專利名稱：一種重組新疆家蠶抗菌肽制備方法及其獲得的新疆家蠶抗菌肽與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域。具體地說，涉及到一種重組新疆家蠶抗菌肽的純化制備方法、重組新疆家蠶抗菌肽及其在抑菌、抗腫瘤方面的應用。
背景技術：
青霉素的發(fā)現(xiàn)，使人們擺脫了對病原微生物所致疾病的恐懼，由此導致了大量的抗菌素的出現(xiàn)，為保護人類的健康奠定了堅實的基礎。但是傳統(tǒng)抗菌素的濫用和耐藥菌株的不斷產生，嚴重影響了感染性疾病的臨床治療效果。因此，新一代抗菌素的研制成為21世紀新藥研發(fā)的重點。近20多年來，不同來源的抗菌肽顯示出了廣譜抗菌活性的特點，而且具有傳統(tǒng)抗菌素不可比擬的優(yōu)點，即不會引起耐藥菌株的產生，從而有望成為新一代的抗菌制劑。
家蠶在中醫(yī)藥中常作為輔料用于疾病的治療。天然的抗菌肽也可用作藥物原料。1996年將柞蠶抗菌肽用于治療腎炎、肝炎的新藥“腎肝寧”。1997年，柞蠶素膠囊以西藥二類治療乙型肝炎進入了臨床觀察。但是，由于天然抗菌肽含量少，提取得率低(0.005％)，成本高未能工業(yè)化生產。
新疆有著悠久的養(yǎng)蠶歷史。在長期的養(yǎng)殖中，培育出大量有較強抗病能力的品種。張富春等從新疆阿克蘇地區(qū)蠶種場所培育的新蠶三號的3齡幼蟲中克隆到家蠶抗菌肽的cDNA分子，所編碼的蛋白質氨基酸序列與已報道的家蠶天蠶素B序列的同源性達98％。而且新疆家蠶抗菌肽已在原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)中得到了表達，為新疆家蠶抗菌肽的大量制備提供了堅實的平臺。
重組昆蟲抗菌肽是利用生物工程技術，將抗菌肽基因克隆到基因工程菌中，從而產生的殺菌多肽。重組新疆家蠶抗菌肽的制備主要采用高效液相色譜技術(HPLC)或者采用原核表達系統(tǒng)表達融合的抗菌肽，酶切后，用離子交換層析技術分離得到所需的抗菌肽，這種方法產生的抗菌肽產量低，成本高。重組新疆家蠶抗菌肽是將從新疆阿克蘇家蠶克隆得到的抗菌肽基因，轉化到抗菌肽基因工程菌中，通過發(fā)酵而獲得。發(fā)酵所得的重組抗菌肽的純度達不到生物醫(yī)學的需要，限制了其應用。這就需要進行深度的純化。目前，重組抗菌肽的純化方法較為單一，多為應用一種或二種層析方法，但純度不理想?；蛘呤菍撕炁c抗菌肽結合，應用親和層析技術進行純化。這種方法純化后需進一步處理，將標簽去除，而且成本相對較高。因此，重組抗菌肽下游技術的優(yōu)化成為其廣泛應用的瓶頸。

發(fā)明內容
針對目前重組抗菌肽的純化方法較為單一，純度不高，而且純化成本相對較高的現(xiàn)狀。本發(fā)明提供了一種重組新疆家蠶抗菌肽的制備方法，并且提供抗菌肽在制備抗感染和抗腫瘤藥物中的應用。
同時，本發(fā)明還提供一種高純度的重組新疆家蠶抗菌肽。
本發(fā)明提供了一種重組新疆家蠶抗菌肽具體的制備方法及獲得高純度的重組新疆家蠶抗菌肽。本發(fā)明將發(fā)酵液離心去除沉淀，100℃水浴20-40min，離心去除沉淀，經過冷凍干燥后，通過離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾層析進行分離純化而獲得。
具體的離子交換層析為，將所收集的發(fā)酵干粉溶于10-100mMNa2HPO4-NaH2PO4pH6.0-9.0緩沖液后上樣到同樣緩沖液平衡了的陰離子交換柱，交換柱長10-160mm，直徑5-20mm，用含1.0-2.0M的NaCl的10-100mM Na2HPO4-NaH2PO4pH6.0-9.0緩沖液梯度洗脫，收集第II、III峰。
具體的疏水作用層析為，離子交換層析得到的活性峰II、III上樣于經用含1.5-2.5M NH4(SO4)2的10-100mM Na2HPO4-NaH2PO4pH6.0-9.0緩沖液平衡的疏水層析柱，柱長10-100mm，直徑5-20mm，用10-100mM Na2HPO4-NaH2PO4pH6.0-9.0緩沖液梯度洗脫，收集第II、III峰。
具體的凝膠過濾層析為，疏水作用層析所獲得的活性峰II、III上樣于Sephadex G-75凝膠過濾柱，凝膠過濾柱長1000mm，直徑20mm，用重蒸水進行洗脫，收集第III峰，為抗菌肽峰。
本發(fā)明還具體提供了一種高純度的重組新疆家蠶抗菌肽，將其編碼所述抗菌肽的基因克隆到載體上，然后進入宿主細胞中表達后，將發(fā)酵液離心去除沉淀，經過冷凍干燥后，通過離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾層析進行分離純化而獲得。
具體的，獲得的重組新疆家蠶抗菌肽屬于殺菌力最強的天蠶素B類(cecropin B)，其所編碼的抗菌肽有63個氨基酸，其中成熟肽為37個氨基酸，前導肽為26個氨基酸，不含半胱氨酸、不具二硫橋；第8位的是苯丙氨酸，又有別于其它的抗菌肽，產生有別于其它抗菌肽的特性，甚至有更高的活性。
其DNA堿基序列ATG AAT TTC GCA AAG ATC CTA TTT TTC GTC TTC GCT CTGGTG CTG GCT TTG AGC ATG ACC AGC GCT GCT CCC GAG CCCAAG TGG AAG ATC TTC AAG AAA ATT GAA AAA ATG GGC AGGAAC ATT CGT GAC GGC ATC GTC AAA GCG GGC CCG GCG ATCGAG GTC CTT GGT TCG GCT AAA GCT ATA GGA AAA TGA其氨基酸序列MNFAKILFFV FALVLALSMT SAAPEPKWKI FKKIEKMGRNIRDGIVKAGP AIEVLGSAKA IGK本發(fā)明也提供了上述純化工藝所獲得的重組新疆家蠶抗菌肽相關的生物學特性。具體為，抗菌肽是一小分子肽，具有熱穩(wěn)定性，可以100℃水浴10min到10h，而重組新疆家蠶抗菌肽在加熱煮沸8h后，抗菌活性仍未變化，表明重組新疆家蠶抗菌肽表現(xiàn)較強的抗菌活性和熱穩(wěn)定性；耐酸、堿特性在pH在3-11的范圍內，重組新疆家蠶抗菌肽的抗菌能力保持不變；同時，重組新疆家蠶抗菌肽在濃度為0-5M的NaCl中仍具有較強的抗菌活性。
同時，本發(fā)明還具體提供了抗菌肽在抗感染和抗腫瘤中的應用，具體的將所獲得的重組新疆家蠶抗菌肽在制備治療病原微生物感染性疾病和腫瘤的藥物中的應用。
本發(fā)明獲得的重組新疆家蠶抗菌肽能顯著抑制其它微生物的生長，所有微生物菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、蘇云金桿菌、普通變形桿菌、化膿放線菌、鏈球菌、布氏桿菌等，表明重組新疆家蠶抗菌肽具有廣譜抗菌的功能。
同時，本發(fā)明獲得的重組新疆家蠶抗菌肽能顯著抑制腫瘤細胞的生長。對Hela、SiHa、MGC、MFC等細胞的生長有顯著的抑制作用。與細胞未經處理的對照組相比，不生成腫瘤或生成的腫瘤明顯小于對照組。進一步證實重組新疆家蠶抗菌肽能體內抑制腫瘤的生長。
目前臨床上所應用的多數(shù)抗菌素沒有抑殺腫瘤的功能，本發(fā)明所述的新疆家蠶抗菌肽在體外具有顯著的抑殺腫瘤的作用，能顯著抑制腫瘤細胞的生長，與文獻所報道的其它來源的具有抑制腫瘤活性的抗菌肽相比，重組家蠶抗菌肽的腫瘤抑制活性高50倍。同時，本發(fā)明所述的新疆家蠶抗菌肽能顯著抑制小鼠體內腫瘤的生長。
另外，從重度宮頸糜爛和宮頸癌患者取樣，分離得到4種微生物。16s rRNA及形態(tài)和生化培養(yǎng)特性，初步鑒定為糞腸球菌、葡萄球菌、桿狀菌、棒狀桿菌等細菌；應用PCR分析，從這4種細菌中擴增出HPV16特異性片段。進一步，本發(fā)明所得的重組新疆抗菌肽能夠優(yōu)選抑制該4種微生物的生長，其MIC分別為0.023μg/ml、0.014μg/ml、0.008μg/ml、0.030μg/ml。
通過實施本發(fā)明具體的技術方案，實現(xiàn)本發(fā)明內容，可以實現(xiàn)所獲得的重組新疆家蠶抗菌肽病原微生物和腫瘤細胞的體外作用結果，具體說明本發(fā)明實現(xiàn)的藥效和潛在的效果1、重組新疆家蠶抗菌肽的抑菌譜重組新疆家蠶抗菌肽具有廣譜抗菌的功能，對微生物具有顯著的抑制作用，所有微生物包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、蘇云金桿菌、普通變形桿菌、化膿放線菌、鏈球菌、布氏桿菌、糞腸球菌、葡萄球菌、桿狀菌、棒狀桿菌等。
2、重組新疆家蠶抗菌肽的最小殺菌濃度(MBC)重組新疆抗菌肽對微生物的最小殺菌濃度明顯低于氨芐青霉素，顯示較強的抗菌能力。重組新疆家蠶抗菌肽對微生物的最小殺菌濃度包括大腸桿菌0.030μg/ml、金黃色葡萄球菌0.007-0.011μg/ml、巨大芽孢桿菌0.010-0.014μg/ml、谷氨酸棒桿菌0.018-0.021μg/ml、蘇云金桿菌0.012-0.016μg/ml、普通變形桿菌0.013-0.017μg/ml、化膿放線菌0.028-0.033μg/ml、鏈球菌0.009-0.011μg/ml、布氏桿菌0.005-0.006μg/ml、糞腸球菌0.020-0.025μg/ml、葡萄球菌0.013-0.015μg/ml、桿狀菌0.005-0.010μg/ml、棒狀桿菌0.028-0.032μg/ml等。
3、重組新疆家蠶抗菌肽抑制腫瘤細胞生長的作用重組新疆家蠶抗菌肽能顯著抑制腫瘤細胞Hela、SiHa、MGC、MFC等細胞的生長。對腫瘤細胞的完全抑制劑量分別為，Hela0.054-0.084μg/ml；SiHa0.058-0.079μg/ml；MGC0.055-0.081μg/ml；MFC0.062-0.078μg/ml。重組新疆家蠶抗菌肽具有較強的腫瘤抑制作用。
4、本發(fā)明所需試劑均為分析純，制備方法為常規(guī)的蛋白質純化技術，操作簡便，所需時間短，成本較低，可直接進行放大生產。


圖1為重組新疆家蠶抗菌肽的離子交換柱層析圖；圖2為重組新疆家蠶抗菌肽的疏水作用層析圖；圖3為重組新疆家蠶抗菌肽Sephadex G-75凝膠過濾層析圖。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。另外，在下述的說明中，如無特別說明，則％皆指重量百分比。
實施例1重組新疆家蠶抗菌肽的制備方法一發(fā)酵液12000rpm，5min離心去除沉淀，100℃水浴30min，12000rpm，10min離心去除沉淀，冷凍干燥后-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 第一步，離子交換層析將上述所收集發(fā)酵干粉40mg溶于10mMNa2HPO4-NaH2PO4pH6.0緩沖液，12000rpm，4℃離心10min，取上清，再用0.45μm的濾膜進行過濾。上樣于10mM Na2HPO4-NaH2PO4pH7.0緩沖液平衡了的Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，交換柱長10mm，直徑5mm，經2.5個柱體積相同的緩沖液洗至穿流峰完全洗脫。用含2.0M的NaCl的10mM Na2HPO4-NaH2PO4pH6.0緩沖液梯度洗脫，收集II、III峰。
第二步，疏水作用層析離子交換層析得到的活性峰II、III上樣于經用含1.5M NH4(SO4)2的10mM Na2HPO4-NaH2PO4pH6.0緩沖液充分平衡了的Phehyl Sepharose HP疏水層析柱，柱長10mm，直徑5mm，經3個柱體積相同的緩沖液洗至穿流峰完全洗脫。用10mMNa2HPO4-NaH2PO4pH6.0緩沖液梯度洗脫，收集第II、III峰；第三步，凝膠過濾層析用2個柱體積的重蒸水平衡Sepadex G-75凝膠過濾柱，凝膠過濾柱長1000mm，直徑20mm。將疏水作用層析所獲得的活性峰II、III上樣于已平衡好了的Sephadex G-75凝膠過濾柱，用重蒸水進行洗脫，收集第III峰，即為抗菌肽峰，即可獲得高純度的重組新疆家蠶抗菌肽。
實施例2重組新疆家蠶抗菌肽的制備方法二發(fā)酵液12000rpm，5min離心去除沉淀，100℃水浴30min，12000rpm，10min離心去除沉淀，冷凍干燥后-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 第一步，離子交換層析將上述所收集發(fā)酵干粉40mg溶于100mMNa2HPO4-NaH2PO4pH9.0緩沖液，12000rpm，4℃離心10min，取上清，再用0.45μm的濾膜進行過濾。上樣于10mM Na2HPO4-NaH2PO4pH7.0緩沖液平衡了的Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，交換柱長160mm，直徑20mm，經2.5個柱體積相同的緩沖液洗至穿流峰完全洗脫。用含2.0M的NaCl的100mM Na2HPO4-NaH2PO4pH9.0緩沖液梯度洗脫，收集II、III峰。
第二步，疏水作用層析離子交換層析得到的活性峰II、III上樣于經用含2.5M NH4(SO4)2的100mM Na2HPO4-NaH2PO4pH9.0緩沖液充分平衡了的Phehyl Sepharose HP疏水層析柱，柱長100mm，直徑20mm，經3個柱體積相同的緩沖液洗至穿流峰完全洗脫。用100mMNa2HPO4-NaH2PO4pH9.0緩沖液梯度洗脫，收集第II、III峰；
第三步，凝膠過濾層析如上述技術步驟，將收集第III峰，即為抗菌肽峰，即可獲得同樣高純度的重組新疆家蠶抗菌肽。
實施例3重組新疆家蠶抗菌肽的制備方法三如上述實施例原料的準備。
第一步，離子交換層析將上述所收集發(fā)酵干粉40mg溶于50mMNa2HPO4-NaH2PO4pH8.0緩沖液，12000rpm，4℃離心10min，取上清，再用0.45μm的濾膜進行過濾。上樣于10mM Na2HPO4-NaH2PO4pH7.0緩沖液平衡了的Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，交換柱長100mm，直徑10mm，經2.5個柱體積相同的緩沖液洗至穿流峰完全洗脫。用含1.5M的NaCl的50mM Na2HPO4-NaH2PO4pH8.5緩沖液梯度洗脫，收集II、III峰。
第二步，疏水作用層析離子交換層析得到的活性峰II、III上樣于經用含2.0M NH4(SO4)2的10mM Na2HPO4-NaH2PO4pH8.5緩沖液充分平衡了的Phehyl Sepharose HP疏水層析柱，柱長50mm，直徑15mm，經3個柱體積相同的緩沖液洗至穿流峰完全洗脫。用80mMNa2HPO4-NaH2PO4pH6.5緩沖液梯度洗脫，收集第II、III峰；第三步，凝膠過濾層析如上述技術步驟，將收集第III峰，即為抗菌肽峰，即可獲得同樣高純度的重組新疆家蠶抗菌肽。
實施例4重組新疆家蠶抗菌肽的制備方法四如上述實施例原料的準備。
第一步，離子交換層析如上述所述具體實驗步驟，將收集發(fā)酵干粉溶于10-100mM Na2HPO4-NaH2PO4pH6.0-9.0緩沖液，12000rpm，經離心，取上清，再用濾膜進行過濾。緩沖液后上樣到同樣緩沖液平衡了的陰離子交換柱，交換柱長10-160mm，直徑5-20mm，用含1.0-2.0M的NaCl的10-100mM Na2HPO4-NaH2PO4pH6.0-9.0緩沖液梯度洗脫，收集第II、III峰。
第二步，疏水作用層析如上述所述具體實驗步驟，離子交換層析得到的活性峰II、III上樣于經用含1.5-2.5M NH4(SO4)2的10-100mMNa2HPO4-NaH2PO4pH6.0-9.0緩沖液平衡的疏水層析柱，柱長10-100mm，直徑5-20mm，用10-100mM Na2HPO4-NaH2PO4pH6.0-9.0緩沖液梯度洗脫，收集第II、III峰。
第三步，凝膠過濾層析如上述技術步驟，將收集第III峰，即為抗菌肽峰，即可獲得同樣高純度的重組新疆家蠶抗菌肽。
實施例5重組新疆家蠶抗菌肽抑制腫瘤細胞生長的作用用無菌重蒸水將所純化的重組新疆家蠶抗菌肽按10倍進行倍比稀釋，共有8個滴度，每個滴度設置3個重復，每孔加樣量100μl，同時設立正常肝細胞HL-7702為對照組。將5×104/ml的MGC細胞或正常肝臟細胞200μl加到96孔細胞培養(yǎng)板中，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。24h后，去除舊DMEM培養(yǎng)基，每孔重新加入新的DMEM培養(yǎng)基100μl，同時將上述不同滴度的樣品以每孔100μl加樣量加入，輕輕混勻后，重新置入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。吸去上清，PBS輕輕洗滌，去除上清。每孔加入80μl新鮮的DMEM培養(yǎng)基，再加入20μl的MTT溶液(5mg/ml)，輕輕振蕩，繼續(xù)培養(yǎng)4h；終止培養(yǎng)，小心吸去孔內的培養(yǎng)基，每孔加入100μl的二甲基亞砜(DMSO)，輕輕振蕩，37℃培養(yǎng)30min，在酶聯(lián)免疫檢測儀的490nm處測定各孔的吸光值。EC50是殺傷50％細胞時的藥物濃度。結果見表1。
表1重組新疆家蠶抗菌肽在體外抑殺腫瘤生長的作用

目前臨床上所應用的多數(shù)抗菌素沒有抑殺腫瘤的功能，從上述表中可以看出，新疆家蠶抗菌肽在體外具有顯著的抑殺腫瘤的作用。
實施例6重組新疆家蠶抗菌肽對病原微生物和腫瘤細胞的體外作用1、重組新疆家蠶抗菌肽的抑菌譜將重組家蠶抗菌肽配成27.4μg/ml的供試樣本。用下述所列的病原菌于LB固體培養(yǎng)基中制成平板，用直徑3mm的打孔器打孔，每孔加樣量為20μl，相當于0.548μg/ml。每種病原菌重復3次。37℃培養(yǎng)18-24h，測量抑菌直徑，結果見表2
表2重組新疆家蠶抗菌肽的抑菌譜

2、重組新疆家蠶抗菌肽的最小殺菌濃度(MBC)本發(fā)明的重組新疆家蠶抗菌肽的最小殺菌濃度采用常用藥物氨芐青霉素為陽性對照，無菌蒸餾水為陰性對照。各試驗用無菌試管3支，并標明藥物濃度和作用時間，參見表3。
表3重組新疆家蠶抗菌肽與氨芐青霉素的最小殺菌濃度的比較

3、重組新疆家蠶抗菌肽抑制腫瘤細胞生長的作用應用無菌重蒸水將所純化獲得的重組新疆家蠶抗菌肽進行10倍倍比稀釋，共有8個滴度，每個滴度設置3個重復，每孔加樣量100μl，同時設立正常肝細胞HL-7702為對照組。將5×104/ml的MGC細胞或正常肝臟細胞200μl加到96孔細胞培養(yǎng)板中，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。24h后用MTT法測定樣品對細胞的殺傷作用。EC50是殺傷50％細胞時的藥物濃度。結果見表4。
表4重組新疆家蠶抗菌肽抑制腫瘤細胞生長的作用

目前臨床上所應用的多數(shù)抗菌素沒有抑殺腫瘤的功能，從上述表中可以看出，新疆家蠶抗菌肽在體外具有顯著的抑殺腫瘤的作用。
重組新疆家蠶抗菌肽能顯著抑制微生物的生長，所有微生物菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、蘇云金桿菌、普通變形桿菌、化膿放線菌、鏈球菌、布氏桿菌、糞腸球菌、葡萄球菌、桿狀菌、棒狀桿菌等。結果表明重組新疆家蠶抗菌肽具有廣譜抗菌的功能。另外，重組新疆家蠶抗菌肽能顯著抑制腫瘤細胞的生長，重組新疆家蠶抗菌肽對MGC細胞的抑制劑量為0.072μg/ml，與文獻所報道的其它來源的具有抑制腫瘤活性的抗菌肽相比，重組家蠶抗菌肽的腫瘤抑制活性高50倍。
權利要求
1.一種重組新疆家蠶抗菌肽的制備方法，其特征在于，將發(fā)酵液離心去除沉淀，100℃水浴20-40min，離心去除沉淀，經過冷凍干燥后，通過離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾層析進行分離純化。
2.如權利要求1所述的重組新疆家蠶抗菌肽的制備方法，具體特征在于(1)、離子交換層析將所收集的重組新疆家蠶抗菌肽發(fā)酵干粉溶于10-100mM Na2HPO4-NaH2PO4pH6.0-9.0緩沖液后上樣到同樣緩沖液平衡了的Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，交換柱長10-160mm，直徑5-20mm，用含1.0-2.0M的NaCl的10-100mMNa2HPO4-NaH2PO4pH6.0-9.0緩沖液梯度洗脫，收集第II、III峰；(2)、疏水作用層析將步驟(1)所獲得的活性峰II、III上樣于經用含1.5-2.5M NH4(SO4)2的10-100mM Na2HPO4-NaH2PO4pH6.0-9.0緩沖液平衡的疏水層析柱，柱長10-100mm，直徑5-20mm，用10-100mMNa2HPO4-NaH2PO4pH6.0-9.0緩沖液梯度洗脫，收集第II、III峰；(3)、凝膠過濾層析將步驟(2)所獲得的活性峰II、III上樣于Sepadex G-75凝膠過濾柱，凝膠過濾柱長1000mm，直徑20mm，用重蒸水進行洗脫，收集第III峰。
3.一種重組新疆家蠶抗菌肽，其特征在于，將編碼所述抗菌肽的基因克隆到載體上，然后進入宿主細胞中表達后，利用權利要求1所述的重組新疆家蠶抗菌肽進行分離純化而獲得。
4.如權利要求3所述重組新疆家蠶抗菌肽，其生物學特性在于，加熱煮沸8h后，抗菌活性仍未變化，重組新疆家蠶抗菌肽具有抗菌活性和熱穩(wěn)定性；在pH在3-11的范圍內，重組新疆家蠶抗菌肽的抗菌能力保持不變；重組新疆家蠶抗菌肽在濃度為0-5M的NaCl中具有抗菌活性。
5.一種如權利要求3所述重組新疆家蠶抗菌肽的序列，其特征在于，該重組新疆家蠶抗菌肽序列中1至63位的氨基酸，該抗菌肽前體有63個氨基酸，其中成熟肽為37個氨基酸，前導肽為26個氨基酸，不含半胱氨酸、不具二硫橋，第8位的是苯丙氨酸。
6.一種如權利要求3所述重組新疆家蠶抗菌肽的應用，其特征在于，所述的重組新疆家蠶抗菌肽在制備治療病原微生物感染性疾病和腫瘤藥物中的應用。
7.如權利要求6所述重組新疆家蠶抗菌肽的應用，其特征在于，重組新疆家蠶抗菌肽具有廣譜抗菌的功能，能抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、蘇云金桿菌、普通變形桿菌、化膿放線菌、鏈球菌、布氏桿菌等微生物的生長。
8.如權利要求6所述重組新疆家蠶抗菌肽的應用，其特征在于，重組新疆家蠶抗菌肽對微生物的最小殺菌濃度MBC包括大腸桿菌0.030μg/ml、金黃色葡萄球菌0.007-0.011μg/ml、巨大芽孢桿菌0.010-0.014μg/ml、谷氨酸棒桿菌0.018-0.021μg/ml、蘇云金桿菌0.012-0.016μg/ml、普通變形桿菌0.013-0.017μg/ml、化膿放線菌0.028-0.033μg/ml、鏈球菌0.009-0.011μg/ml、布氏桿菌0.005-0.006μg/ml、糞腸球菌0.020-0.025μg/ml、葡萄球菌0.013-0.015μg/ml、桿狀菌0.005-0.010μg/ml、棒狀桿菌0.028-0.032μg/ml
9.如權利要求6所述重組新疆家蠶抗菌肽的應用，其特征在于，重組新疆家蠶抗菌肽對腫瘤細胞Hela、SiHa、MGC、MFC生長的完全抑制劑量分別為Hela 0.054-0.084μg/ml、SiHa 0.058-0.079μg/ml、MGC 0.055-0.081μg/ml、MFC 0.062-0.078μg/ml。
10.如權利要求7所述重組新疆家蠶抗菌肽的應用，其特征在于，重組新疆抗菌肽優(yōu)選抑制糞腸球菌、葡萄球菌、桿狀菌、棒狀桿菌4種微生物的生長分別為0.023μg/ml、0.014μg/ml、0.008μg/ml、0.030μg/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開一種重組新疆家蠶抗菌肽的純化制備方法、重組新疆家蠶抗菌肽及其在抑菌、抗腫瘤方面的應用。重組新疆家蠶抗菌肽是從新疆家蠶中克隆得到的，并在真核表達系統(tǒng)中進行了表達。其制備方法為，將發(fā)酵液離心去除沉淀，冷凍干燥后經離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾層析而分離純化得到。重組新疆家蠶抗菌肽對細菌和腫瘤細胞具有強烈的抑殺作用，而且還具有無溶血活性和對正常組織細胞沒有毒性作用，在制備治療病原微生物感染性疾病和腫瘤的藥物中的應用。
文檔編號C12N15/09GK1966709SQ20061014613
公開日2007年5月23日 申請日期2006年11月9日 優(yōu)先權日2006年11月9日
發(fā)明者竇君, 張富春, 劉忠淵, 馬正海, 馬紀 申請人:新疆大學