專利名稱：：一種充氣培養(yǎng)單細胞藻類的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藻類的培養(yǎng)，具體地說是一種充氣培養(yǎng)單細胞藻類的方法。
背景技術(shù)：
：單細胞藻類是貝類育苗幼體培育過程中的主要餌料，是決定貝類育苗的關(guān)鍵因素之一。但是在貝類育苗中常常出現(xiàn)餌料供不足、不及時以及生產(chǎn)池餌料污染嚴重，藻種又不能及時供應等情況，從而造成餌料生長高峰期和幼體需求不協(xié)調(diào)的現(xiàn)象。生產(chǎn)上采用的單細胞藻培養(yǎng)方法一般包括一下幾個環(huán)節(jié)保種，一級培養(yǎng)，二級培養(yǎng)，三級培養(yǎng)(大池培養(yǎng))。傳統(tǒng)的一級和二級培養(yǎng)通常在泡沫薄膜袋、50L塑料桶和小型水泥池培養(yǎng)，培養(yǎng)速度慢，并且很容易污染。一般認為，充氣培養(yǎng)能使藻細胞和培養(yǎng)環(huán)境充分接觸，從而增加藻細胞的生長速度，但因為充氣容易使培養(yǎng)環(huán)境受到污染，也同時加大了管理的難度，因此也具有一定風險性，有些生產(chǎn)單位采取傳統(tǒng)的充氣培養(yǎng)法，因為管理不善、操作不規(guī)范等原因往往引起藻種全部污染，導致貝類幼體餌料嚴重短缺，甚至使育苗失敗。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)多年積累的經(jīng)驗，申請人對二級培養(yǎng)的方法進行了改進，經(jīng)過幾年的生產(chǎn)實驗驗證，本發(fā)明的目的在于提供一種具有操作方便、藻類生長穩(wěn)定快速、無污染的充氣培養(yǎng)單細胞藻類方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為；一種充氣培養(yǎng)單細胞藻類的方法，在溫度18-35。C和自然光照(光照范圍為3500-330001ux)條件，于裝滿沙濾自然海水的培養(yǎng)瓶中進行單細胞藻的充氣培養(yǎng)，充氣量為4-8L/min，所述培養(yǎng)瓶為透明塑料瓶，培養(yǎng)瓶瓶口上塞有用于密封的橡膠塞，在橡膠塞上鉆有兩個直徑為0.8-lcm的小孔，每個小孔插入一段8-10cm長、粗細與小孔孔徑一致的玻璃管；其中一個小孔插入一段8-10cm長、粗細與小孔孔徑一致的玻璃管；玻璃管用于通風，其上面塞有消毒處理的脫脂棉以防止灰塵污染；另一個小孔內(nèi)穿套有充氣管，其于培養(yǎng)瓶瓶體內(nèi)的一端與散氣石相連，瓶體外的一端通過氣排經(jīng)2-3個空氣過濾器與充氣泵或鼓風機相連；用充氣泵或鼓風機充入空氣，空氣先經(jīng)空氣過濾器過濾，然后通過氣排分散到培養(yǎng)瓶中進行用于貝類育苗餌料單細胞藻類的一級或二級大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)。所述單細胞藻類為貝類育苗中的常用種類，其可為硅藻(新月菱形藻，三角褐指藻)、金藻(等鞭金藻3011，3012和叉鞭金藻)和/或扁藻(青島大扁藻)，本發(fā)明可用于它們的高密度、大規(guī)模培養(yǎng)。本發(fā)明對培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，可于每升沙濾、消毒的自然海水中添加有l(wèi)ml培養(yǎng)母液，所述優(yōu)化后的母液營養(yǎng)鹽基礎(chǔ)配方為Na2N03120g，KH2P044g;將營養(yǎng)鹽溶于1000ml蒸餾水中，配置成母液備用，使用時每升培養(yǎng)液加lml母液；當單細胞藻類為硅藻時，母液營養(yǎng)鹽基礎(chǔ)配方中還添加有Na2Si035g，F(xiàn)eC5H5072.5g;當單細胞藻類為扁藻時，母液營養(yǎng)鹽基礎(chǔ)配方中還添加有FeC5H5070.5g;當單細胞藻類為金藻時，母液營養(yǎng)鹽基礎(chǔ)配方中還添加有維生素B,100mg，維生素B^0.5mg。所述培養(yǎng)瓶為市面上常用的18.9L的透明塑料純凈水瓶;在進行單細胞藻的充氣培養(yǎng)前，于培養(yǎng)瓶中加滿過濾海水，再加入次氯酸或次氯酸鈉消毒液消毒，使培養(yǎng)瓶中有效氯含量達到4080x106。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1)生長快。本發(fā)明方法能顯著提高單細胞藻類的生長速率，用該方法培養(yǎng)的新月菱形藻、金藻30U、3012和扁藻的特定生長率分別是對照組的1.4，1.8，1.4和1.7倍；相對生長率分別是對照組的3.4，10.3，5.0和7.2倍；絕對生長率分別是對照最的3.3，9.8，4.9和6.8倍。2)密度大。本發(fā)明能大幅度提高藻液的培養(yǎng)濃度，新月菱形藻、金藻3011、3012和扁藻的最大培養(yǎng)密度分別為2957，1700，2355和350萬cell/ml，遠遠大于常規(guī)培養(yǎng)方法的培養(yǎng)密度。3)持續(xù)時間長。本發(fā)明能延長藻細胞的生長期，新月菱形藻、金藻3011、3012和扁藻藻細胞密度高峰期分別推遲3天，3天，0天和6天，維持較高密度的時間分別達到14，14，17和17天。4)省時省力。傳統(tǒng)的方法要求每天至少早、中和晚上有求搖瓶3次。而本發(fā)明的方法僅需定期檢査藻細胞的生長情況，不需要搖瓶。5)節(jié)省空間。和傳統(tǒng)采用水泥池、25L的聚乙烯桶等二級培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明方法具有占地面積小，靈活方便等優(yōu)點。6)節(jié)約成本。本發(fā)明方法采用18.9L透明礦泉水瓶作為培養(yǎng)容器，其造價比同等規(guī)格的玻璃器皿價格低，且操作方便，重復利用性強。圖1為本發(fā)明充氣培養(yǎng)單細胞藻系統(tǒng)工藝框圖；—代表海水流向，G代表空氣流向；圖2為本發(fā)明充氣培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)示意圖；圖中，l為充氣泵，2為空氣過濾器，3為主管道，4為總閥門，5為流量控制閥門，6為氣排，7為脫脂棉，8為玻璃管，9為橡膠塞，IO為培養(yǎng)瓶，ll為充氣軟管，12為充氣石；圖3為培養(yǎng)期間的溫度和光照條件變化情況圖4不同處理4種佴料單胞藻的生長曲線；圖5用充氣培養(yǎng)的二級藻種進行大池生產(chǎn)效果。具體實施方式實施例采用本發(fā)明的方法與常規(guī)方法(對照組)分別進行培養(yǎng)。(一)實驗方法1.1實驗材料實驗于2007年3月1日一5月30日在紅島蛤原良種發(fā)展有限公司進行。選用實驗用小新月菱形藻7V/te^/7/ac/wten'Mm(以下簡稱硅藻)，等鞭金藻3011/soc/2o^s(以下簡稱3011)，等鞭金藻3012(以下簡稱3012)和亞心型扁藻P/a(yww20^M6cor^/bm^(以下簡稱扁藻)為實驗對象。1.2充氣和培養(yǎng)裝置用小型充氣泵或鼓風機充氣，充氣管先通過3個空氣過濾器，然后通過氣排分散到培養(yǎng)瓶(如圖1和2示)。采用18.9L的透明塑料純凈水瓶作為一級或二級培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶用相應型號的橡膠塞密封，在每個橡膠塞上鉆兩個直徑為0.8-lcm的孔，其中一個小孔插入一段10cm長，粗細與孔徑一致的玻璃管，用于通風，上面加少許消毒處理的脫脂棉以防止灰塵污染。另一個小孔穿充氣管，進行充氣培養(yǎng)。1.3培養(yǎng)方法培養(yǎng)瓶、充氣設(shè)備和其他培養(yǎng)工具先用稀鹽酸戲刷，再經(jīng)海水沖洗2-3次備用。培養(yǎng)瓶加滿過濾海水，加入100ml次氯酸消毒液，使有效氯含量達到4080xl06，充氣混勻，使多余的水溢出剛好消毒培養(yǎng)瓶表面，用消毒的橡膠塞塞緊。消毒12-18h后，第二天清晨向培養(yǎng)瓶中加入等濃度的Na2S203中和，經(jīng)淀粉碘化鉀試劑滴定為無色后，可以加入營養(yǎng)鹽。營養(yǎng)鹽配方基礎(chǔ)配方為Na2N03120g，KH2P044g;硅藻培養(yǎng)增加Na2Si035g，F(xiàn)eC5H5072.5g，扁藻培養(yǎng)增加FeC5H5070.5g，金藻培養(yǎng)增加維生素B,100mg，維生素B^0.5mg。上述營養(yǎng)鹽溶于1000ml蒸餾水中，配置成母液備用，使用時每升培養(yǎng)液加lml母液。接種選擇藻液顏色正常，鏡檢藻細胞形狀規(guī)則、分裂正常、無污染，處于指數(shù)生長期的藻種，按照1:5-10的比例(接種藻液和過濾、消毒海水的體積比例)一次性接種，使培養(yǎng)液體積占培養(yǎng)瓶體積的4/5。在自然溫度和光照下培養(yǎng)，每天上午10:OO時和下午15:30測定溫度和光照，培養(yǎng)期間的變化情況見圖3，溫度和光照為每天兩次測量的平均值，變化范圍為18.6-33.8°C，平均25.8。C;光照范圍為3785-325001ux，平均170621ux。培養(yǎng)用水與育苗用水相同，是經(jīng)過沙濾的自然海水。充氣量為4-8L/min。常規(guī)的傳統(tǒng)方法(對照組)采用的培養(yǎng)裝置和條件與上述本發(fā)明方法相同，只是不充氣(即不向培養(yǎng)瓶充入空氣)，每天搖瓶3-5次；本發(fā)明的方法和傳統(tǒng)的方法培養(yǎng)幾種餌料單胞藻的生長曲線如圖4所示?？梢钥闯鰩追N餌料微藻在兩種培養(yǎng)模式下生長速度差異顯著。硅藻的生長曲線如圖4A所示。硅藻在生長速率在第5天開始出現(xiàn)差異(F=11.860，P=0.014<0.05)，不同培養(yǎng)模式的特點生長率(SGR)、相對生長率(RGR)和絕對生長率(AGR)分別為56.63，51.50、16.0，12.1和16.97，13.13(表1)。8天后出現(xiàn)顯著差異(F=592.206，P=0.000<0.01)，傳統(tǒng)搖瓶法的培養(yǎng)密度(對照組，下同)為635萬cell/ml，而采用本發(fā)明的方法(實驗組，下同)的藻細胞密度為1670萬cell/ml，是對照組的2.63倍，SGR，RGR和AGR分別是對照組的1.33，2.76禾B2.67倍。對照組在第ll天達到最大值，藻細胞密度為930萬cdl/ml，然后開始下降，而實驗組藻細胞仍在指數(shù)增長期，到第14天達到最大值2957萬cell/ml，RGR和AGR都達到最大值，此時對照組已經(jīng)達到終止期，藻細胞密度已經(jīng)有所下降。金藻3011的生長曲線如圖4B所示。培養(yǎng)第2天實驗組和對照組藻細胞就出現(xiàn)顯著差異(PO.05)，第5天以后差異均為極顯著(PO.01)。對照組藻密度在第11天時達到最大值為262萬cell/ml，實驗組藻細胞密度推遲3天，在第14天達到最大值為1700萬cell/ml，此時SGR，RGR和AGR分別為對照組的1.8，10.8和9.8倍?？梢?，增長效果非常明顯。實驗組和對照組金藻3012的生長曲線(圖4C)與3011略有不同。在培養(yǎng)5天內(nèi)兩個處理組差異不顯著(F=0.027，P=0.875>0.05)，培養(yǎng)8天后出現(xiàn)極顯著差異(PO.Ol)。對照組和實驗組藻細胞數(shù)量都是在第11天時達到最大值，分別為575和2355萬cell/ml，以后對照組出現(xiàn)明顯的下降，而實驗組基本保持不變，實驗結(jié)束時藻細胞密度為2275萬cell/ml，SGR，RGR和AGR分別為對照組的1.6，7.9和7.0倍。實驗組和對照組扁藻的生長曲線如圖4D所示。培養(yǎng)到第5天后兩者開始顯著差異(PO.01)，對照組在第11天藻細胞數(shù)量達到最大值為70萬cell/ml，實驗組高峰期推遲6天，在第17天時達到最大值為350萬cell/ml，此時SGR，RGR和AGR分別為對照組的1.7，7.2和6.8倍。用充氣培養(yǎng)的一、二級藻種進行大池生產(chǎn)效果如圖4所示。采用一次性接種的方法，接種6桶(18.9L，藻細胞密度為3000萬cell/ml)到事先處理好的6m3的消毒海水中，初始密度為55萬cell/ml;3011和3012接種4桶(藻細胞密度為1500萬cell/ml左右)，初始濃度分別為18和21萬cell/ml。幾種藻類生產(chǎn)效果如圖5所示，硅藻的細胞數(shù)量在4天時達到175萬cell/ml，接近生產(chǎn)投喂的餌料濃度，第7天達到最大值470萬cell/ml，最佳投喂時間為第5-10天，藻細胞密度超過300萬cell/ml。兩種金藻的生長相對緩慢，但也在第6天左右達到較適宜的投喂密度200萬cell/ml，最佳投喂時間為第6-ll天，持續(xù)時間6天。表1用兩種方法培養(yǎng)的4種餌料單胞藻生長情況的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>綜上所述，本發(fā)明能大幅度提高4種餌料單胞藻的生長速度。實驗組(本發(fā)明方法)與對照組(不充氣)在細胞數(shù)目、特定生長率(SGR)、相對生長率(RGR)和絕對生長率(AGR)等方面均有顯著差異。在充氣條件下，新月菱形藻、金藻30U、3012和扁藻的最大培養(yǎng)密度分別為2957，1700，2355和350萬cell/ml，分別是對照組最大培養(yǎng)密度的3.2，6.5，4.1和5倍；SGR、RGR和AGR分別是對照組(相同培養(yǎng)時間)的1.4、3.4、3.3，1.8、10.3、9.8，1.4、5.0、4.9和1.7、7.2、6.8倍。二級充氣培養(yǎng)的藻液可以直接擴種到大池進行生產(chǎn)培養(yǎng)，能顯著提高生產(chǎn)培養(yǎng)效率，用這種方法培養(yǎng)的上述餌料藻類用于櫛孔扇貝的春季人工育苗取得了較好的效果。權(quán)利要求1.一種充氣培養(yǎng)單細胞藻類的方法，其特征在于在溫度18-35℃和自然光照條件下，于裝滿沙濾自然海水的培養(yǎng)瓶中進行單細胞藻的充氣培養(yǎng)，充氣量為4-8L/min，所述培養(yǎng)瓶為透明塑料瓶，培養(yǎng)瓶瓶口上塞有用于密封的橡膠塞，在橡膠塞上鉆有兩個直徑為0.8-1cm的小孔，其中一個小孔插入一段8-10cm長、粗細與小孔孔徑一致的玻璃管；玻璃管用于通風，其上面塞有消毒處理的脫脂棉以防止灰塵污染；另一個小孔內(nèi)穿套有充氣管，其于培養(yǎng)瓶瓶體內(nèi)的一端與散氣石相連，瓶體外的一端通過氣排經(jīng)2-3個空氣過濾器與充氣泵或鼓風機相連；用充氣泵或鼓風機充入空氣，空氣先經(jīng)2-3個空氣過濾器進行過濾，然后通過氣排分散到透明塑料培養(yǎng)瓶中進行用于貝類育苗餌料單細胞藻類的一級或二級大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)。2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述單細胞藻類為貝類育苗中的常用種類，其可為硅藻、金藻和/或扁藻。3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述每升沙濾、消毒的自然海水中含有l(wèi)ml經(jīng)過優(yōu)化處理的培養(yǎng)母液，所述母液營養(yǎng)鹽基礎(chǔ)配方為Na2N03120g，KH2P044g;將營養(yǎng)鹽溶于1000ml蒸餾水中，配置成母液備用，使用時每升培養(yǎng)液加lml母液。4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于當單細胞藻類為硅藻時，母液營養(yǎng)鹽基礎(chǔ)配方中還添加有Na2Si035g，F(xiàn)eC5H5072.5g;當單細胞藻類為金藻時，母液營養(yǎng)鹽基礎(chǔ)配方中還添加有維生素B,100mg，維生素B^0.5mg。當單細胞藻類為扁藻時，母液營養(yǎng)鹽基礎(chǔ)配方中還添加有FeC5H5070.5g;5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)瓶為市面上常用的18.9L的透明塑料純凈水瓶。6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在進行單細胞藻的充氣培養(yǎng)前，于培養(yǎng)瓶中加滿過濾海水，再加入次氯酸或次氯酸鈉消毒液消毒，使培養(yǎng)瓶中有效氯含量達到4080xl06。7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述光照范圍為3500-330001ux。全文摘要本發(fā)明涉及單細胞藻類的培養(yǎng)，具體地說是一種充氣培養(yǎng)單細胞藻類的方法，在溫度18-35℃和自然光照條件下，于裝滿沙濾自然海水的培養(yǎng)瓶中進行單細胞藻的充氣培養(yǎng)，充氣量為4-8L/min，用充氣泵或鼓風機充入空氣，空氣先經(jīng)2-3個空氣過濾器進行過濾，然后通過氣排分散到透明塑料培養(yǎng)瓶中進行用于貝類育苗餌料單細胞藻類的一級或二級大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)。本發(fā)明的操作方便、藻類生長穩(wěn)定快速、無污染。文檔編號C12N1/12GK101481655SQ20081001383公開日2009年7月15日申請日期2008年1月11日優(yōu)先權(quán)日2008年1月11日發(fā)明者于守團,葉乃好,方建光,玲朱,鋒李,杜美榮,毛玉澤,鍵鄒申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所