將所述 來源于腫瘤患者的腫瘤組織剪切成lmm±〇. 2Xl±0.2mmX3±0.6mm大小，然后將剪切后的 組織塊凍存25 ±1周。任選地，將凍存25 ±1周的組織用于PDTT移植瘤模型建立或用于體內 或體外傳代培養(yǎng)。
[0007] 優(yōu)選地，本發(fā)明的腫瘤組織在凍存之前用培養(yǎng)基或Hank's液進行沖洗。
[0008]本發(fā)明第二方面提供了建立PDTT移植瘤模型的方法，其包括（1)將來源于腫瘤患 者的腫瘤組織剪切成lmm±0.2Xl±0.2mmX3±0.6mm大??；（2)將剪切后的組織塊凍存25 ±1或25±2周；以及(3)將凍存的組織塊復蘇后建立H)TT移植瘤模型。
[0009] 本發(fā)明第三方面提供了腫瘤組織的培養(yǎng)或傳代方法，其包括（1)將來源于腫瘤患 者的腫瘤組織剪切成lmm±0.2Xl±0.2mmX3±0.6mm大??；（2)將剪切后的組織塊凍存25 ±1或25±2周；以及(3)將凍存的組織塊復蘇后進行體內或體外的培養(yǎng)或傳代。
[0010] 優(yōu)選地，被凍存的腫瘤組織是結腸癌原發(fā)瘤、結腸癌淋巴轉移瘤和結腸癌肝轉移 瘤。更優(yōu)選地，被凍存的腫瘤組織是結腸癌肝轉移瘤。
[0011] 優(yōu)選地，本發(fā)明所述的腫瘤組織是哺乳動物的腫瘤組織，例如豬、狗、貓等。更優(yōu)選 地，本發(fā)明所述的腫瘤組織是來源于人的腫瘤組織。
[0012] 優(yōu)選地，中本發(fā)明的凍存方法中，將剪切后的組織塊凍存于凍存液中。更優(yōu)選地， 所述凍存液包括（l)Leibovitz L-15培養(yǎng)基；（2)14-18%胎牛血清；和（3)14-18%01^0 (dimethyl sulfoxide，二甲基亞諷）。其中，Leibovitz L-15培養(yǎng)基可商購(Gibco)獲得，或 者本領域技術人員根據(jù)已報道的配方自行配制，優(yōu)選地，DMS0的含量為14-16%，更優(yōu)選為 15%。另一方面，其中的胎牛血清的含量優(yōu)選為14-18%，更優(yōu)選為14-16%，最優(yōu)選為15%。 最優(yōu)選地，本發(fā)明所述的凍存液包括（DLeibovitz L-15培養(yǎng)基；（2)15%(v/v)胎牛血清； 和(3)15% (v/v)二甲基亞砜。
[0013]優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，將來源于腫瘤患者的腫瘤組織剪切成lmm±〇. 1X1土 0? 1mmX 3±0 ? 3mm大??；更優(yōu)選地，將來源于腫瘤患者的腫瘤組織剪切成1mm±0.05 X 1 土 0.05mm X 3 ± 0.15mm大??；最優(yōu)選地，來源于腫瘤患者的腫瘤組織剪切成1 mm X 1 mm X 3mm大 小。
[0014]優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，將剪切后的組織塊凍存25±0.5周；更優(yōu)選地，將剪切 后的組織塊凍存25 ± 0.25周;最優(yōu)選地，將剪切后的組織塊凍存25周。
[0015]優(yōu)選地，本發(fā)明的凍存步驟包括:首先將置于凍存液中的腫瘤或生物組織置于4°C 的裝有異丙醇的凍存盒中約1小時；然后將裝有標本的凍存盒置入_20°C的低溫冰箱過夜 (約24小時）；再將裝有標本的凍存盒置入-80°C (約24小時）；以及將標本從凍存盒中取出置 于液氮(_196°C)中長期保存。
[0016] 本發(fā)明的凍存方法具有成瘤率高、移植瘤能比較完整地保留患者來源組織的形態(tài) 和分子特征等特點。
【附圖說明】：
[0017] 圖1:H&E染色顯示組織病理學特征（XIOOhAj:結腸癌原發(fā)瘤;C、D:結腸癌淋巴 轉移瘤;E、F:結腸癌肝轉移瘤。G0,患者來源腫瘤組織;G3,第三代移植瘤組織。
[0018]圖2: VEGF免疫組織化學染色顯示患者來源腫瘤組織與移植瘤組織高度一致（X 100) :結腸癌原發(fā)瘤;C、D:結腸癌淋巴轉移瘤;E、F:結腸癌肝轉移瘤。GO，患者來源腫瘤 組織;G3，第三代移植瘤組織。
[0019]圖3 :EGFR免疫組織化學染色顯示患者來源腫瘤組織與移植瘤組織高度一致（X 100) :結腸癌原發(fā)瘤;C、D:結腸癌淋巴轉移瘤;E、F:結腸癌肝轉移瘤。G0，患者來源腫瘤 組織;G3，第三代移植瘤組織。
【具體實施方式】：
[0020]下面結合具體實例對本發(fā)明進一步說明。
[0021 ]實施例1:患者腫瘤組織標本的獲得及凍存
[0022]新鮮腫瘤組織標本來源于一名40歲的女性結腸癌伴淋巴結和肝轉移患者，標本的 獲取得到患者的知情同意和本單位倫理委員會的許可?；颊咝g前未曾接受過化療和其它治 療。將術中標本用滅菌手術剪剪切成不同尺寸后凍存于預先準備好的本發(fā)明的凍存液中 (首先置于4°C的裝有異丙醇的凍存盒中約1小時;然后將裝有標本的凍存盒置入-20°C的低 溫冰箱過夜(24小時）；再將裝有標本的凍存盒置入-80°C (24小時）；以及將標本從凍存盒中 取出置于液氮(_196°C)中長期保存），以待接種。其中凍存液的配方如下：
[0023] Leibovitz L-15培養(yǎng)基（商購(Gibco)獲得）；
[0024] 15%(V/V)胎牛血清；
[0025] 15%(V/V)DMS0(二甲基亞砜）。
[0026]實施例2:結腸癌多病灶H)TT移植瘤模型的建立
[0027] 1)4~6周齡的BALB/c裸鼠飼養(yǎng)于SPF級屏障環(huán)境中，并使其適應環(huán)境三天以上；
[0028] 2)將凍存于本發(fā)明凍存液中的腫瘤組織標本(在凍存前用滅菌手術剪已經(jīng)將標本 切成不同尺寸大小的碎片）復蘇后轉移入冰浴的RPMI 1640培養(yǎng)基（含20%胎牛血清和 0.05 %青霉素/鏈霉素）中；
[0029] 3)然后用上述RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌三次；
[0030] 4)動物用異氟烷麻醉后，消毒裸鼠背腹部皮膚，無菌棉球擦拭干，用刀片在裸鼠的 一側前腋下附近切一個小口，18號穿刺針頭鈍性分離皮膚與皮下，使成一皮袋，將準備好的 腫瘤碎片置放于其中，切口滴加一滴雙抗(100 X青霉素/鏈霉素）；
[0031] 5)剩余組織液氮速凍_80°C保存或福爾馬林固定石蠟包埋用于后續(xù)測定；
[0032] 6)每周2次用游標卡尺測定移植瘤的體積，體積計算方法為:腫瘤體積=(長徑X 短徑2)/2;
[0033] 7)大約11至15周，移植瘤長到1000~1500mm3大小；
[0034] 8)在移植瘤長到1000mm3時即開始傳代:荷瘤裸鼠脫臼處死后，將裸鼠置于75%酒 精中浸泡2分鐘，將瘤體按上述方法切碎后接種。
[0035] 實施例3:不同凍存時間對結腸癌H)TT移植瘤模型的成瘤率的影響
[0036]將根據(jù)實施例1剪切尺寸為1mmXImmX 3mm凍存2-52周的腫瘤組織根據(jù)實施例2的 方法進行rorr移植瘤模型的建立，成瘤率如表1所示。
[0037]表1:不同凍存時間對結腸癌roTT移植瘤模型的成瘤率的影響
[0039]
[0040] 注:G3,傳代至第三代。
[0041 ]實施例4:不同凍存時間對H)TT移植瘤模型的腫瘤生長速度的影響
[0042]將根據(jù)實施例1剪切尺寸為1mmXImmX 3mm凍存2-52周的腫瘤組織根據(jù)實施例2的 方法進行PDTT移植瘤模型的建立，當瘤體生長到時1000mm3測定其生長速度，結果如表2所 7Jn 〇
[0043]表2不同凍存時間對結腸癌TOTT移植瘤模型的腫瘤生長速度的影響


[0047] 3當瘤體生長到時1000mm3測定。G3,第三代移植瘤組織。
[0048] 實施例5:組織塊的尺寸對結腸癌H)TT移植瘤模型的成瘤率的影響
[0049] 將根據(jù)實施例1凍存24周的不同尺寸的腫瘤組織根據(jù)實施例2的方法進行PDTT移 植瘤模型的建立，成瘤率如表3所示。
[0050] 表3組織塊不同體積對結腸癌H)TT移植瘤模型的成瘤率的影響
[0052]實施例6:組織塊體積對結腸癌H)TT移植瘤模型的腫瘤生長速度的影響
[0053]將根據(jù)實施例1凍存24周的不同尺寸的腫瘤組織根據(jù)實施例2的方法進行PDTT移 植瘤模型的建立，當瘤體生長到時1000mm3測定其生長速度，結果如表4所示。
[0054]表4組織塊體積對結腸癌H)TT移植瘤模型的腫瘤生長速度的影響
[0056]
[0057] 3當瘤體生長到時1000mm3測定。G3,第三代移植瘤組織。
[0058]實施例7:患者來源腫瘤組織的組織形態(tài)學和分子特征在移植瘤模型腫瘤組織中 得到有效保存
[0059]建立和使用PDTT移植瘤模型用于臨床前抗腫瘤藥物篩選的前提是移植瘤能比較 完整地保留患者來源組織的形態(tài)和分子特征?；谶@個目的，本發(fā)明的發(fā)明人將根據(jù)實施 例1剪切尺寸為1mm X 1mm X 3mm凍存24周的腫瘤組織根據(jù)實施例2的方法進行H)TT移植瘤模 型的建立。隨后對移植瘤模型腫瘤組織進行我們采用染色、免疫組織化學染色、基因組 cDNA表達芯片檢測、焦磷酸測序、實時熒光定量PCR檢測和蛋白質免疫印跡等方法和技術來 檢測移植瘤在傳代過程中的生物學穩(wěn)定性。
[0060] 組織病理學HE染色表明，移植瘤組織與來源組織均具備腺癌的特征。圖1顯示的是 患者來源腫瘤組織(G0)與第三代移植瘤組織(G3)的形態(tài)特征。從圖中可見，患者來源腫瘤 組織與移植瘤腫瘤組織沒有形態(tài)上的差異。并且，移植瘤組織與患者來源腫瘤組織還顯示 出相似的EGFR和VEGF表達特征（圖2、3)。
[0061] 當我們使用TOTT模型用于評價新型抗腫瘤藥物時，特別是評價分子靶向藥物時， 了解移植瘤詳細的分子特征是必須的?；谶@個目的，我們采用GeneChip HGU133Plus2.0 表達芯片(Affymetrix)來檢測移植瘤在傳代過程中的基因表達譜的一致性，采用焦磷酸測 序檢測幾個結腸癌相關基因在傳代過程中突變情況的一致性，采用實時熒光定量PCR來檢 測幾個隨機選擇的功能基因的mRNA在傳代過程中的一致性，采用蛋白質免疫印跡來檢測一 些信號通路相關的蛋白在傳代過程中的表達一致性。研究結果發(fā)現(xiàn)，結腸癌原發(fā)瘤、淋巴轉 移瘤和肝轉移瘤在傳代過程中，其KRAS、BRAF、EGFR和PIK3CA的突變情況和隨機選擇的mRNA 表達情況(結果未列出)完全一致。
[0062]蛋白質免疫印跡檢測結腸癌各病灶及其移植瘤中的六杜、口41^1:(361'3()8311(1361' 473)、 ERK、pERK(Thr2()2/Tyr2()4)、MAPK、pMAPK(Thr18()/Tyr 182)、mT0R、pmT0R(Ser2448)、EGFR、VEGF、 CaSepaSe-3、PCNA和GATOH(內參）蛋白表達情況。對于這些隨機選擇的信號通路蛋白，結腸 癌淋巴轉移瘤和肝轉移瘤的移植瘤模型組織與患者來源組織保持了高度的一致性，雖然在 結腸癌的原發(fā)瘤的移植瘤模型組織與患者來源組織有一定差異。
[0063] 基于基因芯片的檢測結果，計算了移植瘤組織與患者來源組織的相似程度。幾個 病灶組織與其移植瘤組織的芯片結果的相關系數(shù)在0.988~0.991之間。結腸癌原發(fā)瘤移植 瘤組織與患者來源組織的相關系數(shù)為0.991，結腸癌淋巴轉移瘤移植瘤組織與患者來源組 織的相關系數(shù)為0.989,結腸癌淋巴轉移瘤移植瘤組織與患者來源組織的相關系數(shù)為 0.988。研究結果表明，移植瘤與患者來源組織的功能基因具有高度的一致性。配對比較t檢 驗統(tǒng)計結果表明移植瘤組織與患者來源組織表達基因的差異是有限的。
[0064] 最后應當說明的是，以上實施例僅用于說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參 照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發(fā)明的 技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在 本發(fā)明的權利要求范圍內。
【主權項】
1. 一種凍存來源于腫瘤患者的腫瘤組織的方法，其包括（1)將所述來源于腫瘤患者的 腫瘤組織剪切成lmm±0.2Xl±0.2mmX3±0.6mm大?。唬?)將剪切后的組織塊凍存25±2 周。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其進一步包括將凍存25±2周的組織用于roTT移植瘤模 型建立或用于體內或體外傳代培養(yǎng)。3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中腫瘤組織在凍存之前用培養(yǎng)基或Hanks液進行沖 洗。4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中將來源于腫瘤患者的腫瘤組織剪切成lmm±0.1 X 1 ±0.1mmX3±0.3mm大??；更優(yōu)選地，將來源于腫瘤患者的腫瘤組織剪切成1mm±0·05 X 1 土 0.05mm X 3 ± 0.15mm大??；最優(yōu)選地，來源于腫瘤患者的腫瘤組織剪切成1 mm X 1 mm X 3mm大 小。5. 根據(jù)權利要1-4中任一項所述的方法，其中將剪切后的組織塊凍存25±1周；優(yōu)選地， 將剪切后的組織塊凍存25 ±0.5周；更優(yōu)選地，將剪切后的組織塊凍存25 ±0.25周；最優(yōu)選 地，將剪切后的組織塊凍存25周。6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其中將剪切后的組織塊凍存于凍存液中，且所述凍存液 包括(1)!^;113〇￥；^2 1^-15培養(yǎng)基；（2)15%(>八)胎牛血清;和(3)15%(>八)二甲基亞砜。7. 建立roTT移植瘤模型的方法，其包括⑴將來源于腫瘤患者的腫瘤組織剪切成1mm ± 0.2Xl±0.2mmX3±0.6mm大??；（2)將剪切后的組織塊凍存25 ± 2周；以及（3)將凍存的組 織塊復蘇后建立roir移植瘤模型。8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其中將來源于腫瘤患者的腫瘤組織剪切成lmm±0.1 X 1 ±0.1mmX3±0.3mm大?。桓鼉?yōu)選地，將來源于腫瘤患者的腫瘤組織剪切成1mm±0·05 X 1 土 0.05mm X 3 ± 0.15mm大??；最優(yōu)選地，來源于腫瘤患者的腫瘤組織剪切成1 mm X 1 mm X 3mm大 小。9. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其中將剪切后的組織塊凍存25 ± 1周;優(yōu)選地，將剪切后 的組織塊凍存25 ± 0.5周;更優(yōu)選地，將剪切后的組織塊凍存25 ± 0.25周；最優(yōu)選地，將剪切 后的組織塊凍存25周。10. 根據(jù)權利要7-9中任一項所述的方法，其中將剪切后的組織塊凍存于凍存液中，且 所述凍存液包括（1)Leibovi tz L-15培養(yǎng)基；（2) 15 % (v/v)胎牛血清;和(3) 15 % (v/v)二甲 基亞砜。
【文檔編號】A01N1/02GK105850981SQ201610282079
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】陶鋒, 金科濤, 藍歡榮, 黃黎明, 呂杰青, 景元明, 王偉, 胡耕遠
【申請人】紹興市人民醫(yī)院