一種室內(nèi)快速鑒定小麥冬春性的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種室內(nèi)快速鑒定小麥冬春性的方法。一種檢測小麥冬春性的方法，包括如下步驟：1)將每個待測小麥品種的種子分七批進(jìn)行春化處理0天、10天、15天、20天、25天、30天、40天，得到春化0天、10天、15天、20天、25天、30天、40天的種子，合理安排這七批種子的春化時間，使七批種子完成春化的時間為同一天；春化前將待測小麥品種的種子進(jìn)行催芽處理；2)將所述春化0天、10天、15天、20天、25天、30天、40天的小麥種子在同一天移栽至人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，觀察其抽穗開花情況；3）根據(jù)待測小麥品種抽穗開花需要的最短的春化時間t確定冬春性。
【專利說明】
一種室內(nèi)快速鑒定小麥冬春性的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種室內(nèi)快速鑒定小麥冬春性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥?zhǔn)侵袊牡诙蠹Z食作物，春化發(fā)育特性是小麥品種的重要農(nóng)藝性狀，直接 影響其種植范圍和利用效率。小麥品種的冬春性不同，其抗寒性早熟性豐產(chǎn)性往往存在較 大差異，生產(chǎn)上常因部分品種冬春性劃分不準(zhǔn)確而造成重大損失，因此對小麥冬春性做科 學(xué)鑒定有重要的意義。
[0003] 從20世紀(jì)初蘇聯(lián)科學(xué)家李克森(Lysenko)提出春化理論以來，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從 不同的角度和層次對小麥春化特性做了大量研究。目前小麥冬春性鑒定方法主要分形態(tài)觀 察法、田間錯期春播法、綜合順序分類法、分子生物學(xué)方法4種。形態(tài)觀察法:正常秋播情況 下，從苗情苗相方面看，田間苗期小麥為匍匐、半匍匐和直立苗相分別對應(yīng)冬性、半冬性和 春性品種;從起身、拔節(jié)、抽穗、開花時間來看，早者為春性，晚者為冬性。目前鑒定最常用的 方法是田間錯期春播法，具體可參照《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南一普通 小麥》（國家標(biāo)準(zhǔn)，GB/T19557.3-2004)的鑒定方法。
[0004] 由于田間錯期春播法易受環(huán)境因素、人為因素及時間空間因素等影響，鑒定結(jié)果 具有一定誤差，且周期性較長，每年只有特定時間可以進(jìn)行鑒定。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展， 學(xué)者們開發(fā)了多種分子標(biāo)記手段用于小麥春化基因的研究。當(dāng)前研究表明，至少有5個基因 控制小麥春化，即 Kr/3-/?K 以前的 KraJ)、Kr/3（Kr/3J?)、Kr/3?( Kr/33)、Kr/34和 Kr/3 (Kra5)，其中的大部分基因已開發(fā)出相應(yīng)的分子生物學(xué)標(biāo)記，但由于春性對冬性為顯性的 現(xiàn)象，使得單純依靠分子生物學(xué)的方法很難對品種冬性的強(qiáng)弱做出明確的鑒定。需要分子 生物學(xué)鑒定和田間鑒定相結(jié)合才能更準(zhǔn)確的鑒定品種的冬春性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明克服目前方法的缺點(diǎn)，提供一種室內(nèi)快速鑒定小麥冬春性的方法。
[0006] 本發(fā)明提供的方法如下： 一種檢測小麥冬春性的方法，包括如下步驟： 1) 將每個待測小麥品種的種子分七批進(jìn)行春化處理0天、10天、15天、20天、25天、30天、 40天，得到春化0天、10天、15天、20天、25天、30天、40天的種子，合理安排這七批種子的春化 時間，使七批種子完成春化的時間為同一天； 春化前將待測小麥品種的種子進(jìn)行催芽處理； 2) 將所述春化0天、10天、15天、20天、25天、30天、40天的小麥種子在同一天移栽至人工 氣候室內(nèi)培養(yǎng)，觀察其抽穗開花情況； 3) 根據(jù)待測小麥品種抽穗開花需要的最短的春化時間t確定冬春性。
[0007] 優(yōu)選的，步驟3)中所述的根據(jù)待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間t確定冬 春性，標(biāo)準(zhǔn)如下： 若待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間t為0天，則待測小麥品種為春性小麥； 若待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間為〇<t<15天，則待測小麥品種為偏春性 小麥； 若待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間為20<t<30,則待測小麥品種為半冬性 小麥； 若待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間為30<t<40天，則待測小麥品種為冬性 小麥； 若待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間t多40天，則待測小麥品種為強(qiáng)冬性小麥。
[0008] 優(yōu)選的，所述的春化前將待測小麥品種的種子進(jìn)行催芽處理為： 春化前將待測小麥品種的種子用70%酒精消毒處理2min，用去離子水沖洗干凈，置于培 養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部事先墊好濾紙，加水10ml，置于25°C無光培養(yǎng)箱中催芽48h。
[0009] 優(yōu)選的，所述的春化處理為:待幼芽生長至2cm時，置于2°C低溫春化室中低溫春化 處理，24h光照，每隔2-3天加水5ml以保證培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙濕潤，水溫應(yīng)與室溫2°C相近以避免 溫差太大影響小麥幼苗生長。
[0010] 優(yōu)選的，所述的人工氣候室設(shè)定溫度20°c，光照為16h/d，排除光周期對抽穗的影 響。
[0011] 本發(fā)明的有益之處:本發(fā)明通過將小麥幼苗分別進(jìn)行0天、10天、15天、20天、25天、30 天、40春化處理，通過觀察小麥抽穗開花所需的最少春化天數(shù)來確定待測小麥的冬春性。相 對于傳統(tǒng)的田間錯期春播法，本發(fā)明更加簡單、省力、快捷，克服了傳統(tǒng)方法每年只能進(jìn)行 一次鑒定的限制，縮短了檢測周期，且準(zhǔn)確率高，為育種人員提供簡易可靠的檢測手段，提 高育種效率。本發(fā)明提供的方法和形態(tài)觀察法、分子生物學(xué)方法相比，準(zhǔn)確率高。
【附圖說明】
[0012] 圖1為溫室移栽10天后小麥幼苗生長情況。
[0013] 圖2為溫室移栽10天后小麥幼苗生長情況。
[0014] 圖3為強(qiáng)冬性材料不同春化時間下生長情況對比圖。
[0015]圖4為冬春性基因型檢測部分材料電泳圖。
[0016]具體實施方法 下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊情況說明，均為常規(guī)方法。
[0017] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)用途得到。
[0018] 實施例1.本發(fā)明方法的確立 試驗材料：泰山1號、濟(jì)麥19、濟(jì)麥20、錢交麥、中國春及山東省區(qū)試材料:AQ1403 2、 11WST067、11WST062、AQ14029、BQ14028、HQ14006、BC12VST066、AQ14028、BC13VST017、 HQ14049、11WST048、BC12VST041、BC12VST033、 BC13VST005、AQ14027、11WST073、11WST066、11WST063、BC12VST056、BC13VST067 、 BC12VST065、BC12VST021、BC12VST019、HQ14024、11WST059、BC13VST017、HQ14049、AQ14033、 BC13VST018、HQ14022、BQ14023、BC13VST012、HQ14005、BQ14006、10WST028、BC12VST056、 11WST066等42個品種。
[0019] 試驗方法:每個品種挑選籽粒飽滿的籽粒140粒，分為7等份，每份20粒，70%酒精消 毒處理2min，用去離子水沖洗干凈，放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25°C暗培養(yǎng)箱中催芽 48h〇
[0020] 待幼苗生長至2cm時，置于2°C低溫春化室中低溫春化處理（24h光照），每隔2-3天 加水5ml以保證培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙濕潤(水溫應(yīng)與室溫2°C相近以避免溫差太大影響小麥幼苗生 長)。
[0021] 將7批處理后的幼苗同一天移栽至人工氣候室的花盆中，人工氣候室設(shè)置溫度20 °C，光照為16h/d以排除光周期對抽穗的影響（不同季節(jié)日照時常不同，應(yīng)根據(jù)不同日照長 度做適當(dāng)光照調(diào)節(jié)）。
[0022]統(tǒng)計待測小麥品種的孕穗抽穗時間及苗情苗相。統(tǒng)計時間以60天為限。
[0023] 冬春性判定標(biāo)準(zhǔn)： 若待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間t為0天，則待測小麥品種為春性小麥； 若待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間為〇<t<15天，則待測小麥品種為偏春性 小麥； 若待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間為20<t<30,則待測小麥品種為半冬性 小麥； 若待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間為30<t<40天，則待測小麥品種為冬性 小麥； 若待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間t多40天，則待測小麥品種為強(qiáng)冬性小麥。 [0024]表1室內(nèi)檢測結(jié)果

' 從表1可以看出，利用本發(fā)明提供的方法可以很好的區(qū)分品種的冬春性。 '
[0025]實施例2.田間錯期春播法和分子生物學(xué)方法驗證本發(fā)明的方法 1.田間錯期春播法 以錢交麥、泰山1號和中國春作為冬性、半冬性和春性對照，分別于2013年和2014年對 上述材料進(jìn)行了田間錯期播種鑒定。
[0026] 2013-2014年田間錯期播種鑒定時間如下：以上材料分6次進(jìn)行播種，第1期正常播 種(2012年10月19日），第2期至第6期延期播種，播種時間分別為2013年2月26日、3月5日、3 月12日、3月19日、3月26日，正常田間管理。
[0027] 2014-2015年田間錯期播種鑒定時間如下：以上材料分6次進(jìn)行播種，第1期正常播 種(2014年10月27日），第2期至第6期延期播種，播種時間分別為2015年2月27日、3月6日、3 月13日、3月20日、3月27日，正常田間管理。
[0028]根據(jù)延期播種的第2-6期抽穗結(jié)果，結(jié)合冬性、半冬性、春性品種的抽穗情況，綜合 判定供試材料的冬春性。強(qiáng)冬性品種錢交麥在第2-6期無法正常抽穗，僅表現(xiàn)為無效分蘗的 生長，不能由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L;半冬性品種泰山1號在第2、3期能抽穗，但抽穗不完 全，第4-6期所有單株均無法正常抽穗，只表現(xiàn)為無效分蘗生長;春性品種中國春在所有第 2-6期延期播種中均能正常抽穗，無效分蘗基本退化。根據(jù)以上分析，從第2期就無法抽穗的 材料，可以判定為強(qiáng)冬性;第2期能正常抽穗，從第3期抽穗不完全或無法抽穗的材料，可以 判定為冬性;第2、3期可以正常抽穗，從第4期開始未能正常抽穗，可以判定為半冬性;供試 材料中第2-4期能夠正常抽穗，無效分蘗完全退化，第5-6期仍能抽穗，無效分蘗已基本退化 或者存在極少無效分蘗未完全退化，可以判定為春性。
[0029]表2田間錯期春播法鑒定結(jié)果
田間錯期春播法以冬性、半冬性和春性對照品種鑒定，可以很好的鑒定小麥品種的冬 春性，是目前常見的權(quán)威鑒定方法。
[0030] 、分子生物學(xué)方法檢測 當(dāng)前研究表明，至少有5個基因控制小麥春化，即Kra-w、KraU、Kr/3-仍、和Kra-54( 其中 Ki73-W、厶 Ki73-仍、起主要作用。
[0031] 具體方法:在上述小麥材料3葉期時采用全式金公司的全基因組DNA提取試劑盒提 取DNA，做小麥春化基因 Kr/3-W、厶Kr/3-仍、Kr/3-例檢測。
[0032] PCR反應(yīng)體系為20yL，其中2*PCR MIX溶液10yL，引物各溶液0.6yL，待測DNA模板 (DNA濃度lOOng/μΙ)ΙμL，用ddH20稀釋至20μ1。同時設(shè)置不加模板的陰性對照。
[0033] PCR反應(yīng)程序為:94 °C變性10 min;然后94 °C變性45 s，72 °C延伸1 min，38個循 環(huán);72 °C延伸10 min。各引物及退火溫度如下： Kr/3-W基因位點(diǎn)的檢測用了3對引物(Yan等，2004;Fu等，2005)，引物對I為VRN1AF與 VRN1-INT1R，引物對 Π 為Intrl/A/F2與Intrl/A/R3,引物對ΙΠ 為Intrl/C/F與Intrl/AB/R。 引物對I是根據(jù)啟動子序列設(shè)計的，可以區(qū)分該基因位點(diǎn)的Kr/3-Wa、與Kr/3-Wc及 ^變異類型。Kradh因啟動子序列的重復(fù)，用引物對I將產(chǎn)生965bp和876bp兩個擴(kuò)增 條帶;而Kr/3從產(chǎn)生714bp條帶，顯性Km2c和隱性類型均產(chǎn)生734bp條帶，但無法 分開Kr/3-Wc與類型。引物對Π 和ΙΠ 是根據(jù)第1內(nèi)含子序列差異而設(shè)計的引物，一起 用于區(qū)分顯性Kr/3c與隱性ft/3類型；隱性ft/3類型僅在引物對ΙΠ 下產(chǎn)生1068bp條 帶，而顯性Kr/3-i^c類型至少在引物對Π 下產(chǎn)生1170bp條帶。
[0034]引物對I:退火溫度50Γ，循環(huán)延伸lmin VRN1AF為：5 ' -GAAAGGAAAAATTCTGCTCG-3 ' （序列 1) VRN1-INT1R: 5 ' -GCAGGAAATCGAAATCGAAG-3 ' （序列 2)。
[0035] 引物對Π :退火溫度56Γ，循環(huán)延伸lmin Intrl/A/F2:5'- AGCCTCCACGGTTTGAAAGTAA-3' （序列3) Intrl/A/R3:5'_ AAGTAAGACAACACGAATGTGAGA-3' （序列4)。
[0036] 引物對m:退火溫度58Γ延伸lmin Intrl/C/F: 5 ' -GCACTCCTAACCCACTAACC-3 ' （序列5) Intr 1/AB/R:為5 ' -TCATCCATCATCAAGGCAAA-3 ' （序列 6)。
[0037] KmU基因位點(diǎn)用2對引物Intr/B/F與 Intrl/B/R3、Intr/B/F與 Intrl/B/R4進(jìn)行 檢測，其中前1對引物用于檢測顯性基因型KraUKraU，后1對用于檢測隱性基因型 捫Km-扮(Fu等，2005)。退火溫度分別為63和58°C延伸循環(huán)lmin引物序列為： Intr/B/F: 5 ' -CAAGTGGAACGGTTAGGACA-3 ' （序列7) Intr 1/B/R3:5 ' -CTCATGCCAAAAATTGAAGATGA-3 ' （序列8) Intr 1/B/R4:5 ' -CAAATGAAAAGGAATGAGAGCA-3 ' （序列 9)。
[0038] 檢測 Kra-仍基因位點(diǎn)的2對引物為Intr/D/F與Intrl/D/R3、Intr/D/F與Intrl/D/ R4，分別用于檢測顯性基因型Ki73-仍Ki73-仍和隱性基因型W73-仍W73-仍(Fu等，2005)。退火 溫度分別為65和63°C，延伸循環(huán)lmin引物序列為： Intr 1/D/F: 5 ' -GTTGTCTGCCTCATCAAATCC-3 ' （序列 10) Intr 1/D/R3:5 ' -GGTCACTGGTGGTCTGTGC-3 ' （序列 11) Intr 1/D/R4:5 ' -AAATGAAAAGGAACGAGAGCG-3 ' （序列 12)。
[0039] 檢測 基因位點(diǎn)的2對引物為VRN4-B-INS-F與VRN4-B-INS-R、VRN4-B-N0INS- F與VRN4-B-N0INS-R ， 分別 用于檢測顯性基因型 Kr/3-份 Kr/3-似和隱性基因型 m份 m份。 其退火溫度分別為63、57°C，延伸循環(huán)lmin引物序列為： VRN4-B-INS-F ： CATAATGCCAAGCCGGTGAGTAC (序列 13) VRN4-B-INS-R ： ATGTCTGCCAATTAGCTAGC (序列 14) VRN4-B-N0INS-F ： ATGCTTTCGCTTGCCATCC (序列 15) VRN4-B-N0INS-R ： CTATCCCTACCGGCCATTAG (序列 16)。
[0040] 表3田間錯期春播法、室內(nèi)鑒定方法、分子生物學(xué)方法鑒定結(jié)果


從上表可以看出，本發(fā)明提供的室內(nèi)鑒定方法和田間鑒定基本符合;42個品種中有5個 不同，但冬春性的基本特征沒有變：如AQ14032田間鑒定為半冬性，室內(nèi)鑒定為偏春性； 11WST067田間鑒定為強(qiáng)冬性，室內(nèi)鑒定為冬性;AQ14029田間鑒定為半冬性，室內(nèi)鑒定為冬 性;BC13VST005田間鑒定為強(qiáng)冬性，室內(nèi)鑒定為冬性；11WST073田間鑒定為春性，室內(nèi)鑒定 為偏春性。
[0041]從上表可以看出，本發(fā)明提供的室內(nèi)鑒定方法和分子生物學(xué)方法相比，更加精細(xì)， 更能符合田間鑒定結(jié)果，比如濟(jì)麥20室內(nèi)鑒定和田間鑒定結(jié)果均為偏春性，但分子生物學(xué) 檢測基因型為albldlb4,不帶有春性顯性基因，分子生物學(xué)檢測不能區(qū)分半春性和冬性。 [0042]經(jīng)過比較可以看出，本發(fā)明提供了一種準(zhǔn)確、精細(xì)、快速的鑒定方法，并且受外界 環(huán)境影響小，實驗結(jié)果穩(wěn)定可靠。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測小麥冬春性的方法，包括如下步驟： 1) 將每個待測小麥品種的種子分七批進(jìn)行春化處理0天、10天、15天、20天、25天、30天、 40天，得到春化0天、10天、15天、20天、25天、30天、40天的種子，合理安排這七批種子的春化 時間，使七批種子完成春化的時間為同一天； 春化前將待測小麥品種的種子進(jìn)行催芽處理； 2) 將所述春化0天、10天、15天、20天、25天、30天、40天的小麥種子在同一天移栽至人工 氣候室內(nèi)培養(yǎng)，觀察其抽穗開花情況； 3) 根據(jù)待測小麥品種抽穗開花需要的最短的春化時間t確定冬春性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于： 步驟3)中所述的根據(jù)待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間t確定冬春性，標(biāo)準(zhǔn)如 下： 若待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間t為0天，則待測小麥品種為春性小麥； 若待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間為〇<t<15天，則待測小麥品種為偏春性 小麥； 若待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間為20<t<30,則待測小麥品種為半冬性 小麥； 若待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間為30<t<40天，則待測小麥品種為冬性 小麥； 若待測品種抽穗開花需要的最短的春化時間t多40天，則待測小麥品種為強(qiáng)冬性小麥。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于： 所述的春化前將待測小麥品種的種子進(jìn)行催芽處理為： 春化前將待測小麥品種的種子用70%酒精消毒處理2min，用去離子水沖洗干凈，置于培 養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部事先墊好濾紙，加水10ml，置于25°C無光培養(yǎng)箱中催芽48h。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于： 所述的春化處理為：待幼芽生長至2cm時，置于2°C低溫春化室中低溫春化處理，24h光 照，每隔2-3天加水5ml以保證培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙濕潤，水溫應(yīng)與室溫2°C相近以避免溫差太大影 響小麥幼苗生長。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于： 所述的春化處理為：待幼芽生長至2cm時，置于2°C低溫春化室中低溫春化處理，24h光 照，每隔2-3天加水5ml以保證培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙濕潤，水溫應(yīng)與室溫2°C相近以避免溫差太大影 響小麥幼苗生長。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于： 所述的人工氣候室設(shè)定溫度20°C，光照為16h/d，排除光周期對抽穗的影響。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于： 所述的人工氣候室設(shè)定溫度20°C，光照為16h/d，排除光周期對抽穗的影響。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于： 所述的人工氣候室設(shè)定溫度20°C，光照為16h/d，排除光周期對抽穗的影響。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于： 所述的人工氣候室設(shè)定溫度20°C，光照為16h/d，排除光周期對抽穗的影響。
【文檔編號】A01G1/00GK106034659SQ201610397019
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月7日
【發(fā)明人】隋新霞, 馮岳, 楚秀生, 樊慶琦, 崔德周, 郭棟, 黃承彥
【申請人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所