一種甘蔗無菌外植體的獲取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種甘蔗無菌外植體的獲取方法，包括以下步驟:1)選取甘蔗植株，自肥厚帶向下35?45cm處的地方砍斷，取甘蔗尾稍段，記為第一甘蔗莖段；2)去除第一甘蔗莖段肥厚帶以上的葉片后，自肥厚帶起向下選取20?35cm的甘蔗莖段，記為第二甘蔗莖段；3)剝掉第二甘蔗莖段的葉片，直至剩下肥厚帶葉和肥厚帶葉以下第一葉為止，得到第三甘蔗莖段；4)用70％?75％的酒精擦拭第三甘蔗莖段的表面2?5次，剝掉肥厚帶葉以下第一葉，得到第四甘蔗莖段；5)用70％?75％的酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2?5次，剝掉肥厚帶葉，得到甘蔗無菌外植體。該方法簡便，效率高，能夠有效簡化甘蔗組培程序，滿足生產(chǎn)需要。
【專利說明】
一種甘蔗無菌外植體的獲取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種甘蔗無菌外植體的獲取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生物技術(shù)的發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟，在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用也越來越廣泛。目前眾多的植物都已經(jīng)通過組織培養(yǎng)進(jìn)行快速繁殖。甘蔗(Saccharum)既是一種重要的糖料作物也是一種生物質(zhì)能源作物。甘蔗糖占我國食糖總量的90%以上，甘蔗也是生產(chǎn)乙醇的最佳能源作物。自上世紀(jì)70年代，組織培養(yǎng)技術(shù)就開始應(yīng)用于甘蔗培植上，它在甘蔗種苗快速繁殖和脫毒種苗的生產(chǎn)上起著重要的作用。甘蔗系無性繁殖，繁殖系數(shù)低，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，甘蔗能夠在短期內(nèi)大量繁殖，滿足種苗在生產(chǎn)上的需求。隨著種植年限的延長，甘蔗受到多種病害的侵染，導(dǎo)致品種退化，利用組培技術(shù)能夠提純復(fù)壯品種。
[0003]外植體的消毒是植物組織培養(yǎng)的第一步，也是最為關(guān)鍵的一步，直接關(guān)系到試驗(yàn)的成敗?，F(xiàn)有技術(shù)中外植體消毒發(fā)一般包括氧化汞消毒法和酒精浸泡法。
[0004]氧化汞消毒法，氯化汞是目前植物組織培養(yǎng)中常用的消毒物質(zhì)。甘蔗外植消毒一般采用氯化汞浸泡的方法，首先在0.1-0.3%的氯化汞溶液中浸泡8-10分鐘，再用無菌水清洗3次以上。該方法步驟繁瑣，耗時(shí)長，同時(shí)氯化汞是劇毒物質(zhì)，對外植體傷害比較嚴(yán)重，容易導(dǎo)致外植體死亡，丟棄的廢液也容易造成環(huán)境污染。
[0005]酒精浸泡法，該方法利用酒精浸泡甘蔗外植體，相比氧化汞消毒法，酒精浸泡法同樣需要用無菌水沖洗材料，比較費(fèi)時(shí)和繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明為了避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供了一種甘蔗無菌外植體的獲取方法，該方法簡便，效率高，能夠有效簡化甘蔗組培程序，滿足生產(chǎn)需要。
[0007]根據(jù)本發(fā)明所提供的一種甘蔗無菌外植體的獲取方法，包括以下步驟:
[0008]I)選取甘鹿植株，自肥厚帶向下35_45cm處的地方砍斷所選取的甘鹿植株，取甘鹿尾稍段，記為第一甘蔗莖段；
[0009]2)去除第一甘蔗莖段肥厚帶以上的葉片后，自肥厚帶起向下選取20-35cm的甘蔗莖段，記為第二甘蔗莖段；
[0010]3)剝掉第二甘蔗莖段的葉片，直至剩下肥厚帶葉和肥厚帶葉以下第一葉為止，得到第三甘蔗莖段；
[0011]4)用70%-75%的酒精擦拭第三甘蔗莖段的表面2-5次后，用無菌鑷子剝掉肥厚帶葉以下第一葉，得到第四甘蔗莖段；
[0012]5)用70%-75%的酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2-5次后，用無菌鑷子剝掉肥厚帶葉，得到甘蔗無菌外植體。
[0013]優(yōu)選地，步驟I)中，所述第一甘蔗莖段的長度為40cm。
[0014]優(yōu)選地，步驟2)中，所述第二甘蔗莖段的長度為30cm。
[0015]優(yōu)選地，步驟4)中，用70%酒精擦拭第三甘蔗莖段的表面2次。
[0016]優(yōu)選地，步驟4)中，用完全浸潤了70%_75%的酒精棉球擦拭第三甘蔗莖段的表面。
[0017]優(yōu)選地，步驟5)中，用70%酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2次。
[0018]優(yōu)選地，步驟5)中，用完全浸潤了70 % -75 %的酒精棉球擦拭第四甘蔗莖段的表面。
[0019]優(yōu)選地，步驟5)在超凈工作臺中進(jìn)行操作。
[0020]優(yōu)選地，步驟5)中，還包括切除生長點(diǎn)；用70% -75 %的酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2-5次，用無菌鑷子剝掉肥厚帶葉后，切除第四甘蔗莖段的生長點(diǎn)，得到甘蔗無菌外植體。
[0021]為了更好地展示本發(fā)明所提供的技術(shù)方案，下面對甘蔗葉片作簡單的陳述。甘蔗的葉包括鞘基、葉梢、葉耳、葉舌、肥厚帶(又稱葉環(huán))、葉中脈和葉片。肥厚帶葉又稱“+I葉”，肥厚帶葉的上一葉為“-1葉”，肥厚帶葉以下第I葉為“+2葉”，肥厚帶葉以下第2葉為“+3葉”，依次類推。
[0022]本發(fā)明所提供的技術(shù)方案可以包括以下有益效果:
[0023](I)本發(fā)明所提供的甘蔗無菌外植體的獲取方法，選取甘蔗尾稍為外植體，經(jīng)過70 %酒精進(jìn)行表面擦拭消毒，獲得無菌外植體。甘蔗外植體消毒的方法效率高，整個過程能夠在10分鐘內(nèi)完成，成功率可達(dá)到95%以上，完全滿足后續(xù)開展甘蔗組織培養(yǎng)的要求。乙醇的使用不僅節(jié)約了成本，而且減少了重金屬所帶來的環(huán)境污染問題。該方法操作步驟簡單，節(jié)約生產(chǎn)時(shí)間，對環(huán)境和操作者都無毒，本技術(shù)可以用于甘蔗健康種苗的無菌培養(yǎng)，甘蔗轉(zhuǎn)基因愈傷組織的獲得。
[0024](2)本發(fā)明所提供的甘蔗無菌外植體的獲取方法，使用酒精作為消毒液，酒精價(jià)格便宜且無毒，節(jié)約成本，無毒的酒精不會對甘蔗外植體帶來傷害，也不會對生產(chǎn)者造成危害，不污染環(huán)境。
[0025](3)本發(fā)明所提供的甘蔗無菌外植體的獲取方法，還可以用于甘蔗轉(zhuǎn)基因育種研究中外植體的獲得，為今后的開展相關(guān)研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所提供的新臺糖22號無菌外植體的示意圖；
[0027]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2所提供的新臺糖20號無菌外植體的示意圖；
[0028]圖3為本發(fā)明實(shí)施例3所提供的黑皮果蔗無菌外植體培養(yǎng)后的愈傷組織示意圖；
[0029]圖4為本發(fā)明實(shí)施例1所提供的新臺糖22號再生植株的示意圖；
[0030]圖5為本發(fā)明實(shí)施例2所提供的新臺糖20號再生植株的蔗苗示意圖；
[0031]圖6為本發(fā)明實(shí)施例3所提供的黑皮果蔗無菌外植體培養(yǎng)后的蔗苗示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032 ]下面，結(jié)合附圖及【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述:
[0033]—種甘蔗無菌外植體的獲取方法，包括以下步驟:
[0034]I)選取甘鹿植株，自肥厚帶向下35_45cm處的地方砍斷所選取的甘鹿植株，取甘鹿尾稍段，記為第一甘蔗莖段；
[0035]2)去除第一甘蔗莖段肥厚帶以上的葉片后，自肥厚帶起向下選取20-35cm的甘蔗莖段，記為第二甘蔗莖段；
[0036]3)剝掉第二甘蔗莖段的葉片，直至剩下肥厚帶葉和肥厚帶葉以下第一葉為止，得到第三甘蔗莖段；
[0037]4)用70%-75%的酒精擦拭第三甘蔗莖段的表面2-5次后，用無菌鑷子剝掉肥厚帶葉以下第一葉，得到第四甘蔗莖段；
[0038]5)用70%-75%的酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2-5次后，用無菌鑷子剝掉肥厚帶葉，得到甘蔗無菌外植體。
[0039]實(shí)施例1
[0040]一種甘蔗無菌外植體的獲取方法，所采用的甘蔗莖段選自田間種植的健康生長甘蔗，其品種為新臺糖22號。依次包括如下步驟:
[0041]1、在天氣晴朗時(shí)，選取田間種植的甘蔗植株，在距離肥厚帶約40cm處砍斷，取甘蔗尾稍段，記為第一甘蔗莖段；
[0042]2、將第一甘蔗莖段肥厚帶以上的葉片剪斷，以肥厚帶為頂端，截取30cm的甘蔗莖段，記為第二甘蔗莖段；
[0043]3、逐層剝掉第二甘蔗莖段的葉片，直至剩下肥厚帶葉(+1葉)和肥厚帶葉以下第一葉(+2葉)為止，得到第三甘蔗莖段；
[0044]4、用浸潤了濃度為70%的酒精的棉球?qū)Φ谌收崆o段進(jìn)行表面擦拭消毒，用滅菌后的鑷子剝離肥厚帶葉以下第一葉(+2葉)，得到第四甘蔗莖段；
[0045]5、在超凈工作臺中，繼續(xù)用浸潤了濃度為70%的酒精的棉球?qū)Φ谒母收崆o段進(jìn)行表面擦拭消毒，用滅菌后的鑷子剝離肥厚帶葉(+ 1葉)，用滅菌后的手術(shù)刀切掉第四甘蔗莖段的生長點(diǎn)，即獲得了新臺糖22號無菌外植體，切碎后接種到培養(yǎng)基上。
[0046]如圖1所示，為實(shí)施I獲取的新臺糖22號的無菌外植體，經(jīng)過培養(yǎng)后，其存活率為96%，存活率高，且長勢良好(見圖4)。
[0047]實(shí)施例2
[0048]一種甘蔗無菌外植體的獲取方法，所采用的甘蔗莖段選自田間種植的健康生長甘蔗，其品種為新臺糖20號。依序包括如下步驟:
[0049]1、在天氣晴朗時(shí)，選取田間種植的甘蔗植株，在距離肥厚帶約40cm處砍斷，取甘蔗尾稍段，記為第一甘蔗莖段；
[0050]2、將第一甘蔗莖段肥厚帶以上的葉片剪斷，以肥厚帶為頂端，截取30cm的莖段，記為第二甘蔗莖段；
[0051]3、逐層剝掉第二甘蔗莖段的葉片，直至剩下肥厚帶葉(+1葉)和肥厚帶葉以下第一葉(+2葉)為止，得到第三甘蔗莖段；
[0052]4、用浸潤了濃度為70%的酒精的棉球?qū)Φ谌收崆o段進(jìn)行表面擦拭消毒，用滅菌后的鑷子剝離肥厚帶葉以下第一葉(+2葉)，得到第四甘蔗莖段；
[0053]5、在超凈工作臺中，繼續(xù)用浸潤了濃度為70%的酒精的棉球?qū)Φ谒母收崆o段進(jìn)行表面擦拭消毒，用滅菌后的鑷子剝離肥厚帶葉(+ 1葉)，用滅菌后的手術(shù)刀切掉第四甘蔗莖段的生長點(diǎn)，即獲得了新臺糖20無菌外植體，切碎后接種到培養(yǎng)基上。
[0054]如圖2所示，為實(shí)施2獲取的新臺糖20號的無菌外植體，經(jīng)過培養(yǎng)后，其存活率為98%，存活率高，且長勢良好(見圖5)。
[0055]實(shí)施例3
[0056]一種甘蔗無菌外植體的獲取方法，所采用的甘蔗莖段選自田間種植的健康生長甘蔗，其品種為黑皮果蔗。依序包括如下步驟:
[0057]1、在天氣晴朗時(shí)，取田間種植的甘蔗植株，在距離肥厚帶約40cm處砍斷，取甘蔗尾稍段，記為第一甘蔗莖段；
[0058]2、將第一甘蔗莖段肥厚帶以上的葉片剪斷，以肥厚帶為頂端，截取30cm的甘蔗莖段，記為第二甘蔗莖段；
[0059]3、逐層剝掉第二甘蔗莖段的葉片，直至剩下肥厚帶葉(+1葉)和肥厚帶葉以下第一葉(+2葉)為止，得到第三甘蔗莖段；
[0060]4、用浸潤了濃度為70%的酒精的棉球?qū)Φ谌收崆o段進(jìn)行表面擦拭消毒，用滅菌后的鑷子剝離肥厚帶葉以下第一葉(+2葉)，得到第四甘蔗莖段；
[0061]5、在超凈工作臺中，繼續(xù)用浸潤了濃度為70%的酒精的棉球?qū)Φ谒母收崆o段進(jìn)行表面擦拭消毒，用滅菌后的鑷子剝離肥厚帶葉(+ 1葉)，用滅菌后的手術(shù)刀切掉第四甘蔗莖段的生長點(diǎn)，即獲得了黑皮果蔗無菌外植體，可以切碎后接種到培養(yǎng)基上。
[0062]如圖3所示，為實(shí)施3獲取的黑皮果蔗的無菌外植體，經(jīng)過培養(yǎng)后，其存活率為98%，存活率高，且長勢良好(見圖6)。
[0063]對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及形變，而所有的這些改變以及形變都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種甘鹿無菌外植體的獲取方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)選取甘蔗植株，自肥厚帶向下35-45cm處的地方砍斷所選取的甘蔗植株，取甘蔗尾稍段，記為第一甘蔗莖段； 2)去除第一甘蔗莖段肥厚帶以上的葉片后，自肥厚帶起向下選取20-35cm的甘蔗莖段，記為第二甘蔗莖段； 3)剝掉第二甘蔗莖段的葉片，直至剩下肥厚帶葉和肥厚帶葉以下第一葉為止，得到第二甘鹿莖段； 4)用70%-75%的酒精擦拭第三甘蔗莖段的表面2-5次后，剝掉肥厚帶葉以下第一葉，得到第四甘蔗莖段； 5)用70%-75%的酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2-5次后，剝掉肥厚帶葉，得到甘蔗無菌外植體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟I)中，所述第一甘蔗莖段的長度為40cmo3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟2)中，所述第二甘蔗莖段的長度為30cmo4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟4)中，用70%酒精擦拭第三甘蔗莖段的表面2次。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟4)中，用完全浸潤了 70%-75%的酒精棉球擦拭第三甘蔗莖段的表面。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟5)中，用70%酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2次。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟5)中，用完全浸潤了 70 % -75 %的酒精棉球擦拭第四甘蔗莖段的表面。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟5)在超凈工作臺中進(jìn)行操作。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗無菌外植體的獲取方法，其特征在于，步驟5)中，還包括切除生長點(diǎn)；用70%-75%的酒精擦拭第四甘蔗莖段的表面2-5次，用無菌鑷子剝掉肥厚帶葉后，切除第四甘蔗莖段的生長點(diǎn)，得到甘蔗無菌外植體。
【文檔編號】A01H4/00GK105875409SQ201610232287
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月13日
【發(fā)明人】王繼華, 曹干, 呂冰
【申請人】廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所