專利名稱：微型細胞中空纖維反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微型細胞中空纖維反應(yīng)器。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的藥物藥理毒理研究基于動物模型、體外原代細胞模型和連續(xù)細胞系模型三種。動物模型有實驗周期長，效率低，個體差異大導(dǎo)致結(jié)果偏差過大，不利于動物保護等缺點，而不可消除種屬差異，是動物模型致命的弱點。連續(xù)細胞系雖然培養(yǎng)方式簡單，效率高成本低，但連續(xù)細胞系與原代培養(yǎng)細胞在結(jié)構(gòu)和功能上仍有較大差別，并不能完全體現(xiàn)藥物在人體或動物體內(nèi)的代謝和毒性作用。
目前，國內(nèi)外研究者開始重視體外原代細胞模型在藥物研究上的應(yīng)用。它所需細胞量少，可能從根本上消除種屬差異和個體差異，干擾因素小，所得的結(jié)果重復(fù)性好。用于藥物研究的體外細胞模型主要有孔板培養(yǎng)和平皿培養(yǎng)等，此種二維的方式雖然操作簡單，但保持細胞活性時間短，細胞功能易喪失，不能很好的模擬體內(nèi)細胞的結(jié)構(gòu)和功能，這些缺陷使其應(yīng)用受到了限制。而三維培養(yǎng)方式，如中空纖維生物人工肝反應(yīng)器，雖能較長時間保持細胞功能，模擬肝臟環(huán)境，但結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需要有多路供氧和培養(yǎng)基循環(huán)，體積龐大，成本也相當高，顯然不適用于需要小型化的藥物代謝研究和高通量的藥物篩選。
同時，實驗室研究細胞培養(yǎng)條件和生產(chǎn)細胞代謝產(chǎn)物，需要一種小型化，適合進行條件實驗、優(yōu)化、篩選的裝置。而工業(yè)生產(chǎn)用的大型中空纖維反應(yīng)器顯然無法滿足這個要求。如果能找到一種既操作簡單，又容易放大的培養(yǎng)方式，對于動物細胞工業(yè)化生產(chǎn)的前期研究有一定的意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有的藥物研究模型的不足，從生物人工肝反應(yīng)器和人工器官得到啟發(fā)，本發(fā)明的目的在于提供一種微型細胞中空纖維反應(yīng)器，大大簡化了一般反應(yīng)器所需的結(jié)構(gòu)和操作，以三維培養(yǎng)的方式達到仿生學效果，并能長期維持動物細胞功能。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是包括硅膠管，硅膠塞，1根以上的中空纖維絲；中空纖維絲裝在硅膠管中，硅膠管兩頭用硅膠塞封口。
所說的硅膠管和硅膠塞材料為傳氧硅膠材料。
所說的中空纖維絲的材料是其截留分子量在100KDa～1000KDa的聚丙烯、聚砜、聚丙烯腈或聚乙烯；中空纖維絲中空纖維絲為1-100根。
所說的中空纖維反應(yīng)器的體積為0.1ml-10ml。
本發(fā)明具有的有益的效果是能對動物細胞進行長期三維培養(yǎng)，保持了動物細胞的生物活性，一是作為藥物代謝和藥理毒理的研究的動物肝細胞體外模型，二是用于細胞培養(yǎng)條件和產(chǎn)物生產(chǎn)的實驗室研究。并且可作為動物細胞培養(yǎng)條件研究的載體，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。


圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是實施例1在中空纖維反應(yīng)器中培養(yǎng)9h和129h的大鼠肝細胞存活情況照片；圖3是實施例1在平皿中培養(yǎng)9h和129h的大鼠肝細胞存活情況照片；圖4是實施例3的白蛋白和尿素產(chǎn)量曲線；圖5是實施例4的細胞照片。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
如附圖1所示，本發(fā)明包括硅膠管1，硅膠塞2，1根以上的中空纖維絲3；中空纖維絲3裝在硅膠管1中，硅膠管1兩頭用硅膠塞2封口。
具體實施例1(中空纖維反應(yīng)器和平皿培養(yǎng)的比較)硅膠管1長13cm，內(nèi)徑0.8cm，外徑1.2cm。硅膠塞2細端0.75cm，粗端1.35cm。中空纖維絲3聚丙烯腈材質(zhì)，外徑0.110cm-0.120cm，截留分子量為1000KDa。
將收獲活率高于90％的大鼠肝細胞按106cells/ml密度接種于4倍濃縮培養(yǎng)基和鼠尾膠原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入中空纖維絲3，37℃放置10分鐘使之凝固。將中空纖維絲3剪短，8cm×12根，裝入硅膠管1，加入5ml含5％胎牛血清Williams’E培養(yǎng)基，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
將同批大鼠肝細胞按0.8×106cells/ml接入5ml含5％胎牛血清Williams’E培養(yǎng)基，在鋪有鼠尾膠原的平皿培養(yǎng)。培養(yǎng)條件與上述相同。
待平皿中細胞貼壁后(12-18h)，在中空纖維反應(yīng)器和平皿中分別加入含待測藥物10mM醋氨酚培養(yǎng)基和不含藥物培養(yǎng)基(作為空白對照)。其后每60h更換新的培養(yǎng)基。
各重復(fù)三組，測定肝功能指標尿素和白蛋白，觀察細胞形態(tài)。
結(jié)果如下表1及附圖2，3所示。
表1

附圖2表示了中空纖維反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)9h和129h的大鼠肝細胞存活情況，經(jīng)過臺盼蘭染色后，圖中暗色細胞為死細胞，亮色細胞為活細胞。附圖3表示了平皿培養(yǎng)9h和129h的大鼠肝細胞存活情況，左圖中細胞貼壁良好，說明細胞活率高，右圖中細胞脫附成懸浮狀態(tài)，貼壁消失，說明細胞活率降低。
由附圖2，3和上表可見，大鼠肝細胞在中空纖維反應(yīng)器內(nèi)的存活狀態(tài)比平皿單層培養(yǎng)良好，且中空纖維反應(yīng)器組對肝毒性藥物醋氨酚的反應(yīng)比平皿組更顯著，說明了中空纖維反應(yīng)器比平皿更適用于藥物毒性研究。
一般多孔板常被用做細胞體外的載體，而多孔板培養(yǎng)與平皿培養(yǎng)都是二維的單層培養(yǎng)方式，有很多的共同點。因此，實驗發(fā)現(xiàn)中空纖維反應(yīng)器培養(yǎng)細胞比平皿更優(yōu)越，也可說明本發(fā)明與多孔板的差異。
具體實施例2(中空纖維反應(yīng)器用于藥物代謝的研究)硅膠管1長13cm，內(nèi)徑0.8cm，1.2cm。硅膠塞2細端0.75cm，粗端1.35cm。中空纖維絲3聚砜材質(zhì)，外徑0.110cm-0.120cm，截留分子量為1000KDa。
將收獲活率高于90％的大鼠肝細胞按106cells/ml密度接種于4倍濃縮培養(yǎng)基和鼠尾膠原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入中空纖維絲3，37℃放置10分鐘使之凝固。將中空纖維絲3剪短，8cm×12根，裝入硅膠管1，加入5ml含5％胎牛血清Williams’E培養(yǎng)基，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
將同批大鼠肝細胞按0.8×106cells/ml接入5ml含5％胎牛血清Williams’E培養(yǎng)基，在鋪有鼠尾膠原的平皿培養(yǎng)。培養(yǎng)條件與上述相同。
培養(yǎng)60h后，各組加入約40uM的非那西丁溶液，經(jīng)過3h的藥物代謝，HPLC法測定非那西丁和代謝產(chǎn)物醋氨酚的含量。結(jié)果如表2所示表2


由上表可見，大鼠肝細胞在中空纖維反應(yīng)器內(nèi)代謝非那西丁的能力高于平皿培養(yǎng)細胞，說明細胞色素P450活性比平皿單層培養(yǎng)良好，因此中空纖維反應(yīng)器比平皿更適用于藥物代謝研究。
具體實施例3(中空纖維反應(yīng)器用于藥物肝毒性的研究)硅膠管1長13cm，內(nèi)徑0.8cm，外徑1.2cm。硅膠塞2細端0.75cm，粗端1.35cm。中空纖維絲3聚砜材質(zhì)，外徑0.110cm-0.120cm，截留分子量為1000KDa。
將收獲活率高于90％的大鼠肝細胞按106cells/ml密度接種于4倍濃縮培養(yǎng)基和鼠尾膠原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入中空纖維絲3，37℃放置10分鐘使之凝固。將中空纖維絲3剪短，8cm×12根，裝入硅膠管1，加入5ml含5％胎牛血清Williams’E培養(yǎng)基，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
培養(yǎng)12-18h后，各組分別換入含藥物濃度為利福平10mg/ml，異煙肼15mg/ml的培養(yǎng)基和不含藥物的培養(yǎng)基，每24h取樣一次，每60h換培養(yǎng)基一次。重復(fù)三次，測定樣品的尿素和白蛋白產(chǎn)量。結(jié)果如附圖4所示，白蛋白生成量隨時間變化曲線(左)，尿素產(chǎn)量隨時間變化曲線(右)。
由圖可見，該濃度的利福平和異煙肼作用下，白蛋白和尿素的產(chǎn)量均低于空白對照組，因此藥物對大鼠肝細胞有損傷作用，從而導(dǎo)致細胞肝功能的部分喪失。說明了本發(fā)明用于肝毒性藥物研究的可行性。
具體實施例4(中空纖維反應(yīng)器用于連續(xù)細胞株的培養(yǎng))硅膠管1長13cm，內(nèi)徑0.8cm，1.2cm。硅膠塞2細端0.75cm，粗端1.35cm。中空纖維絲3聚丙烯材質(zhì)，外徑0.110cm-0.120cm，截留分子量分別為30KD和100KD。
將小鼠成纖維細胞L929按106cells/ml密度接種于4倍濃縮培養(yǎng)基和鼠尾膠原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入如上所述的兩種中空纖維絲3，37℃放置10分鐘使之凝固。將中空纖維絲3剪短，8cm×12根，裝入硅膠管身1，加入5ml含10％小牛血清1640培養(yǎng)基，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
培養(yǎng)60h后經(jīng)EB/FDA染色后的熒光顯微鏡照片如附圖5所示，為培養(yǎng)60h后L929的生長情況，EB/FDA染色，×100倍熒光顯微鏡照片。截留分子量為100KD的聚砜中空纖維絲培養(yǎng)(左)，截留分子量為30KD的聚砜中空纖維絲培養(yǎng)(右)。
可見L929細胞在截留分子量100KD的中空纖維反應(yīng)器內(nèi)的生長情況(細胞增殖數(shù)量)優(yōu)于相同材質(zhì)的截留分子量30KD。從而篩選得到100KD聚砜中空纖維絲適合用于細胞培養(yǎng)。
具體實施例5(中空纖維反應(yīng)器用于保肝藥物的篩選)硅膠管1長13cm，內(nèi)徑0.8cm，外徑1.2cm。硅膠塞2細端0.75cm，粗端1.35cm。中空纖維絲3聚砜材質(zhì)，外徑0.110cm-0.120cm，截留分子量為1000KDa。
將收獲活率高于90％的大鼠肝細胞按106cells/ml密度接種于4倍濃縮培養(yǎng)基和鼠尾膠原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入中空纖維絲3，37℃放置10分鐘使之凝固。將中空纖維絲3剪短，8cm×12根，裝入硅膠管1，加入5ml含5％胎牛血清Williams’E培養(yǎng)基，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
培養(yǎng)12-18h后，各組分別換入含藥物濃度為10mM醋氨酚培養(yǎng)基、10mM醋氨酚+4mM谷胱甘肽、10mM醋氨酚+4mM N-乙酰半胱氨酸、10mM醋氨酚+4mM半胱氨酸和不含藥物培養(yǎng)基(作為空白對照)。
24h后觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)10mM醋氨酚+4mM谷胱甘肽組的細胞活率較高。即從三種待選的保肝藥物中篩選得到谷胱甘肽對醋氨酚的藥物性肝損有保護作用。這是本發(fā)明用于保肝藥物篩選的一例。
權(quán)利要求
1.一種微型細胞中空纖維反應(yīng)器，其特征在于包括硅膠管(1)，硅膠塞(2)，1根以上的中空纖維絲(3)；中空纖維絲(3)裝在硅膠管(1)中，硅膠管(1)兩頭用硅膠塞(2)封口。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微型細胞中空纖維反應(yīng)器，其特征在于所說的硅膠管(1)和硅膠塞(2)材料為傳氧硅膠材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微型細胞中空纖維反應(yīng)器，其特征在于所說的中空纖維絲的材料是其截留分子量在100KDa-1000KDa的聚丙烯、聚砜、聚丙烯腈或聚乙烯；中空纖維絲(3)為1-100根。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微型細胞中空纖維反應(yīng)器，其特征在于所說的中空纖維反應(yīng)器的體積為0.1ml-10ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微型細胞中空纖維反應(yīng)器，它是由透氣硅膠材料的硅膠管，透氣硅膠塞和中空纖維絲組成。將細胞用膠原凝膠包埋在中空纖維絲內(nèi)，因微型細胞中空纖維反應(yīng)器有適合細胞生存的傳氧和傳質(zhì)能力，保持了細胞的藥物代謝等功能。它結(jié)合了孔板的微型化優(yōu)勢和人工肝反應(yīng)器的三維仿生培養(yǎng)優(yōu)勢，保持了動物細胞的生物活性，一是作為藥物代謝和藥理毒理的研究的動物肝細胞體外模型，二是用于細胞培養(yǎng)條件和產(chǎn)物生產(chǎn)的實驗室研究。并且可作為動物細胞培養(yǎng)條件研究的載體，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12N11/00GK1587403SQ200410053499
公開日2005年3月2日 申請日期2004年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月1日
發(fā)明者孟琴, 沈沖 申請人:浙江大學