油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系的方法
【專利摘要】本發(fā)明油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系的方法，包括1）確定穩(wěn)定株系的恢保關(guān)系；2）根據(jù)測(cè)交后代性狀特征，將臨時(shí)保持系與穩(wěn)定不育系回交或多代回交；3）用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系對(duì)回交后代授粉；4）誘導(dǎo)后代育性鑒定；5）選擇優(yōu)良不育單株，繼續(xù)用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系與之授粉；6）二次誘導(dǎo)授粉后代形成不育株系，鑒定株系的遺傳穩(wěn)定性和不育度；7）用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系授粉保持選育出具有保持系特性的穩(wěn)定新不育系。本發(fā)明能快速選育甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系，最快4代（2年），獲得遺傳穩(wěn)定的甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系，大大提高甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系選育速度，加快甘藍(lán)型油菜雜交品種選育速度和效率，降低人力物力。
【專利說明】
油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系的方法
[0001 ]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明與農(nóng)業(yè)有關(guān)，特別與油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系的方法 有關(guān)。
[0002]
【背景技術(shù)】： 油菜是我國(guó)主要的油料作物，其中甘藍(lán)型油菜占油菜栽培品種的90%以上。甘藍(lán)型油 菜(jSrassica fiapus，蕓苔(aa，n=10)與甘藍(lán)(cc，n=9)通過自然種間雜交后雙二倍化進(jìn)化而 來的一種復(fù)合種，根據(jù)染色體來源判斷為四倍體，2n=38)。目前，甘藍(lán)型油菜栽培品種中 90%以上是雜交品種。甘藍(lán)型油菜的雜種優(yōu)勢(shì)利用，源于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)傅廷棟院士發(fā)現(xiàn)玻 里馬polima CMS細(xì)胞質(zhì)不育系開始。從上世紀(jì)90年代開始，細(xì)胞質(zhì)不育占甘藍(lán)型油菜雜種 優(yōu)勢(shì)利用90%以上。近年來，細(xì)胞核不育快速發(fā)展，目前細(xì)胞質(zhì)不育系統(tǒng)占甘藍(lán)型油菜雜種 優(yōu)勢(shì)利用50 %以上，細(xì)胞質(zhì)不育系統(tǒng)，除了玻里馬po 1 ima CMS不育還發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新了蘿卜細(xì)胞 質(zhì)不育ogura CMS、芥菜型油胞質(zhì)不育Hau CMS、JA胞質(zhì)不育JACMS等細(xì)胞質(zhì)不育類型。
[0003] 甘藍(lán)型油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用，要實(shí)現(xiàn)"三系"配套，不育系、保持系、恢復(fù)系，最為困難 的是不育系，其選育周期長(zhǎng)，一般需要用保持系與不育株回交6 - 8代，才能形成穩(wěn)定的不育 系。傳統(tǒng)的甘藍(lán)型油菜不育系的選育是從甘藍(lán)型油菜優(yōu)良單株的選擇開始到遺傳基本穩(wěn) 定，需要6代左右的時(shí)間，再與不育系測(cè)交，測(cè)交后代高度不育，該測(cè)交父本即為保持系，然 后該保持系一邊自交提純，一邊與不育系成對(duì)回交，而且每成對(duì)交一次，選育樣本數(shù)目就放 大一次，一般選育一個(gè)類型的新不育系需要10畝以上的試驗(yàn)田，且選育出的一批新不育系， 其遺傳來源基本相同，其工作量可想而知。且周期很長(zhǎng)，保持系提純與不育系選育同時(shí)進(jìn) 行，回交6 - 8代后，保持系自交12 -14代，基本形成穩(wěn)定的保持系與不育系，然后新的不育 系跟多個(gè)恢復(fù)系測(cè)配選育優(yōu)良的雜交新組合。因此，不育系選育尤為關(guān)鍵，不育系配合力特 別是普通配合力好，選育強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交組合的幾率就高，如果不育系配合力差，幾十年的工夫 就白費(fèi)。因此，是否能選育出好的甘藍(lán)型油菜新組合(新品種），不育系選育很關(guān)鍵。以1年1 代計(jì)算從不育系選育到最后形成雜交組合需要至少12 -15年左右的時(shí)間，育種效率很低。 [0004]目前，在油菜中還未有誘導(dǎo)系或雙單倍體誘導(dǎo)系的報(bào)道。所謂"誘導(dǎo)系"是指，用該 植物作為父本用其花粉對(duì)同類植株授粉，能誘導(dǎo)同類植株(母本)產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)，如產(chǎn)生 單倍體、雙單倍體(DH系)等。在植物中運(yùn)用誘導(dǎo)系進(jìn)行新品種選育最多的是玉米，但玉米中 的誘導(dǎo)系也只是單倍體誘導(dǎo)系。最早出現(xiàn)的玉米單倍體誘導(dǎo)系為stock6,該誘導(dǎo)系只能誘 導(dǎo)玉米產(chǎn)生單倍體，然后單倍體植株再進(jìn)行人工染色體加倍形成純合二倍體(雙單倍體）， 且誘導(dǎo)效率較低，一般誘導(dǎo)效率在10%以下（以收獲種子中獲得單倍體數(shù)計(jì)算）。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明的目的為了提供一種能快速、有效，最快只需4代(2年)獲得穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞質(zhì) 不育系，提高油菜選育育種材料，特別是雜交育種不育系的選育速度和效率，極大提高甘藍(lán) 型油菜雜交育種的效率，極大地降低不育系選育的人力、物力和選育周期的油菜雙單倍體 誘導(dǎo)系選育甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是這樣來實(shí)現(xiàn)的： 本發(fā)明油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育甘藍(lán)型細(xì)胞質(zhì)不育系的方法，包括以下步驟： 1) 將遺傳穩(wěn)定的、具有目標(biāo)性狀(高含油、高配合力、豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、低芥酸、低硫苷、早熟、 抗病、抗倒伏等性狀)的甘藍(lán)型油菜株系與穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)不育系測(cè)交，確定穩(wěn)定株系的恢保 關(guān)系；穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)不育系可以是玻里馬細(xì)胞質(zhì)不育polima CMS、蘿卜細(xì)胞質(zhì)不育ogura CMS、芥菜型油胞質(zhì)不育Hau CMS、JA胞質(zhì)不育JACMS等甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育類型； 2) 上述步驟1)中，測(cè)交后代全為不育，說明對(duì)應(yīng)的測(cè)交父本為臨時(shí)保持系，并根據(jù)測(cè)交 后代性狀特征，不完全具備遺傳該臨時(shí)保持系的優(yōu)良目標(biāo)性狀，將臨時(shí)保持系與測(cè)交后代 不育株繼續(xù)回交或多代回交； 3) 上述步驟2)中，測(cè)交后代為具有臨時(shí)保持系的優(yōu)良目標(biāo)性狀，直接用油菜雙單倍體 誘導(dǎo)系對(duì)測(cè)交FiF育單株授粉;臨時(shí)保持系與測(cè)交后代不育株回交或多代回交后，具有該 臨時(shí)保持系的優(yōu)良目標(biāo)性狀，用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系對(duì)回交后代或多代回交后代不育單株 授粉，獲得第一次授粉誘導(dǎo)后代； 4) 上述步驟3)中，油菜雙單倍體誘導(dǎo)系第一次授粉誘導(dǎo)后代，在苗期利用流式細(xì)胞儀 鑒定倍性，淘汰多倍體、單倍體，淘汰可育株和具有油菜雙單倍體誘導(dǎo)系顯性性狀特征植 株，選擇正常四倍體、高度不育、具有臨時(shí)保持系優(yōu)良性狀的單株繼續(xù)用油菜雙單倍體誘導(dǎo) 系進(jìn)行第二次授粉，可誘導(dǎo)獲得多個(gè)第二次授粉誘導(dǎo)單株后代； 5) 上述步驟4)中獲得的多個(gè)第二次授粉誘導(dǎo)單株后代，按株系種植，苗期利用流式細(xì) 胞儀鑒定倍性，淘汰多倍體、單倍體，淘汰可育株和具有油菜雙單倍體誘導(dǎo)系顯性性狀特征 植株，對(duì)正常四倍體、高度不育、具有臨時(shí)保持系優(yōu)良性狀的植株不育株系，用分子標(biāo)記 (SSR或SRAP)鑒定株系的遺傳穩(wěn)定性一致性，并調(diào)查不育株系的不育度;形成一個(gè)或多個(gè)穩(wěn) 定的新細(xì)胞質(zhì)不育系。
[0007] 6)上述步驟5)中鑒定的一個(gè)或多個(gè)新穩(wěn)定不育系用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系進(jìn)行第 三次誘導(dǎo)授粉，鑒定誘導(dǎo)系對(duì)這些不育系的誘導(dǎo)能力，第三次誘導(dǎo)后代株系內(nèi)農(nóng)藝性狀、不 育度高度一致、且誘導(dǎo)能力，即株系內(nèi)農(nóng)藝性狀一致，且高度不育度植株占總誘導(dǎo)后代的比 例超過98%，最終用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系保持一個(gè)或多個(gè)不育系遺傳特性和不育狀態(tài)； 7) 上述步驟6)中用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系授粉保持其不育狀態(tài)，穩(wěn)定的新不育系的遺傳 特性與油菜雙單倍體誘導(dǎo)系無關(guān);穩(wěn)定的新不育系具有上述步驟1)中臨時(shí)保持系的性狀特 性，與該臨時(shí)保持系具有一定的遺傳差異或含有50%-99%的臨時(shí)保持系核基因，含有臨時(shí) 保持系核基因的多少取決于臨時(shí)保持系與不育單株的回交代數(shù)，除含有不同程度臨時(shí)保持 系的核基因外，還含有步驟1)中用于測(cè)交的穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)不育的核基因； 8) 上述步驟5)中形成的一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定的新細(xì)胞質(zhì)不育系，根據(jù)油菜雙單倍體誘導(dǎo)系 對(duì)細(xì)胞質(zhì)不育系大于98%的誘導(dǎo)能力(株系內(nèi)農(nóng)藝性狀一致，且高度不育度植株占總誘導(dǎo)后 代的比例超過98%)，用同一個(gè)保持系即油菜雙單倍體誘導(dǎo)系進(jìn)行保持，油菜雙單倍體誘導(dǎo) 系成為新細(xì)胞質(zhì)不育系的萬能保持系，同時(shí)用一個(gè)保持系，保持多個(gè)遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)不 育系;上述步驟5)新形成的穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)不育系與上述步驟1)中的穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)不育系具有明 顯的遺傳差異，引入臨時(shí)保持系的部分基因資源并含有上述步驟1)中的穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)不育系 的基因資源，與油菜雙單倍體誘導(dǎo)系即萬能保持系無遺傳背景上的聯(lián)系，且遺傳穩(wěn)定、高度 不育，是一個(gè)或多個(gè)新細(xì)胞質(zhì)不育系； 上述油菜雙單倍體誘導(dǎo)系的選育方法，包括如下步驟： (1) 選育具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系： ① 將兩個(gè)油菜親本材料雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色 體加倍獲得加倍后的Fi代植株； ② 加倍后的h代植株進(jìn)行自交或強(qiáng)制自交獲得內(nèi)代，對(duì)F2代進(jìn)行田間種植觀察，并鑒定 每個(gè)單株的育性，選擇可育后代自交獲得F 3代，對(duì)F3代進(jìn)行純合度鑒定，通過形態(tài)、細(xì)胞學(xué)以 及分子標(biāo)記鑒定，對(duì)后代DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，電泳觀察每個(gè)特異引物擴(kuò)增下單株的 DNA帶型及條帶數(shù)目，顯示每個(gè)單株都是兩個(gè)親本的雜交后代，每個(gè)單株之間分子標(biāo)記圖譜 一致，說明這些單株是純合系一早代穩(wěn)定系； ③ 獲得的早代穩(wěn)定系與至少10個(gè)油菜常規(guī)純合穩(wěn)定系進(jìn)行正反交，F(xiàn)i代、F2R鑒定早 代穩(wěn)定系的遺傳特性，即是否有孤雌生殖特性;上述正反交，如有Fi分離，^代出現(xiàn)部分穩(wěn)定 株系，對(duì)應(yīng)的早代穩(wěn)定系是具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系； (2) 選育攜帶顯性遺傳性狀、具有孤雌遺傳特性且倍性遺傳穩(wěn)定的多倍體油菜： ① 具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交(如顯性矮桿、紫葉、 花葉、黃葉、高芥酸等性狀），得到雜交?:代種子，雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘 導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體加倍，得到加倍后的帶顯性性狀的^植株； ② 對(duì)加倍的帶顯性性狀的Fi植株，通過顯微觀察或流式細(xì)胞儀進(jìn)行染色體倍性鑒定， 選擇帶顯性性狀的多倍體的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍體植株、以及不帶顯性性狀加 倍植株;帶顯性性狀的多倍體的植株主要是倍性遺傳穩(wěn)定、結(jié)實(shí)性好、具有孤雌生殖遺傳特 性、帶顯性性狀（如顯性矮桿、紫葉、花葉、黃葉、高芥酸等性狀）的六倍體或八倍體油菜植 株； (2)油菜雙單倍體誘導(dǎo)系鑒定及誘導(dǎo)能力測(cè)定： ① 倍性遺傳穩(wěn)定、具有孤雌生殖遺傳特性、帶顯性性狀的多倍體植株中的顯性性狀能 去除測(cè)交后代中產(chǎn)生的雜交株，如果測(cè)交后代中出現(xiàn)顯性性狀植株、或非整倍體植株，說明 該植株是多倍體植株和母本雜交產(chǎn)生的，去除該植株； ② 上述單株測(cè)交后代如果出現(xiàn)全不育、為正常倍性(二倍體或四倍體)油菜、且不帶顯 性性狀，說明該測(cè)交后代對(duì)應(yīng)的父本基因未進(jìn)入測(cè)交后代中，顯性多倍體植株為油菜雙單 倍體誘導(dǎo)系。
[0008] 采用本發(fā)明獲得甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系借助了油菜雙單倍體誘導(dǎo)系能誘導(dǎo)母 體植株在測(cè)交1代發(fā)生孤雌生殖，在測(cè)交2代形成穩(wěn)定的雙單倍體個(gè)體，測(cè)交3代進(jìn)行穩(wěn)定 性、一致性鑒定，獲得穩(wěn)定遺傳后代。
[0009] 上述獲得油菜雙單倍體誘導(dǎo)系是將兩個(gè)親本材料雜交FHf種子或具有孤雌生殖 遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交得到的雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上用染色 體加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體加倍，具體方法如下： 1) 用純度為75%酒精進(jìn)行種子表面消毒25-40秒，用0.1%升汞消毒12-17分鐘，然后用無 菌水將種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在第 一培養(yǎng)基上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度23-251，白天光照12-16小時(shí)，光 照強(qiáng)度2000-3000勒克斯，夜晚暗培養(yǎng)8-12小時(shí)，待植株長(zhǎng)到1 一2片真葉時(shí)，從下胚軸處剪 下植株繼續(xù)在第二培養(yǎng)基上生長(zhǎng)； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn) 入第三培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)二周后，植株長(zhǎng)出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?-7天，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基用自來水沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15-30分鐘后移栽到溫室中，溫室 溫度16 QC-25QC，相對(duì)濕度60-80%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： -MS培養(yǎng)基 1L 6_芐基腺嘌呤 0.5-1.5mg 染色體加倍誘導(dǎo)劑 30-70mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6_芐基腺嘌呤 0.5-lmg 染色體加倍誘導(dǎo)劑 20-40mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第二培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L α-蔡乙酸 0.03-0.5mg 染色體加倍誘導(dǎo)劑 5-20mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第三培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的浸泡緩沖液由以及下配比的組分組成： 水 1L 易?；蚩寺?0.6-1.2g α-萘乙酸 0.5-lmg。
[0010]上述的染色體加倍誘導(dǎo)劑采用秋水仙素、氟樂靈、氨磺樂靈中的至少一種。
[0011]以上描述的方法可以快速用于甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系的快速選育?？梢栽?年 或4代的時(shí)間內(nèi)獲得新的細(xì)胞質(zhì)不育系，大大節(jié)約甘藍(lán)型油菜的育種時(shí)間，提高育種效率。
[0012]油菜雙單倍體誘導(dǎo)系能直接誘導(dǎo)油菜產(chǎn)生雙單倍體后代，無需進(jìn)行人工染色體加 倍來獲得純合系;且誘導(dǎo)效率高，最高可達(dá)1〇〇%，一般的誘導(dǎo)效率都在50%以上。雙單倍體誘 導(dǎo)系誘導(dǎo)母體植株產(chǎn)生雙單倍體的主要原理是:誘導(dǎo)系能誘導(dǎo)母體植株，大孢子生殖細(xì)胞 (卵細(xì)胞)產(chǎn)生孤雌生殖效應(yīng)，且卵細(xì)胞能進(jìn)行染色體加倍，即卵細(xì)胞孤雌生殖產(chǎn)生的后代 就雙單倍體，產(chǎn)生該現(xiàn)象的機(jī)理目前尚不明確。本發(fā)明是油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育甘藍(lán)型 油菜細(xì)胞質(zhì)不育系的方法，該方法可以快速(4代）、高效選育甘藍(lán)型油菜育種中具有應(yīng)用價(jià) 值的不育系育種親本材料，該專利技術(shù)應(yīng)用范圍廣，適應(yīng)于甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系統(tǒng)的 多種類型，為油菜遺傳育種、雜交油菜新品種選育提供高效、便捷的技術(shù)支撐。
[0013]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1、該方法可快速(2年或3代)選育甘藍(lán)型油菜雜交種親本材料(不育系），大大節(jié)約甘藍(lán) 型油菜中不育系的選育周期，提高選育效率。
[0014] 2、該方法可運(yùn)用于目前甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育的多種途徑，特別是細(xì)胞質(zhì)不育系 統(tǒng)的不同雜種優(yōu)勢(shì)利用途徑。包括甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系統(tǒng)(玻里馬細(xì)胞質(zhì)不育polima CMS、蘿卜細(xì)胞質(zhì)不育ogura CMS、芥菜型油胞質(zhì)不育Hau CMS、JA胞質(zhì)不育JA CMS)。
[0015] 3、油菜雙單倍體誘導(dǎo)系直接誘導(dǎo)母體植株產(chǎn)生雙單倍體，無需進(jìn)行人工染色體加 倍，可一步形成穩(wěn)定后代。
[0016] 4、油菜雙單倍體誘導(dǎo)系可以是多個(gè)甘藍(lán)型細(xì)胞質(zhì)不育系的"萬能保持系"，可大大 節(jié)約不育系的制種難度，同時(shí)對(duì)多個(gè)不育系進(jìn)行制種，提高了優(yōu)勢(shì)甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育 系，特別是高配合力不育系的選育效率。
[0017]【附圖說明】： 圖1為油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育甘藍(lán)型細(xì)胞質(zhì)不育系的方法流程圖。
[0018] 圖2為油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育流程圖。
[0019] 圖3為獲得油菜早代穩(wěn)定系的方法流程圖。
[0020] 圖4為油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y3560選育流程圖。
[0021]圖5為油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y3380選育流程圖。
[0022]圖6為油菜早代穩(wěn)定系P3-2選育流程圖。
[0023]圖7為甘藍(lán)型油菜玻里馬細(xì)胞質(zhì)不育系蓉A0051系列不育系的選育圖。
[0024]圖8為甘藍(lán)型油菜蘿卜胞質(zhì)不育系蓉蘿A0034系列不育系的選育圖。
[0025] 圖9為P3-2四倍體油菜根尖染色體倍性鑒定圖。
[0026] 圖10為P3-2四倍體油菜倍性流式細(xì)胞鑒定圖。
[0027]圖11為Y3380流式細(xì)胞倍性鑒定圖。
[0028]圖12為Y3560流式細(xì)胞倍性鑒定圖。
[0029]【具體實(shí)施方式】： 實(shí)施例1: 參見圖1、圖2、圖4、圖5、圖7,甘藍(lán)型油菜小孢子離體培養(yǎng)后代DH0051與玻里馬細(xì)胞質(zhì) 不育系蓉A0068測(cè)交，對(duì)測(cè)交后代鑒定，測(cè)交后代高度不育，該小孢子純合株系DH0051為玻 里馬細(xì)胞質(zhì)不育系的保持系。用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y3560花粉給測(cè)交后代不育單株授粉， 并套袋隔離，收獲誘導(dǎo)后代種子。對(duì)誘導(dǎo)后代進(jìn)行種植，并在苗期用流氏細(xì)胞儀鑒定誘導(dǎo)后 代單株的倍性，淘汰多倍體、單倍體、非整倍體植株。在花期，淘汰具有油菜雙單倍體誘導(dǎo)系 Y3560顯性性狀(矮桿性狀)的不育植株選擇完全不育，植株長(zhǎng)勢(shì)較好的15株不育單株，第二 次用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y3380給不育單株授粉，并套袋隔離。對(duì)二次誘導(dǎo)后代分株系種 植，在苗期及蕾苔期鑒定株系內(nèi)的整齊度，用SSR分子標(biāo)記鑒定株系內(nèi)的遺傳一致性及穩(wěn)定 性，發(fā)現(xiàn)有12個(gè)株系，其株系內(nèi)，外形特征及分子水平高度一致，且12株系都高度不育，12株 系彼此外觀特性差異較大，熟期不一致。對(duì)12個(gè)穩(wěn)定株系繼續(xù)用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y3560 和Y3380花粉進(jìn)行第三次誘導(dǎo)，每個(gè)誘導(dǎo)系株系內(nèi)授粉5株，共10株，并套袋隔離，每個(gè)誘導(dǎo) 系授粉后5個(gè)單株混合收種后混合種植，鑒定其誘導(dǎo)效率。通過誘導(dǎo)效率鑒定發(fā)現(xiàn)Y3560對(duì) 12株系的誘導(dǎo)效率從90-99.5%不等，Y3380對(duì)12株系的誘導(dǎo)效率從90-97.1%不等，由于 Y3380對(duì)這些不育系的誘導(dǎo)效率不高，因此，不能作為該不育系列的萬能保持系；其中有 Y3560誘導(dǎo)后代有5個(gè)株系誘導(dǎo)效率在98%以上，且株系內(nèi)植株穩(wěn)定一致，且高度不育，農(nóng)藝 性狀存在較大差異，熟期不一致，但具有DH0051和蓉A0068的部分遺傳特性，因此通過誘導(dǎo) 系一次性選育出5個(gè)具有DH0051遺傳特性和蓉A0068特性的新不育系蓉A0051-1、蓉A0051-2、蓉A0051-3、蓉A0051-4、蓉A0051-5系列細(xì)胞質(zhì)不育系，這部分相同來源，不同遺傳背景的 不育系可以采用Y3560作為萬能保持系進(jìn)行混合授粉，一次性繁殖5個(gè)不育系。
[0030] 以上實(shí)施例中，油菜雙單倍體誘導(dǎo)系是通過以下方法獲得的： 參見圖2、圖3、圖4、圖9、圖10、圖12,由本
【申請(qǐng)人】獲得的甘藍(lán)型油菜四倍體早代穩(wěn)定系 P3-2，與20個(gè)純合甘藍(lán)型四倍體油菜正反交，3個(gè)正反交^代出現(xiàn)分離，且這3個(gè)組合F2代出 現(xiàn)穩(wěn)定株系，說明P3-2具有孤雌生殖遺傳特性。用P3-2與高芥酸、矮桿油菜4247正反交 (矮桿、高芥酸為顯性性狀），然后將雜交^代種子進(jìn)行染色體加倍，加倍后代用流式細(xì)胞儀 鑒定或根尖顯微鏡觀察鑒定為顯示矮桿八倍體植株，該植株定名為Y3560。
[0031] 參見圖2、圖3、圖5、圖9、圖10、圖11，由本
【申請(qǐng)人】獲得的甘藍(lán)型油菜四倍體早代穩(wěn) 定系P3-2，與20個(gè)純合甘藍(lán)型四倍體油菜正反交，3個(gè)正反交^代出現(xiàn)分離，且這3個(gè)組合F 2 代出現(xiàn)穩(wěn)定株系，說明P3-2具有孤雌生殖遺傳特性。用P3-2與四倍體甘藍(lán)型矮桿油菜 D3-5正反交(矮桿為顯性性狀），然后將雜交種子進(jìn)行染色體加倍，加倍后代用流式細(xì) 胞儀鑒定或根尖顯微鏡觀察鑒定為顯示矮桿八倍體植株，該植株定名為Y3380。
[0032]本實(shí)施例中將P3-2與矮桿油菜D3-5雜交Fi、P3-2與矮桿、高芥酸油菜4247雜交F! 種子在培養(yǎng)基上用秋水仙素進(jìn)行人工染色體加倍的具體方法如下： 1) 用純度為75%酒精進(jìn)行種子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分鐘，然后用無菌水將 種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在第一培養(yǎng) 基(染色體加倍誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度250C，白天光照16小時(shí)，光照強(qiáng)度 2000勒克斯，晚上暗培養(yǎng)8小時(shí)，待長(zhǎng)到1 一2片真葉時(shí)，將植株從下胚軸剪下繼續(xù)在第二培 養(yǎng)基上生長(zhǎng)； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn) 入第三培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基）中進(jìn)行生根培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)二周后，植株長(zhǎng)出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?天后，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15分鐘后移栽到溫室中，溫室溫度250C，相對(duì) 濕度60%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： -MS培養(yǎng)基 1L 6_芐基腺嘌呤（6BA) 0.5mg 秋水仙素 50mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0; MS培養(yǎng)基由Murashige和Skoog發(fā)明，簡(jiǎn)寫為MS，其配方參見附表1， 上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6_芐基腺嘌呤（6BA) 0.5mg 秋水仙素 30mg 鹿糖 30g 瓊脂 8g。
[0033]第二培養(yǎng)基的 ρΗ=5·8-6.0。
[0034]上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L α-萘乙酸 0.03mg 秋水仙素 20mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第三培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0; 上述的浸泡緩沖液由以下配比的組分組成： 水 1L 易保或克露 〇.6g α -萘乙酸 0.5mg。
[0035]參見圖3、圖6、圖11，用Y3380作父本，與甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系(0464A)測(cè)交，測(cè) 交后代50株，全為高桿，且全為四倍體油菜，其中49株為全不育，1株半不育，且形態(tài)特征與 0464A完全相同。同時(shí)用P3-2與矮桿油菜D3-5雜交F!(非加倍株)做父本與0464A測(cè)交作為對(duì) 照驗(yàn)證，測(cè)交后代102株，出現(xiàn)矮桿62株、高桿40株、且育性分離較大，出現(xiàn)全可育73株、半不 育20株、全不育9株。說明Y3380中的基因并未進(jìn)入測(cè)交株，測(cè)交后代為0464A孤雌生殖而來， 誘導(dǎo)率98%。用Y3380做父本與甘藍(lán)型油菜3954去雄聚合雜交（3954SFi，由中雙11與CAX雜 交而來），聚合雜交后代Fi分離，每個(gè)h自交，收獲h自交株45個(gè)。種植F 2代株系45個(gè)，出現(xiàn)穩(wěn) 定株系45個(gè)，穩(wěn)定株系出現(xiàn)比列100%，誘導(dǎo)率100%。
[0036] 用Y3380做父本與甘藍(lán)型油菜3968去雄聚合雜交(3968SFi，由中雙11與1365雜交 而來），聚合雜交后代h分離，每個(gè)h自交，收獲Fi自交株52個(gè)。種植F2代株系52個(gè)，出現(xiàn)穩(wěn)定 株系28個(gè)，穩(wěn)定株系出現(xiàn)比例53.85%，誘導(dǎo)率53.85%。
[0037]用Y3380做父本與甘藍(lán)型油菜中雙11(常規(guī)品種，純合系）去雄雜交，獲得雜交?:植 株70株，70ftFi形態(tài)與中雙11完全相同，且每個(gè)單株自交后F2代未發(fā)生分離，為穩(wěn)定株系，與 中雙11形態(tài)也完全相同，說明F!代就為純系。即Y3380與中雙11雜交過程，誘導(dǎo)中雙11發(fā)生 了孤雌生殖，所產(chǎn)生的FiS孤雌生殖自交，是純合系，因此Fi穩(wěn)定、F 2也穩(wěn)定，且與中雙11形 態(tài)完全相同，該誘導(dǎo)率100%。
[0038]同樣用Y3380做父本與白菜型油菜雅安黃油菜YH(二倍體油菜，2 η =20)去雄雜 交，獲得雜交Fi植株98株，97株?1形態(tài)與ΥΗ完全相同，且每個(gè)單株自交后F2R形態(tài)都為二倍 體、外形與YH-致，說明Y3380與YH雜交過程，誘導(dǎo)YH發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的^為孤雌生 殖自交，且與YH形態(tài)完全相同，該誘導(dǎo)率98.9%。最終，顯性矮桿八倍體植株Y3380確定為油 菜雙單倍體誘導(dǎo)系。
[0039] 參見圖3、圖6、圖12,用Y3560作父本，與甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系(0464A)測(cè)交，測(cè) 交后代80株，全為高桿，且76為四倍體油菜、2株為二倍體、2株為八倍體;其中76株四倍體植 株為全不育，4株半不育，且形態(tài)特征與0464A完全相同。同時(shí)用P3-2與矮桿、高芥酸油菜 4247雜交F!(非加倍株）做父本與0464A測(cè)交作為對(duì)照驗(yàn)證，測(cè)交后代153株，出現(xiàn)矮桿102 株、高桿51株、且育性分離較大，出現(xiàn)全可育65株、半不育35株、全不育53株。說明Y3560中的 基因并未進(jìn)入測(cè)交株，測(cè)交后代為0464A孤雌生殖而來，誘導(dǎo)率95%。
[0040] 用Y3560做父本與白菜型油菜雅安黃油菜YH(二倍體油菜，2 η =20)去雄雜交，獲 得雜交F:植株145株，143株?1形態(tài)與ΥΗ完全相同，且每個(gè)單株自交后F 2代形態(tài)都為二倍體、 外形與YH-致，說明Y3560與YH雜交過程，誘導(dǎo)YH發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的Fi為孤雌生殖 自交，且與YH形態(tài)完全相同，該誘導(dǎo)率98.6%。
[0041] 同樣用Y3560做父本與芥菜型油菜GW(四倍體油菜，2 η =36)去雄雜交，獲得雜交 Fi植株124株，123株&形態(tài)與GW完全相同，且每個(gè)單株自交后F2代形態(tài)都為四倍體、外形與 YH-致，說明Y3560與GW雜交過程，誘導(dǎo)GW發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的FiS孤雌生殖自交，且 與GW形態(tài)完全相同，該誘導(dǎo)率99.2%。最終，顯性矮桿八倍體植株Y3560確定為油菜雙單倍 體誘導(dǎo)系。
[0042] 參見圖3、圖6、圖9、圖10,獲得早代穩(wěn)定系P3-2方法如下： 甘藍(lán)型油菜F009(四倍體，染色體2n=38)與白菜型油菜YH(二倍體，雅安黃油菜，染色體 2n=20)剝蕾進(jìn)行人工去雄雜交獲得h代雜交種子。^代雜交種子在培養(yǎng)基上用秋水仙素進(jìn) 行人工染色體加倍。對(duì)加倍后的FHf植株進(jìn)行自交(或強(qiáng)制自交)獲得^代，對(duì)F 2代進(jìn)行田間 種植觀察、育性鑒定即通過醋酸洋紅對(duì)花粉染色，判斷花粉育性，出現(xiàn)三種情況（1、單倍體 植株，花粉極少，且育性極低；2、多倍體植株完全不育，花器官發(fā)育受阻，不能正常的開花， 無花粉;3、正?？捎闹仓辏ǚ哿慷?，花粉育性95%以上）。對(duì)? 2代正?？捎龁沃赀M(jìn)行自交 獲得F3代。對(duì)F3代進(jìn)行純合度鑒定，種植F3代單株株系，32%的可育株系單株植株整齊一致， 開花結(jié)實(shí)正常。對(duì)整齊一致株系進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定，染色體條數(shù)一致(38條），染色體形態(tài)未出 現(xiàn)異常。SSR分子標(biāo)記，通過DNA聚合酶鏈反應(yīng)，電泳觀察每個(gè)特異引物擴(kuò)增下單株DNA帶型， 顯示每個(gè)單株都是H)09與YH的雜交后代，且每個(gè)單株DNA擴(kuò)增條帶數(shù)目及帶型一致，可以判 斷這些株系為純合系，即早代穩(wěn)定系。將其中1個(gè)葉片較大、無裂葉、葉片著生緊湊、含油率 55%的甘藍(lán)型(染色體38條)油菜早代穩(wěn)定系定名為P3-2。
[0043] 本實(shí)施例中將F1代雜交種子在培養(yǎng)基上用秋水仙素進(jìn)行人工染色體加倍的具體 方法如下： 1) 用純度為75%酒精進(jìn)行種子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分鐘，然后用無菌水將 種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在第一培養(yǎng) 基(染色體加倍誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度250C，白天光照16小時(shí)，光照強(qiáng)度 2000勒克斯，晚上暗培養(yǎng)8小時(shí)，待長(zhǎng)到1 一2片真葉時(shí)，將植株從下胚軸剪下繼續(xù)在第二培 養(yǎng)基上生長(zhǎng)； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn) 入第三培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基）中進(jìn)行生根培養(yǎng)； 4)生根培養(yǎng)二周后，植株長(zhǎng)出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?天后，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15分鐘后移栽到溫室中，溫室溫度250C，相對(duì) 濕度60%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： -MS培養(yǎng)基 1L 6_芐基腺嘌呤（6BA) 0.5mg 秋水仙素 30mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0; MS培養(yǎng)基由Murashige和Skoog發(fā)明，簡(jiǎn)寫為MS，其配方參見附表1。
[0044] 上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6_芐基腺嘌呤（6BA) 0.5mg 秋水仙素 20mg 鹿糖 30g 瓊脂 8g， 第二培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0; 上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L α-萘乙酸 0.03mg 秋水仙素 5mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第三培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0; 上述的浸泡緩沖液由以下配比的組分組成： 水 1L 易?；蚩寺?〇.6g α -萘乙酸 0.5mg。
[0045] 附表1 MS培養(yǎng)基成分配方：
實(shí)施例2: 參見圖1、圖2、圖4、圖5、圖8，甘藍(lán)型油菜小孢子離體培養(yǎng)后代DH0034與蘿卜胞質(zhì)不育 系蓉蘿A100測(cè)交，對(duì)測(cè)交后代鑒定，測(cè)交后代高度不育，該小孢子純合株系DH0034為蘿卜胞 質(zhì)不育系的保持系。用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y3380花粉給測(cè)交后代不育單株授粉，并套袋隔 離，收獲誘導(dǎo)后代種子。對(duì)誘導(dǎo)后代進(jìn)行種植，并在苗期用流氏細(xì)胞儀鑒定誘導(dǎo)后代單株的 倍性，淘汰多倍體、單倍體、非整倍體植株。在花期，淘汰具有油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y3380顯 性性狀(矮桿性狀)不育植株。選擇完全不育，植株長(zhǎng)勢(shì)較好的20株不育單株，第二次用油菜 雙單倍體誘導(dǎo)系Y3560給不育單株授粉，并套袋隔離。對(duì)二次誘導(dǎo)后代分株系種植，在苗期 及蕾苔期鑒定株系內(nèi)的整齊度，用SSR分子標(biāo)記鑒定株系內(nèi)的遺傳一致性及穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)有 17個(gè)株系株系內(nèi)外形特征及分子水平高度一致，且17株系都高度不育，17株系彼此外觀特 性差異較大，熟期不一致。對(duì)17個(gè)穩(wěn)定株系繼續(xù)用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y3560和Y3380花粉 進(jìn)行第三次誘導(dǎo)，每個(gè)誘導(dǎo)系株系內(nèi)授粉5株，共10株，并套袋隔離，每個(gè)誘導(dǎo)系授粉后5個(gè) 單株混合收種后混合種植，鑒定其誘導(dǎo)效率。通過誘導(dǎo)效率鑒定發(fā)現(xiàn)Y3560對(duì)17株系的誘導(dǎo) 效率從90-96.8%不等，Y3380對(duì)17株系的誘導(dǎo)效率從90-100%不等，由于Y3560對(duì)這些不育系 的誘導(dǎo)效率不高，因此，不能作為該不育系列的萬能保持系;其中Y3380誘導(dǎo)后代有8個(gè)株系 誘導(dǎo)效率在98%以上，且株系內(nèi)植株穩(wěn)定一致，且高度不育，農(nóng)藝性狀存在較大差異，熟期不 一致，含油率也從43-48%不等，但具有DH0034和蓉蘿A100的部分遺傳特性，因此通過誘導(dǎo)系 一次性選育出8個(gè)具有DH0034遺傳特性和蓉蘿A100特性的新不育系蓉蘿A0034-1、蓉蘿 A0034-2、蓉蘿A0034-3、蓉蘿A0034-4、蓉蘿A0035-5、蓉蘿A0035-6、蓉蘿A0035-7、蓉蘿 A0035-8系列蘿卜胞質(zhì)不育系，這部分相同來源，不同遺傳背景的不育系可以采用Y3380作為 萬能保持系進(jìn)行混合授粉，一次性繁殖8個(gè)不育系，后期對(duì)8個(gè)不育系進(jìn)行配合力測(cè)定再淘 汰部分株系，選擇具有高配合力、高含油、多抗、早熟的蘿卜胞質(zhì)新不育系。
[0046]本實(shí)施例2中油菜雙單倍體誘導(dǎo)系的選育方法同實(shí)施例1。
[0047]本發(fā)明適用于甘藍(lán)型油菜所有細(xì)胞質(zhì)不育類型，包括玻里馬細(xì)胞質(zhì)不育polima CMS、蘿卜細(xì)胞質(zhì)不育ogura CMS、芥菜型油胞質(zhì)不育Hau CMS、JA胞質(zhì)不育JACMS等。
[0048]上述實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述 主題的范圍僅限于上述實(shí)施例。凡基于上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的額范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系的方法，包括W下步驟： 1) 將遺傳穩(wěn)定的、具有目標(biāo)性狀的甘藍(lán)型油菜株系與穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)不育系測(cè)交，判斷 遺傳穩(wěn)定株系的恢保關(guān)系； 2) 上述步驟1)中，測(cè)交后代為全不育，對(duì)應(yīng)的測(cè)交父本為臨時(shí)保持系，并根據(jù)測(cè)交后代 性狀特征，將臨時(shí)保持系與測(cè)交后代不育株繼續(xù)回交或多代回交； 3) 上述步驟2)中，測(cè)交后代具有臨時(shí)保持系的優(yōu)良目標(biāo)性狀，直接用油菜雙單倍體誘 導(dǎo)系對(duì)測(cè)交Fi不育單株授粉;臨時(shí)保持系與測(cè)交后代不育株回交或多代回交后具有該臨時(shí) 保持系的優(yōu)良目標(biāo)性狀，用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系對(duì)回交后代或多代回交后代不育單株授 粉;獲得第一次授粉誘導(dǎo)后代； 4) 上述步驟3)中，油菜雙單倍體誘導(dǎo)系第一次授粉誘導(dǎo)后代，在苗期利用流式細(xì)胞儀 鑒定倍性，淘汰多倍體、單倍體，淘汰可育株和具有油菜雙單倍體誘導(dǎo)系顯性性狀特征植 株，選擇正常四倍體、高度不育、具有臨時(shí)保持系優(yōu)良性狀的單株繼續(xù)用油菜雙單倍體誘導(dǎo) 系進(jìn)行第二次授粉，可誘導(dǎo)獲得多個(gè)第二次授粉誘導(dǎo)單株后代； 5) 上述步驟4)中獲得的多個(gè)第二次授粉誘導(dǎo)單株后代，按株系種植，苗期利用流式細(xì) 胞儀鑒定倍性，淘汰多倍體、單倍體，淘汰可育株和具有油菜雙單倍體誘導(dǎo)系顯性性狀特征 植株，對(duì)正常四倍體、高度不育、具有臨時(shí)保持系優(yōu)良性狀的植株不育株系，用分子標(biāo)記鑒 定株系的遺傳穩(wěn)定性一致性，并調(diào)查不育株系的不育度;形成一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定的新細(xì)胞質(zhì) 不育系； 6) 上述步驟5)中鑒定的一個(gè)或多個(gè)新穩(wěn)定不育系用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系進(jìn)行第Ξ次 誘導(dǎo)授粉，鑒定誘導(dǎo)系對(duì)運(yùn)些不育系的誘導(dǎo)能力，第Ξ次誘導(dǎo)后代株系內(nèi)農(nóng)藝性狀、不育度 高度一致、且誘導(dǎo)能力，即株系內(nèi)農(nóng)藝性狀一致，且高度不育度植株占總誘導(dǎo)后代的比例超 過98%，最終用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系保持一個(gè)或多個(gè)不育系遺傳特性和不育狀態(tài)； 7) 上述步驟6)中用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系授粉保持其不育狀態(tài)，穩(wěn)定的新不育系的遺傳 特性與油菜雙單倍體誘導(dǎo)系無關(guān);穩(wěn)定的新不育系具有上述步驟1)中臨時(shí)保持系的性狀特 性，與該臨時(shí)保持系具有一定的遺傳差異或含有50%-99%的臨時(shí)保持系核基因，含有臨時(shí) 保持系核基因的多少取決于臨時(shí)保持系與不育單株的回交代數(shù)，除含有不同程度臨時(shí)保持 系的核基因外，還含有步驟1)中用于測(cè)交的穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)不育的核基因； 8) 上述步驟5)中形成的一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定的新細(xì)胞質(zhì)不育系，根據(jù)油菜雙單倍體誘導(dǎo)系 對(duì)細(xì)胞質(zhì)不育系大于98%的誘導(dǎo)能力，用同一個(gè)保持系即油菜雙單倍體誘導(dǎo)系進(jìn)行保持，油 菜雙單倍體誘導(dǎo)系成為新細(xì)胞質(zhì)不育系的萬能保持系，同時(shí)用一個(gè)保持系，保持多個(gè)遺傳 穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)不育系;上述步驟5)新形成的穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)不育系與上述步驟1)中的穩(wěn)定細(xì)胞 質(zhì)不育系具有明顯的遺傳差異，引入臨時(shí)保持系的部分基因資源并含有上述步驟1)中的穩(wěn) 定細(xì)胞質(zhì)不育系的基因資源，與油菜雙單倍體誘導(dǎo)系即萬能保持系無遺傳背景上的聯(lián)系， 且遺傳穩(wěn)定、高度不育，是一個(gè)或多個(gè)新細(xì)胞質(zhì)不育系； 上述油菜雙單倍體誘導(dǎo)系的選育方法，包括如下步驟： (1)選育具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系： ① 將兩個(gè)油菜親本材料雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體 加倍獲得加倍后的Fi代植株； ② 加倍后的Fi代植株進(jìn)行自交或強(qiáng)制自交獲得F2代，對(duì)F2代進(jìn)行田間種植觀察，并鑒定 每個(gè)單株的育性，選擇可育后代自交獲得的代，對(duì)的代進(jìn)行純合度鑒定，通過形態(tài)、細(xì)胞學(xué)w 及分子標(biāo)記鑒定，對(duì)后代DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，電泳觀察每個(gè)特異引物擴(kuò)增下單株的 DNA帶型及條帶數(shù)目，顯示每個(gè)單株都是兩個(gè)親本的雜交后代，每個(gè)單株之間分子標(biāo)記圖譜 一致，說明運(yùn)些單株是純合系---早代穩(wěn)定系； ③獲得的早代穩(wěn)定系與至少10個(gè)油菜常規(guī)純合穩(wěn)定系進(jìn)行正反交，F(xiàn)i代、F2代鑒定早代 穩(wěn)定系的遺傳特性，即是否有孤雌生殖特性;上述正反交，如有Fi分離，F(xiàn)2代出現(xiàn)部分穩(wěn)定株 系，對(duì)應(yīng)的早代穩(wěn)定系是具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系； (2)選育攜帶顯性遺傳性狀、具有孤雌遺傳特性且倍性遺傳穩(wěn)定的多倍體油菜： ① 具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交得到雜交Fi代種子， 雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體加倍，得到加倍后的帶顯性 性狀的Fi植株； ② 對(duì)加倍的帶顯性性狀的Fi植株，通過顯微觀察或流式細(xì)胞儀進(jìn)行染色體倍性鑒定，選 擇帶顯性性狀的多倍體的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍體植株、W及不帶顯性性狀加倍 植株帶顯性性狀的，帶顯性性狀的多倍體的植株是倍性遺傳穩(wěn)定、結(jié)實(shí)性好、具有孤雌生殖 遺傳特性、帶顯性性狀的六倍體或八倍體油菜植株； 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系鑒定及誘導(dǎo)能力測(cè)定： ① 倍性遺傳穩(wěn)定、具有孤雌生殖遺傳特性、帶顯性性狀的多倍體植株中的顯性性狀能 去除測(cè)交后代中產(chǎn)生的雜交株，測(cè)交后代中出現(xiàn)顯性性狀植株、或非整倍體植株，說明該植 株是多倍體植株和母本雜交產(chǎn)生的，去除該植株； ② 上述單株測(cè)交后代出現(xiàn)全不育、為正常倍性即二倍體或四倍體油菜、且不帶顯性性 狀，說明該測(cè)交后代對(duì)應(yīng)的父本基因未進(jìn)入測(cè)交后代中，顯性多倍體植株為油菜雙單倍體 誘導(dǎo)系。2.如權(quán)利要求1所述的油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育甘藍(lán)型油菜品種細(xì)胞質(zhì)不育的方法， 其特征在于油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育是將兩個(gè)親本材料雜交Fi代種子或具有孤雌生殖遺 傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交得到的雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上用染色體 加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體加倍，具體方法如下： 1) 用純度為75%酒精進(jìn)行種子表面消毒25-40秒，用0.1%升隸消毒12-17分鐘，然后用無 菌水將種子表面的升隸沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在第 一培養(yǎng)基上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度23-25?，白天光照12-16小時(shí)，光照 強(qiáng)度2000-3000勒克斯，夜晚暗培養(yǎng)8-12小時(shí)，待植株長(zhǎng)到1-2片真葉時(shí)，從下胚軸處剪下 植株繼續(xù)在第二培養(yǎng)基上生長(zhǎng)； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn) 入第Ξ培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)二周后，植株長(zhǎng)出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?-7天，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基用自來水沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15-30分鐘后移栽到溫室中，溫室 溫度16化一化化，相對(duì)濕度60-80%，能保證移栽成活率在95%W上； 上述的第一培養(yǎng)基由W下配比的組分組成： 一MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嚷嶺 0.5-1.5mg 染色體加倍誘導(dǎo)劑 30-70mg 薦糖 20-30g 瓊脂 8-lOg， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第二培養(yǎng)基由W下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嚷嶺 0.5-Img 染色體加倍誘導(dǎo)劑 20-40mg 薦糖 20-30g 瓊脂 8-lOg， 第二培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第Ξ培養(yǎng)基由W下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 日-糞乙酸 0.03-0.5mg 染色體加倍誘導(dǎo)劑 5-20mg 薦糖 20-30g 瓊脂 8-lOg， 第Ξ培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的浸泡緩沖液由W及下配比的組分組成： 水 1L 易?；蚩寺?0.6-1.2g α-糞乙酸 0.5-Img。3.如權(quán)利要求1或2所述的油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系的方法， 其特征在于染色體加倍誘導(dǎo)劑采用秋水仙素、氣樂靈、氨橫樂靈中的至少一種。
【文檔編號(hào)】A01H1/04GK106069718SQ201610458225
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月23日
【發(fā)明人】付紹紅, 楊進(jìn), 王繼勝, 李云, 鄒瓊, 陶蘭蓉, 康澤明, 唐蓉
【申請(qǐng)人】成都市農(nóng)林科學(xué)院