專利名稱：一種高活力葡萄糖氧化酶的編碼基因及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子酶學(xué)與生物技術(shù)，具體涉及一種高活力葡萄糖氧化酶的編碼基因，同時(shí)涉及該突變株編碼基因的制備方法。該突變基因編碼的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白，可以廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及生物等領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
葡萄糖氧化酶是生物領(lǐng)域中最主要的工具酶之一。目前應(yīng)用中使用的葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)一般都采用黑曲霉和青霉屬菌株作生產(chǎn)菌，進(jìn)行深層通風(fēng)培養(yǎng)的方法制取。我國(guó)和美國(guó)常以點(diǎn)青霉和黃色青霉為生產(chǎn)菌種，日本則篩選出尼崎青霉作為常用菌種。
自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面，將其應(yīng)用于血糖測(cè)定以來(lái)，GOD被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等許多相關(guān)領(lǐng)域。
在食品工業(yè)中，由于氧的存在，引起許多不利于產(chǎn)品質(zhì)量的化學(xué)反應(yīng)，并為許多微生物生長(zhǎng)創(chuàng)造了條件。目前，許多國(guó)家已將GOD作為工人的安全抗氧劑而廣泛應(yīng)用于各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成過(guò)氧化氫、形成葡萄糖酸四個(gè)方面。利用其專一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析儀，能快速準(zhǔn)確簡(jiǎn)易地測(cè)定各種食品中的葡萄糖含量，指導(dǎo)生產(chǎn)[12]。
在醫(yī)藥工業(yè)中，GOD作為試劑盒、酶電極等用于血清(漿)、尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；GOD制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑、牙垢和齲齒的形成防止口腔疾病和牙病的發(fā)生[36]。此外，由于可以催化生成H2O2，還可用于對(duì)H2O2敏感的淋巴瘤的導(dǎo)向目標(biāo)的治療。
GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動(dòng)物腸道環(huán)境，調(diào)節(jié)飼糧消化，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。含葡萄糖氧化酶、乳酸過(guò)氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑，可用于預(yù)防牲畜胃腸道感染、腹瀉，并有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)作用。
由于GOD具有廣泛的實(shí)用價(jià)值，隨著GOD在酵母中外源表達(dá)的成功，也有人利用定向進(jìn)化的手段改造GOD，使酶活提高至原來(lái)的1.5倍，在熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性方面，也得到了性質(zhì)改善的突變株。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白的編碼基因GOD-D401N/A574V，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列以及所述的序列編碼的突變酶，該突變酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。在黑曲霉GOD結(jié)構(gòu)基因中通過(guò)over-lap PCR引入突變，連接于表達(dá)載體，生產(chǎn)高酶活GOD突變酶，該突變酶的酶活是野生型的3倍，同時(shí)也具有良好的熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白的制備方法，該方法是構(gòu)建酵母表達(dá)載體，利用陰離子交換層析方法純化高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白，該方法簡(jiǎn)便，成本低廉。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白及其在食品和醫(yī)藥上的應(yīng)用，即一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白在酒中和茶葉保鮮中的應(yīng)用。。
為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種核苷酸序列，該序列編碼一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其特征在于與野生型相比GOD結(jié)構(gòu)基因上具有1752位的G突變?yōu)锳和2272位的C突變?yōu)門的點(diǎn)突變。由以下步驟制備 1.突變酶GOD-D401N/A574V突變點(diǎn)的引入 (1)設(shè)計(jì)兩對(duì)誘變引物，采用PCR定點(diǎn)突變法在GOD基因上把野生型GOD基因上1752位的G突變?yōu)锳和2272位的C突變?yōu)門； (2)上述PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶SnaBI及NotI進(jìn)行酶切，與經(jīng)過(guò)相同酶切的質(zhì)粒pPIC9k片段連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得大腸桿菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V； 2.鑒定重組質(zhì)粒pPIC9kGOD-D401N/A574V用酶切、PCR方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，并測(cè)序檢驗(yàn)，由此得到具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 本發(fā)明命名所得編碼高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白的編碼基因GOD-D401N/A574V具有如下特征 1.本發(fā)明所用的GOD野生型基因來(lái)自黑曲霉，長(zhǎng)度為2303bp，其中結(jié)構(gòu)基因長(zhǎng)度為1752bp。
2.具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，與野生型相比在此結(jié)構(gòu)基因上具有兩處點(diǎn)突變，即為1752位的G突變?yōu)锳和2272位的C突變?yōu)門。
本發(fā)明的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白可用如下方法生產(chǎn)。該方法包括以下具體的操作按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(第三版)J.薩姆布魯克等編著，2003，北京科學(xué)出版社中所述的條件進(jìn)行。
1.突變酶GOD-D401N/A574V突變點(diǎn)的引入 (1)設(shè)計(jì)兩對(duì)誘變引物，采用PCR定點(diǎn)突變法在GOD基因上把野生型GOD基因上G突變?yōu)锳和2272位的C突變?yōu)門； (2)上述PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶SnaBI及NotI進(jìn)行酶切，與經(jīng)過(guò)相同酶切的質(zhì)粒pPIC9k片段連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得大腸桿菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V； 2.鑒定重組質(zhì)粒pPIC9kGOD-D401N/A574V用酶切、PCR方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，并測(cè)序檢驗(yàn)，由此得到具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 3.培養(yǎng)大腸桿菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V，提取重組質(zhì)粒pPIC9kGOD-D401N/A574V； 4.限制性內(nèi)切酶BglII酶切，膠回收純化大片段，即得到酵母轉(zhuǎn)化所需含突變基因的線性DNA； 5.電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115，得到突變酶GOD-D401N/A574V的生產(chǎn)菌株； 6.將步驟5中所得菌株轉(zhuǎn)入500mL MD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600＝1.2-1.5；離心收集酵母細(xì)胞，并將細(xì)胞用20mL MM培養(yǎng)基洗一次；將細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入250mL MM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)蛋白生成，每天向培養(yǎng)物中補(bǔ)加1％甲醇，培養(yǎng)4-5天；離心收取上清液； 7.將近500mL含有目標(biāo)蛋白的培養(yǎng)物上清液超濾濃縮至20-30mL，濃縮液在0.02mol/L、pH6.27的磷酸二氫鈉緩沖液中透析除鹽24小時(shí)。蛋白質(zhì)的純化采用Q SepharoseTM Fast Flow陰離子交換層析柱分離、純化，由此得到具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白； 8.以新鮮的Sigma公司商品GOD作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用pH5.6、0.1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液配制2mg/mL葡萄糖、0.1mg/mL的ABTS和100U/mL辣根過(guò)氧化物酶溶液。在九十六孔板中分別加入100μL葡萄糖溶液、100μL的ABTS和辣根過(guò)氧化物酶溶液40μL，加入1μl培養(yǎng)液或酶液，測(cè)定OD414。
按照以上方法可以檢驗(yàn)本發(fā)明要求保護(hù)的突變酶的活性。純度檢測(cè)可以用SDS-PAGE方法檢測(cè)。
注以上提到的酵母培養(yǎng)基配方如下 MD(L-1)酵母基本氮源培養(yǎng)基(YNB)1.7g，硫酸銨5g，葡萄糖20g，生物素400μg； MM(L-1)YNB 1.7g，硫酸銨5g，甲醇12mL，生物素400μg，酪蛋白水解物10g，pH5.6。
本發(fā)明獲得高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白在食品、醫(yī)藥及生物等相關(guān)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
1.在pH7.0的條件下，取上述所得葡萄糖氧化酶與辣根過(guò)氧化物酶以及ABTS混合與磷酸緩沖液中，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液或酒類樣品與之反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得酒類中葡萄糖含量。本發(fā)明所保護(hù)的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白的優(yōu)勢(shì)在于其酶活是野生型的3倍以上，可以有效減少酶制劑的使用量。
2.葡萄糖氧化酶在茶葉保鮮中的應(yīng)用將葡萄糖氧化酶與其底物葡萄糖混合在一起，包裝于不透水但透氣的薄膜袋中，密封后置于裝有茶葉的密閉容器內(nèi)，當(dāng)密閉容器內(nèi)的氧氣透過(guò)薄膜進(jìn)入袋中，在葡萄糖氧化酶的作用下，與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)，從而去除密閉容器內(nèi)的氧，防止茶葉被氧化而導(dǎo)致品質(zhì)劣變。
葡萄糖氧化酶是一種廣泛應(yīng)用的工具酶，在食品工業(yè)中主要用于除氧、去葡萄糖；在醫(yī)藥行業(yè)中主要用于血糖、尿糖的測(cè)定；在生物領(lǐng)域中，還可以制成相應(yīng)的生物傳感器和酶電極，用于檢測(cè)葡萄糖濃度。
所述畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9k和畢赤酵母菌株GS115均購(gòu)自invitrogen公司。所述大腸桿菌DH5α購(gòu)自TaKaRa公司?？梢愿鶕?jù)所用的表達(dá)載體選擇匹配的宿主細(xì)胞。所述重組質(zhì)粒pPIC9kGOD-D401N/A574V為本發(fā)明構(gòu)建。所述大腸桿菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V是具有質(zhì)粒pPIC9kGOD-D401N/A574V的大腸桿菌菌株，保藏編號(hào)CCTCC NO M207085，保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2007年6月19日，分類命名大腸桿菌DH5α/GOD-D401N/A574V。所述編碼基因GOD-D401N/A574V是具有SEQUENCE NO.1的核苷酸序列的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白編碼基因。所述蛋白GOD-D401N/A574V是具有SEQUENCE NO.2的氨基酸序列的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果 本發(fā)明中提供的GOD突變株的核苷酸序列和蛋白質(zhì)序列是一種GOD高酶活突變株的基因和蛋白質(zhì)序列，未見(jiàn)報(bào)道。本株GOD突變株酶活是野生型酶活的2倍以上，同時(shí)也具有良好的熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性，符合實(shí)際應(yīng)用的要求。而葡萄糖氧化酶在食品、醫(yī)藥及生物等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，是生物傳感器領(lǐng)域最主要的工具酶，因此，獲得高酶活的GOD，具有很高的實(shí)用價(jià)值，特別是在生物傳感器的分析器件中，要在微小的面積上固定具有足夠催化活性的酶，酶活的高低顯得尤為重要。



圖1重組質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖示意圖 (1)用PCR方法擴(kuò)增出GOD基因； (2)設(shè)計(jì)兩對(duì)誘變引物，采用PCR定點(diǎn)突變法在GOD基因上把野生型GOD分子401位的Asp突變?yōu)锳sn，574位的Ala突變?yōu)閂al； (3)上述PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶SnaBI及NotI進(jìn)行酶切，與經(jīng)過(guò)相同酶切的質(zhì)粒pPIC9k片段連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得大腸桿菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V； 圖2重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9kGOD-D401N/A574V的PCR鑒定(b)和酶切鑒定(a)結(jié)果(1％瓊脂糖凝膠電泳)。
如圖2(b)所示，以上下游引物擴(kuò)增出的條帶大小約為1800bp，與GOD結(jié)構(gòu)基因大小一致。
大腸桿菌-酵母穿梭質(zhì)粒pPIC9k大小約9.3kb，含有兩個(gè)Bgl II酶切位點(diǎn)。而GOD基因內(nèi)部則無(wú)Bgl II酶切位點(diǎn)。將質(zhì)粒pPIC9k-GOD用Bgl II酶切，電泳結(jié)果如圖2(a)中所示，Bgl II酶切pPIC9k-GOD得到2.4kb和8.7kb兩個(gè)片段，與推測(cè)值一致。以上結(jié)果證明高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白編碼基因GOD-D401N/A574V已克隆到酵母表達(dá)載體pPIC9k。
圖3純化后的畢赤酵母菌株pPIC9kGOD-D401N/A574V誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白(10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè))。
葡萄糖氧化酶單體分子量約為80kDa，與結(jié)果相符。
圖4與野生型的熱穩(wěn)定性比較 在40℃中水浴保存50分鐘內(nèi)，野生型和GOD-D401N/A574V酶活都沒(méi)有明顯損失，60分鐘時(shí)野生型酶活略有下降，而GOD-D401N/A574V的酶活沒(méi)有明顯下降。在50℃中1小時(shí)后，突變株GOD-D401N/A574V酶活降至原來(lái)的78％左右，而野生型酶活則降至原來(lái)的72％，兩者相近。60℃下10分鐘后，野生型和GOD-D401N/A574V酶活均大幅下降，一小時(shí)后，野生型降至原來(lái)的30％，GOD-D401N/A574V降至原有的20％左右。高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-D401N/A574V具有良好的熱穩(wěn)定性，能夠滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。
圖5與野生型的儲(chǔ)存穩(wěn)定性比較 在4℃下，野生型和GOD-D401N/A574V具有較好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，保存一個(gè)月后仍保留80％以上的催化活性，但30天后野生型活力下降速度加快，到40天時(shí)野生型有60％活力剩余，而GOD-D401N/A574V仍有80％活力剩余。在室溫(20-25℃)下長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存時(shí)，野生型和GOD-D401N/A574V的酶活都呈現(xiàn)逐步下降趨勢(shì)。在保存的前25天，GOD-D401N/A574V酶活的下降略高于野生型酶。但在儲(chǔ)存后期，野生型酶活的下降更加明顯。在室溫下儲(chǔ)存一個(gè)月后，野生型和GOD-D401N/A574V都可保留65％以上的剩余活力，40天后，野生型僅40％活力剩余，而GOD-D401N/A574V仍然有60％活力剩余。
高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-D401N/A574V與野生型相比具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，能夠滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，按常規(guī)條件進(jìn)行，參考如薩姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版，1992年，科學(xué)出版社)中所述實(shí)驗(yàn)方法。
實(shí)施例1.高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白的獲得 圖1顯示了重組突變葡萄糖氧化酶基因的構(gòu)建原理和過(guò)程。天然的成熟的葡萄糖氧化酶為同源二聚體，每個(gè)單體含583個(gè)氨基酸，基因長(zhǎng)為1752bp左右。
1.突變酶GOD-D401N/A574V編碼基因中突變點(diǎn)的引入 (1)設(shè)計(jì)兩對(duì)誘變引物，采用PCR定點(diǎn)突變法在GOD基因上把野生型GOD基因上1752位的G突變?yōu)锳和2272位的C突變?yōu)門； 設(shè)計(jì)葡萄糖氧化酶定點(diǎn)突變所需引物序列 上游引物5’-CCACTACGTAAGCAATGGCATTGAAG-3’ 下游引物5’-TATGCGGCCGCTCACTGCAT-3’ 定點(diǎn)突變引物 401s5′-AGAACTACCGCAACTGGATT-3′ 401a5′-CAATCCAGTTGCGGTAGTTC-3′ 574s5′TTTCGGATGTTATCTTGG 3′ 574a5′CCAAGATAACATCCGAAAT 3′ 先用上游引物與引物574a以連接有野生型葡萄糖氧化酶基因的pPIC9kGOD為模板，擴(kuò)增出574的長(zhǎng)片段，PCR循環(huán)條件94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。
用通用引物3’AOX1與574s以野生型葡萄糖氧化酶基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增出574的短片段，PCR循環(huán)條件94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃20sec，30個(gè)循環(huán)；72℃5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。
然后將回收的兩種PCR產(chǎn)物混合，加入上、下游引物進(jìn)行第二次PCR，PCR反應(yīng)條件為94℃5min；94℃1min，60℃1min，72℃2min，5個(gè)循環(huán)；94℃1min，54℃1min，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。得到含有突變位點(diǎn)A574V的葡萄糖氧化酶基因片段。
再用上游引物與引物574a以含有突變位點(diǎn)A574V的葡萄糖氧化酶基因片段為模板，擴(kuò)增出401的長(zhǎng)片段，PCR循環(huán)條件94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min45sec，30個(gè)循環(huán)；72℃7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。
用下游引物與401s以含有突變位點(diǎn)A574V的葡萄糖氧化酶基因片段為模板，擴(kuò)增出401的短片段，PCR循環(huán)條件94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃20sec，30個(gè)循環(huán)；72℃5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。
然后將回收的兩種PCR產(chǎn)物混合，加入上、下游引物進(jìn)行第二次PCR，PCR反應(yīng)條件為94℃5min；94℃1min，60℃1min，72℃2min，5個(gè)循環(huán)；94℃1min，54℃1min，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。得到含有突變位點(diǎn)D401N/A574V的葡萄糖氧化酶基因片段。
(2)上述PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶SnaBI及NotI進(jìn)行分步酶切，酶切產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收后，用T4連接酶與經(jīng)過(guò)相同酶切的質(zhì)粒pPIC9k片段連接，16℃連接過(guò)夜后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素(Amp)-LB平板篩選得到陽(yáng)性菌落，經(jīng)過(guò)鑒定(見(jiàn)下一步驟)，命名為大腸桿菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V。
2.質(zhì)粒pPIC9kGOD-D401N/A574V的鑒定 用質(zhì)粒抽提試劑盒從陽(yáng)性菌落DH5α/GOD-D401N/A574V培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒pPIC9kGOD-D401N/A574V，用限制性內(nèi)切酶BglII進(jìn)行酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳檢查，結(jié)果產(chǎn)生2.4Kb和8.7Kb兩條帶(如圖2a)，與預(yù)期大小相符。進(jìn)一步用PCR進(jìn)行鑒定，以重組質(zhì)粒為模板，用上、下游引物進(jìn)行PCR，可以得到大小為1.8kb的擴(kuò)增帶(如圖2b)，與預(yù)期大小相符。
質(zhì)粒上GOD-D401N/A574V基因的測(cè)序由英俊(invitrogen)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。測(cè)序引物是利用pPIC9k質(zhì)粒上的通用引物5’AOX1和3’AOX1，測(cè)序結(jié)果表明獲得的GOD-D401N/A574V基因序列與預(yù)期設(shè)計(jì)完全一致，由此得到SEQUENCE NO.1所示的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白編碼基因GOD-D401N/A574V，GOD-D401N/A574V基因全長(zhǎng)1752nt(包括終止密碼TGA)，編碼583個(gè)氨基酸的蛋白。將產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pPIC9kGOD-D401N/A574V。
3.重組質(zhì)粒pPIC9kGOD-D401N/A574V的提取 將DH5α/GOD-D401N/A574V接種到LB培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒pPIC9kGOD-D401N/A574V。
4.限制性內(nèi)切酶BglII酶切，膠回收純化大片段，即得到酵母轉(zhuǎn)化所需含突變基因的線性DNA。
5.電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115，經(jīng)篩選和鑒定獲得畢赤酵母菌株GS115/GOD-D401N/A574V。
(1)GS115感受態(tài)細(xì)胞的制備 將GS115接于50mL液體YPD培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)過(guò)夜，再以2∶100的比例接種于500mlYPD中30℃培養(yǎng)至OD600＝1.2-1.5，4℃1500g離心收集細(xì)胞；用500mL冰冷的無(wú)菌水重懸細(xì)胞，4℃1500g離心收集細(xì)胞；再用250mL冰冷的無(wú)菌水重懸細(xì)胞，4℃1500g離心收集細(xì)胞；接著用40ml冰冷的1mol/L山梨醇重懸細(xì)胞，4℃1500g離心收集細(xì)胞；重懸細(xì)胞于1mL1mol/L山梨醇。
(2)重組質(zhì)粒pPIC9kGOD-D401N/A574V轉(zhuǎn)化GS115 100μL原生質(zhì)體與5-10μg線性化質(zhì)粒DNA(BglII切)混合，轉(zhuǎn)入冰冷的電轉(zhuǎn)杯，放置5分鐘；電擊細(xì)胞與DNA的混合物(1.5kv，4.2-4.9ms)；加入1mL冰冷的1mol/L山梨醇，繼續(xù)放置30min；再加入0.5mLSOS(0.3×YPD，1mol/L山梨醇)，30℃放置2小時(shí)，偶爾搖動(dòng)志菌體不易沉淀；用1mol/L山梨醇稀釋菌體后涂布于固體MD培養(yǎng)基。30℃培養(yǎng)4-6天后挑取陽(yáng)性菌落。經(jīng)過(guò)實(shí)施例3鑒定，將能產(chǎn)生GOD-D401N/A574V蛋白的菌株命名為GS115/GOD-D401N/A574V。
6.畢赤酵母菌株GS115/GOD-D401N/A574V經(jīng)甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)生GOD-D401N/A574V蛋白 從上述MD平板中挑取GS115/GOD-D401N/A574V單菌落于20mL MD培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜；將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入500mL MD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600＝1.2-1.5；離心收集酵母細(xì)胞，并將細(xì)胞用20mL MM培養(yǎng)基洗一次；將細(xì)胞轉(zhuǎn)入250mL MM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)蛋白生成，每天向培養(yǎng)物中補(bǔ)加1％甲醇，培養(yǎng)4-5天；離心收取上清液。
7.高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-D401N/A574V純化 將近500mL含有目標(biāo)蛋白的培養(yǎng)物上清液超濾濃縮至20-30mL，濃縮液在0.02mol/L、pH6.27的磷酸二氫鈉緩沖液中透析除鹽24小時(shí)，以保證陰離子交換柱的吸附性質(zhì)。
蛋白質(zhì)的純化采用Q SepharoseTM Fast Flow陰離子交換層析柱，柱子用20mM磷酸二氫鈉(pH6.3)平衡，上樣后，用20mM磷酸二氫鈉，0-0.2MNaCl(pH6.3)梯度洗脫，用核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀(波長(zhǎng)280nm)監(jiān)視收集，葡萄糖氧化酶最先直接從柱中流出(帶黃色)。由此得到分離純化的如SEQUENCENO.2所示的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-D401N/A574V。
實(shí)施例2畢赤酵母菌株GS115/GOD-D401N/A574V表達(dá)的GOD-D401N/A574V蛋白的活性檢測(cè)以及其他酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè) 以新鮮的Sigma公司商品GOD作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用pH5.6、0.1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液配制2mg/mL葡萄糖、0.1mg/mL的ABTS和100U/mL辣根過(guò)氧化物酶溶液。在九十六孔板中分別加入100μL葡萄糖溶液、100μL的ABTS和辣根過(guò)氧化物酶溶液40μL，加入1μL培養(yǎng)液或酶液，反應(yīng)3-5分鐘后測(cè)定OD414。
用Bio-Rad公司生產(chǎn)的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
計(jì)算酶比活
由上表可知，高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-D401N/A574V酶活力是野生型的3倍，在酶活方面，有大幅提高。
熱穩(wěn)定性分析 催化活性提高的突變體有時(shí)會(huì)伴隨熱穩(wěn)定性的降低，將野生型和突變株酶液分別置于40℃、50℃、60℃下，每隔十分鐘取樣在室溫下測(cè)定剩余酶活，評(píng)價(jià)了酶的熱穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)圖四。在40℃中水浴保存50分鐘內(nèi)，野生型和GOD-D401N/A574V酶活都沒(méi)有明顯損失，60分鐘時(shí)野生型酶活略有下降，而GOD-D401N/A574V的酶活沒(méi)有明顯下降。在50℃中1小時(shí)后，突變株GOD-D401N/A574V酶活降至原來(lái)的78％左右，而野生型酶活則降至原來(lái)的72％，兩者相近。60℃下10分鐘后，野生型和GOD-D401N/A574V酶活均大幅下降，一小時(shí)后，野生型降至原來(lái)的30％，GOD-D401N/A574V降至原有的20％左右。高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-D401N/A574V具有良好的熱穩(wěn)定性，能夠滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。
儲(chǔ)存穩(wěn)定性分析 將酶液保存在4℃和室溫(20-25℃)下，定期(每隔3-4天)取樣測(cè)定酶活，評(píng)價(jià)了酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)圖五。
在4℃下，野生型和GOD-D401N/A574V具有較好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，保存一個(gè)月后仍保留80％以上的催化活性，但30天后野生型活力下降速度加快，到40天時(shí)野生型有60％活力剩余，而GOD-D401N/A574V仍有80％活力剩余。在室溫(20-25℃)下長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存時(shí)，野生型和GOD-D401N/A574V的酶活都呈現(xiàn)逐步下降趨勢(shì)。在保存的前25天，GOD-D401N/A574V酶活的下降略高于野生型酶。但在儲(chǔ)存后期，野生型酶活的下降更加明顯。在室溫下儲(chǔ)存一個(gè)月后，野生型和GOD-D401N/A574V都可保留65％以上的剩余活力，40天后，野生型僅40％活力剩余，而GOD-D401N/A574V仍然有60％活力剩余。
高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-D401N/A574V與野生型相比具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，能夠滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。
GOD-D401N/A574V在酶活提高的同時(shí)，仍然具有良好的熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性，能夠滿足實(shí)際應(yīng)用的要求。
實(shí)施例3葡萄糖氧化酶在酶法測(cè)定酒中葡萄糖含量中的應(yīng)用 在pH7.0的條件下，取上述所得葡萄糖氧化酶與辣根過(guò)氧化物酶以及ABTS混合與磷酸鈉緩沖液(0.1mol/L)中，其中葡萄糖氧化酶終濃度為10U/mL，辣根過(guò)氧化物酶終濃度為10U/mL，ABTS終濃度為0.1mg/mL。
取上述混合液3mL，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液或酒類樣品0.5mL與之37℃水浴反應(yīng)10min，測(cè)定其在414nm處的吸收。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得酒類(白酒、紅酒、啤酒)中葡萄糖含量。本發(fā)明在含葡萄糖150mg/L以內(nèi)，吸光度與樣品葡萄糖含量具有良好的正相關(guān)性。故測(cè)定范圍在0-150mg/L。
實(shí)施例4葡萄糖氧化酶在茶葉保鮮中的應(yīng)用 將葡萄糖氧化酶與其底物葡萄糖以摩爾比1∶100000的比例混合在一起，包裝于不透水但透氣的薄膜袋中，密封后置于裝有茶葉的密閉容器內(nèi)，加入量為每升6-8g混合物，當(dāng)密閉容器內(nèi)的氧氣透過(guò)薄膜進(jìn)入袋中，在葡萄糖氧化酶的作用下，與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)，從而去除密閉容器內(nèi)的氧，防止茶葉被氧化而導(dǎo)致品質(zhì)劣變，茶葉的保質(zhì)期延長(zhǎng)至18-24個(gè)月。。
葡萄糖氧化酶是一種廣泛應(yīng)用的工具酶，在食品工業(yè)中主要用于除氧、去葡萄糖；在醫(yī)藥行業(yè)中主要用于血糖、尿糖的測(cè)定；在生物領(lǐng)域中，還可以制成相應(yīng)的生物傳感器和酶電極，用于檢測(cè)葡萄糖濃度。
SEQUENCE LISTING
<110>中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所
<120>一種高活力葡萄糖氧化酶的編碼基因及制備方法和應(yīng)用
<130>一種高活力葡萄糖氧化酶的編碼基因及制備方法和應(yīng)用
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2303
<212>DNA
<213>Aspergillus niger
<400>1
gaattcggta ttctcggcat ggccaaagtc ggtatccctt ggcgccacga tgatttgcgt 60
ccaggattcg tatagttcct cgtccacgag ctgcctaccg tcagcgtgag gcagtgagct 120
aatatggggc caataagcca ctacgaggat gacatggcct ctacagaacg agagacgcag 180
aggatcagga cgccaatcct gcgctccacc tgtctaagga ttcgcttttg gactatccag 240
ggattatggc ttcggattat tgtattcggg ataccgacgg ctgagcacac ggaggatgag 300
gttcagctca cggcccctat cagtatgcat tatgaggatg gcttcttgga aagcagagga 360
attggattat cgaacaagtt ggttctggac cattgactcg agcgtataag taacctcgtt 420
cggtcctcct gtcaccttct gatcagcaac cagcctttcc tctctcattc cctcatctgc 480
ccatcatgca gactctcctt gtgagctcgc ttgtggtctc cctcgctgcg gccctgccac 540
actacatcag gagcaatggc attgaagcca gcctcctgac tgatcccaag gatgtctccg 600
gccgcacggt cgactacatc atcgctggtg gaggtctgac tggactcacc accgctgctc 660
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acaccggcga tgactattct cccatcgtca aggctctcat gagcgctgtc gaagaccggg1140
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aagattatgc ttccatgcag tga2303
<210>2
<211>583
<212>PRT
<213>Aspergillus niger
<400>2
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser
1 5 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp
195 200205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser
325330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu
355360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385390 395 400
Asn Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ser Asp Val Ile Leu
565 570575
Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
權(quán)利要求
1.一種分離的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白編碼基因，其序列為SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。
2.一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3.一種大腸桿菌，其特征在于大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α/GOD-D401N/A574V，CCTCC NO.M207085。
4.一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白在酒中的應(yīng)用。
5.一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白在茶葉保鮮中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高活力葡萄糖氧化酶突變體編碼基因及制備方法和應(yīng)用。這種高活力葡萄糖氧化酶突變體的編碼基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其編碼的蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其步驟是首先設(shè)計(jì)兩對(duì)誘變引物；第二是獲得大腸桿菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V；第三是鑒定重組質(zhì)粒pPIC9kGOD-D401N/A574V；第四是培養(yǎng)大腸桿菌菌株DH5α/GOD--D401N/A574V；第五是得到含突變基因的線性DNA；第六是獲得畢赤酵母菌株GS115/GOD-D401N/A574V；第七是誘導(dǎo)純化獲得目的蛋白。本發(fā)明方法易行，成本低廉，高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白在食品糖類檢測(cè)和保鮮中的應(yīng)用，具有很高的實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/53GK101348794SQ20071005278
公開(kāi)日2009年1月21日 申請(qǐng)日期2007年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月19日
發(fā)明者周亞鳳, 張先恩, 丹 劉, 郭永超, 張治平 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所