專利名稱：溪蟹金屬硫蛋白基因及其轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻以及金屬吸附材料的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種溪蟹金屬硫蛋白基因及其轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻以及金屬吸附材料的制備。
背景技術(shù)：
公知，目前有些工業(yè)廢物、礦泥廢物、城市廢水、放射性廢物、采礦廢物等環(huán)境廢物中含有大量的金屬，如鎘、汞、鉛等，它們進(jìn)入環(huán)境后不能被生物降解，大都參與食物鏈循環(huán)，并最終在生物體內(nèi)累積，破壞生物體正常生理代謝活動(dòng)，嚴(yán)重影響周圍環(huán)境和人畜健康。因此，如何有效地處理含有有害金屬的廢物已成為人類共同關(guān)注的問題。目前，已開發(fā)應(yīng)用的此類廢物處理方法很多，較傳統(tǒng)的方法有化學(xué)沉淀法、化學(xué)氧化還原法、活性炭吸附法、離子交換法、溶劑萃取法、物理法、膜分離法等，這些方法在一定條件下有效，但存在勞動(dòng)強(qiáng)度大，效率低、操作復(fù)雜、對(duì)低濃度廢水的處理較難等問題，而且還造成與對(duì)大量受污染廢料的去除和處置相關(guān)的高昂費(fèi)用等問題。
為了滿足人們對(duì)環(huán)境質(zhì)量的日益嚴(yán)格的要求，利用生物技術(shù)對(duì)金屬污染進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化回收和生態(tài)恢復(fù)的研究在污染治理中具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。生物修復(fù)是利用天然或人工改造的生物整體或組分來處理環(huán)境污染物的方法，具有投資少、效率高、可以原位處理低濃度環(huán)境有害污染物的特性，在環(huán)境治理中顯示了極大的潛力，它還可以協(xié)調(diào)經(jīng)濟(jì)發(fā)展與環(huán)境保護(hù)之間的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展。生物修復(fù)技術(shù)是替代物理化學(xué)修復(fù)的一種非常吸引人的方法，與物化技術(shù)相比，生物修復(fù)不止一個(gè)功能基團(tuán)組起作用，并且結(jié)合生物代謝活性系統(tǒng)，生物修復(fù)具有更大的效用。
近年來研究表明，對(duì)環(huán)境造成污染的多種金屬均能誘導(dǎo)生物體內(nèi)肝臟、腎臟、腦等組織內(nèi)金屬硫蛋白(metallothionein)生物合成的增加。金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)、低分子量、富含半胱氨酸，能被多種金屬誘導(dǎo)的金屬結(jié)合蛋白，具有對(duì)金屬的解毒作用，可以高效地從污水中吸附被污染的金屬；參與微量元素的貯存、運(yùn)輸和代謝；消除體內(nèi)自由基等功能，所有這些生理功能使金屬硫蛋白成為環(huán)保業(yè)關(guān)注的、有潛在應(yīng)用價(jià)值的重要分子。目前，人們稱該方法為生物吸附法，具有投資少、操作成本低、高吸附率、高選擇性、不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的重視。
目前，我國(guó)已有利用轉(zhuǎn)MT基因藍(lán)藻直接用于金屬污染治理的報(bào)道，與傳統(tǒng)的物化處理方法相比，具有治理效率高，成本低，沒有第二次污染等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)部分具有經(jīng)濟(jì)意義的金屬還可以用以回收。但是在實(shí)際工業(yè)使用中還存在以下缺陷一是由于自然界生物體某些物理性質(zhì)例如顆粒小、密度低、機(jī)械強(qiáng)度低，難于固液分離等，導(dǎo)致獲得的轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻難以直接應(yīng)用于金屬的去除，從而限制了生物吸附技術(shù)的工業(yè)應(yīng)用；二是現(xiàn)有所轉(zhuǎn)用的MT基因多來自于哺乳類動(dòng)物，如小鼠、家兔等，還未見有轉(zhuǎn)無脊椎水生動(dòng)物MT基因的報(bào)道。由于無脊椎水生動(dòng)物MT生化結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生理功能的多樣性，決定了其廣泛的適用范圍，無脊椎水生動(dòng)物MT最顯著的特點(diǎn)就是結(jié)合金屬元素的種類及總量變化的多樣性，一般，在無脊椎動(dòng)物MTs中，每克分子MT結(jié)合6個(gè)或7個(gè)金屬原子，針對(duì)不同金屬有明顯的結(jié)合順序，可同時(shí)吸附污水中多種金屬。所以利用充分的無脊椎動(dòng)物資源，特別是在實(shí)際研究操作中的簡(jiǎn)便性，更是突顯出其在實(shí)際應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)，這一優(yōu)勢(shì)可在污水中存在的金屬種類較多時(shí)造成生產(chǎn)的成本優(yōu)勢(shì)，而且處理效果會(huì)更加理想，所以無脊椎水生動(dòng)物MT在金屬吸附處理中的研究就更顯現(xiàn)出其科學(xué)及實(shí)際意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決現(xiàn)有哺乳類動(dòng)物MT基因及其轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻在含有金屬的廢物處理過程中很難直接用于吸附金屬以及結(jié)合金屬種類比較單一的問題，提供一種溪蟹金屬硫蛋白及其轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻以及金屬吸附材料的制備。
本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種溪蟹金屬硫蛋白基因，該基因的核苷酸序列如下 5`ATGGATGATCCTTGCTGCACAGAAGGAACGTGCGAGTGTGCTGAGGGCAAGTGCAAGTCAGGGTGTAAGTGCTCCTCCTGTCGCTGTTCACCTTGCGAGTAATGCATTTCCGAGTGCTAGTGCAGCAATGCGGAGGAAAGCGCCAAGAACTGCTCGAAGCCTTGCTCCTGCTGCCCC 3`。該序列為溪蟹金屬硫蛋白基因的正義鏈，其反義鏈可以根據(jù)堿基互補(bǔ)原則推測(cè)得到，這是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員很容易得到的。
將得到的溪蟹金屬硫蛋白基因通過表達(dá)載體和穿梭表達(dá)載體轉(zhuǎn)入藍(lán)藻中，得到轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻。表達(dá)載體優(yōu)選pUC19，穿梭表達(dá)載體優(yōu)選pRL-489。
將上述得到的轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻和甲殼素以體積比3∶1的比例混合，然后再加入濃度為0.75mol/L、相當(dāng)于轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻和甲殼素混合液體積2-4倍的NaOH溶液，在50℃下加熱10min，得到細(xì)胞泥；然后將1％～3％的海藻酸鈉溶液和細(xì)胞泥以體積比1∶1混合均勻，用靜電液滴法將得到的混合液注入濃度為0.05-0.2mol/L、體積為該混合液體積5倍的CaCl2溶液中，海藻酸鈉溶液與氯化鈣溶液反應(yīng)生成海藻酸鈣膠球，同時(shí)將轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻包埋在海藻酸鈣膠球中，固定化0.5-1h，然后用生理鹽水洗脫，得到含有轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的包埋體，該包埋體即為金屬的吸附材料。
上述過程中，所述細(xì)胞泥是泥狀的轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻和甲殼素的混合物；甲殼素、海藻酸鈉溶液、生理鹽水均為公知產(chǎn)品，很容易得到；靜電液滴法也是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員很容易實(shí)現(xiàn)的。其中氫氧化鈉的作用是提供一種弱堿性環(huán)境，利于甲殼素的溶解，使甲殼素與轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻混合更均勻；生理鹽水的主要作用是一方面在不破壞轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的情況下，洗脫其它反應(yīng)物(比如過量的未反應(yīng)的物質(zhì)，沉淀，未被包埋的菌體等)，另一方面保證轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的活性。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn) 1、所選溪蟹金屬硫蛋白的獨(dú)特性溪蟹類是低等指示生物在水體基底層代表性的物種，直接面對(duì)沉積在水體內(nèi)的金屬離子，而無脊椎水生動(dòng)物MT最顯著的特點(diǎn)就是結(jié)合金屬元素的種類及總量變化的多樣性，一般，在無脊椎動(dòng)物MT中，每克分子MT結(jié)合6個(gè)或7個(gè)金屬原子，針對(duì)不同金屬有明顯的結(jié)合順序，可同時(shí)吸附污水中多種金屬；所以本發(fā)明以無脊椎動(dòng)物溪蟹的金屬硫蛋白作為轉(zhuǎn)化基因，由于無脊椎動(dòng)物MT生化結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生理功能的多樣性，決定了其作為金屬生物吸附材料具有相當(dāng)廣泛的使用范圍，可同時(shí)吸附含有金屬的廢物中多種金屬，吸附能力較強(qiáng)；并且在實(shí)際試驗(yàn)設(shè)計(jì)中具有模式生物的諸多特點(diǎn)，操作上具有相當(dāng)?shù)暮?jiǎn)便性，可為我們提供大量的數(shù)據(jù)參考； 2、在轉(zhuǎn)基因體的選擇上具有充分的科學(xué)依據(jù)經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)理論研究，科學(xué)的統(tǒng)計(jì)分析，選擇表達(dá)性高、結(jié)合性強(qiáng)、易于繁殖、操作穩(wěn)定性好的轉(zhuǎn)MT基因體，即藍(lán)藻，藍(lán)藻是一門最原始、最古老的藻類植物，生長(zhǎng)在海水、淡水和陸地陰濕的地方，其主要特征是具有植物型放氧光合作用的原核生物，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)迅速、成本低、適應(yīng)性強(qiáng)、部分種類具有天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和有效重組系統(tǒng)。藍(lán)藻是分布最廣泛的生物，具有很強(qiáng)的抵抗惡劣環(huán)境的能力，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于繁殖，所以轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻是現(xiàn)代生物工程領(lǐng)域一個(gè)閃亮的熱點(diǎn)。將水生物體的MT基因轉(zhuǎn)移到藍(lán)藻中，這樣得到的轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻經(jīng)過大規(guī)模的培養(yǎng)后就可以與金屬結(jié)合，然后進(jìn)行降解或沉淀，這種處理方法成本大大降低； 3、在微生物固定技術(shù)上實(shí)現(xiàn)重大突破由于自然界生物體某些物理性質(zhì)導(dǎo)致的缺陷，例如顆粒小、密度低、機(jī)械強(qiáng)度低，難于固液分離等，導(dǎo)致懸浮生物體難以直接應(yīng)用于金屬的去除，從而限制了生物吸附技術(shù)的工業(yè)應(yīng)用，針對(duì)此技術(shù)限制，本發(fā)明采用了高效的轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻固定技術(shù)，固定化材料與自由的懸浮細(xì)胞相比，具有提高生物體的穩(wěn)定性，易于控制，易于進(jìn)行固液分離，處理過程簡(jiǎn)單，固定化轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻易于在不被破壞的情況下得到再生和重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)； 總之，本發(fā)明具有極大的發(fā)展?jié)摿?，具有成本低、效益高、不造成二次污染等?yōu)點(diǎn)，同時(shí)利用基因工程、分子生物學(xué)等技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供了有利條件。整個(gè)操作過程在處理污染的同時(shí)不僅美化了環(huán)境，還可以獲得相當(dāng)?shù)慕?jīng)濟(jì)效益。
圖1為溪蟹總RNA提取后的電泳圖 圖2為PCR體外擴(kuò)增MT基因片段的電泳圖 圖3為酶切鑒定結(jié)果的電泳圖 圖4為重組穿梭表達(dá)載體Prl-MT酶切鑒定結(jié)果的電泳圖 圖5為轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的分子檢測(cè)結(jié)果的電泳圖
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1溪蟹金屬硫蛋白基因的獲得 1、溪蟹總RNA的提取 稱取100mg(或200mg)組織置液氮中，加TRIZOLLS試劑，在勻漿器中快速勻漿至無可見組織，將液相轉(zhuǎn)移到1.5mL eppendorf管內(nèi)。室溫靜置5min，使核酸蛋白完全降解。加入0.2mL氯仿，顛倒混勻，靜止2～15min。4℃，11500rpm離心15min，取上層水相于一新eppendorf管中。加入0.2mL異丙醇沉淀RNA。先在靜置2～15min，4℃，11500rpm離心10min。棄上清，用75％乙醇(1‰DEPC水配制)洗滌沉淀，4℃，7400rpm離心5min。棄掉上清液，室溫干燥沉淀10m in。用無RNA酶水溶解沉淀，加1u L(40u/u L)RNA酶抑制劑，置-20℃?zhèn)溆谩?br>
用甲醛變性電泳法測(cè)總RNA的完整性，如圖1所示，1、2、3泳道分別對(duì)照和重復(fù)樣品，結(jié)果顯示穩(wěn)定性較好，電泳結(jié)束檢驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在18S，28S處有明顯的條帶出現(xiàn)，證明有mRNA的存在，5sRNA非常容易丟失，所以不明顯。
2、cDNA第一鏈的合成(反轉(zhuǎn)錄) 取RNA樣品4μl，逆轉(zhuǎn)錄酶MLV(Promega)3μl，5×RT buffer緩沖液(Promega)10μl，dNTP 10μl，RNasin 2μl，用DEPC處理過的水配成50μl反應(yīng)體系，經(jīng)過70℃10min、0℃60min、42℃60min反應(yīng)后，PCR檢測(cè)產(chǎn)物。
3、PCR體外擴(kuò)增溪蟹金屬硫蛋白基因MT 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的蟹類金屬硫蛋白核苷酸序列，用BLAST程序?qū)⑵渑c核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較，確定與該核苷酸序列同源性較高的片段，作為引物設(shè)計(jì)的依據(jù)，然后再參考其他甲殼動(dòng)物的核苷酸序列，設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)的簡(jiǎn)并引物如下表1 表1用于擴(kuò)增蟹類金屬硫蛋白cDNA的引物
*L2 and L4 are in antisense direction.**N＝A+C+G+T；R＝A+G；Y＝T+C；M＝A+C MT cDNA擴(kuò)增采用RT-PCR；反應(yīng)模板為3只溪蟹鰓總RNA的混合物；反應(yīng)引物由上海生工生物工程有限公司合成，其序列見表1(No.1～4)，其中L1和L2序列相應(yīng)于MT的開始的5位和最后的7位氨基酸殘基的核苷酸序列，用于擴(kuò)增MT cDNA片段；L3和L4用于巢式PCR的內(nèi)引物。反應(yīng)退火的溫度使用全簡(jiǎn)并引物時(shí)為50℃，使用特異引物和部分簡(jiǎn)并引物時(shí)為55℃。
PCR體外擴(kuò)增后，如圖2所示，1泳道為對(duì)照；2、3泳道為重復(fù)樣品；maker為DL2000。電泳結(jié)果顯示獲得大小約為170bp的片段，然后回收擴(kuò)增產(chǎn)物，儲(chǔ)存于-20℃，備用。
4、PCR回收產(chǎn)物與克隆載體的連接 PCR產(chǎn)物的連接參照Promega公司的pGEM-T Easy Vector System產(chǎn)品使用手冊(cè)進(jìn)行，體系如下表2。加入各組分之后于4℃連接24h； 表2連接反應(yīng)體系 反應(yīng)物體積(μl) pGEM-T Easy Vector1.0 PCR Product 7.0 10×Buffer 1.0 T4DNALigase1.0 總體積 10.0 5、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 將宿主菌E.coli DH5a在LB培養(yǎng)基平板上劃線，37℃過夜培養(yǎng)16-20h，從平板中挑出單菌落，移至5ml LB培養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng)。按1∶50的接種量轉(zhuǎn)移到100ml的LB培養(yǎng)液中，37℃強(qiáng)烈震蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.3-0.6，即對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期。將培養(yǎng)物置于冰上10min，然后轉(zhuǎn)移至冰預(yù)冷的50ml離心管中，在4℃，8000r/min離心10min，收集菌體，然后加入10ml新鮮配制的用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2，置于冰上3h，使細(xì)胞致敏。4℃，8000r/min離心10min，收集菌體，每50ml原培養(yǎng)物加2ml冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2，懸浮細(xì)胞，按200ml/Eppendorf管分裝細(xì)胞。未轉(zhuǎn)化的加10％甘油于-80℃凍存。
6、用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 將5μl待轉(zhuǎn)化的連接產(chǎn)物加入到100μl的保存于-80℃的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，溫和混勻，置于冰上30min。42℃熱休克50s，速置冰上2min。加入800μl無抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃溫浴15min，轉(zhuǎn)到搖床中溫和震蕩培養(yǎng)60min，讓細(xì)菌表達(dá)抗性蛋白。
7、陽性重組質(zhì)粒的篩選 將上述得到的菌液在12000轉(zhuǎn)離心30s，去除800μl上清，取200μl剩余菌液，均勻涂布于預(yù)先涂有100μl IPTG(誘導(dǎo)物)和20μl X-Gal(生色底物)的LB固體培養(yǎng)基(含0.1mg/ml氨芐青霉素)上，37℃培養(yǎng)約12h。由于所用載體pGEM-TEasy的多克隆位點(diǎn)在其β-半乳糖苷酶a肽鏈的編碼區(qū)內(nèi)，外源DNA片段的插入會(huì)導(dǎo)致該肽段無法合成，因此也就不能分解生色底物而形成藍(lán)色菌落。平板在4℃冷卻后，挑取白色單菌落，分別接種于5ml LB液體培養(yǎng)基(含0.1mg/ml氨卞青霉素)中，37℃，250r/min振蕩培養(yǎng)過夜。
8、重組質(zhì)粒的提取 重組質(zhì)粒提取使用上海華舜生物公司的“小量質(zhì)粒提取試劑盒”，其提取方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，在此不作詳細(xì)描述。
9、重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定 通過酶切分析和PCR擴(kuò)增的方法來確定所得質(zhì)粒是否帶有插入片段。在pGEMT-Tasy載體外源基因插入?yún)^(qū)域兩端各有一EcoRI限制酶的酶切位點(diǎn) 酶切體系Plasmid 4.0μl ddH2O 4.0μl 10×Buffer1.0μl EcoRL 1.0μl 將重組質(zhì)粒用EcoRI酶切后，在1.2％的瓊脂糖凝膠上電泳，與PCR擴(kuò)增后回收純化的片段為對(duì)比，找出插入片段大小合適的重組子。
在篩選中選擇了七個(gè)單菌落，酶切過程中2號(hào)與4號(hào)克隆在酶切中出現(xiàn)于預(yù)期位置相近的條帶，酶切鑒定結(jié)果如圖3，1-6泳道為酶切結(jié)果，其中2、4泳道在預(yù)測(cè)位置有目的條帶出現(xiàn)，7為maker DL2000。最后進(jìn)行DNA測(cè)序，得到溪蟹金屬硫蛋白基因，結(jié)果如下所示， 5`ATGGATGATCCTTGCTGCACAGAAGGAACGTGCGAGTGTGCTGAGGGCAAGTGCAAGTCAGGGTGTAAGTGCTCCTCCTGTCGCTGTTCACCTTGCGAGTAATGCATTTCCGAGTGCTAGTGCAGCAATGCGGAGGAAAGCGCCAAGAACTGCTCGAAGCCTTGCTCCTGCTGCCCC 3`。
實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的獲得 1、引物設(shè)計(jì)和目的片段的PCR擴(kuò)增 根據(jù)實(shí)施例1所得的序列設(shè)計(jì)引物，上游P1 AAGGATCCGGAGAGCGTCATGCCTGATC CTTGCTGC，引入一個(gè)BamHI位點(diǎn)，下游P2CCCCCCGAATTCGGGGCAGCAG，引入一個(gè)EcoRI位點(diǎn)。并在ATG前添加上適合于藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的SD序列。
擴(kuò)增時(shí)退火條件采用56℃，退火1min；5個(gè)循環(huán)后60℃，退火1min，30個(gè)循環(huán)；經(jīng)PCR擴(kuò)增得到特異性片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段為254bp，與理論推測(cè)相一致。將純化后的PCR產(chǎn)物(254bp)，BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切后，將MT基因插入克隆載體pUC19的多克隆位點(diǎn)上，得到MT基因的重組克隆質(zhì)粒pUC-MT。
2、穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建 將BamHI單切克隆載體pUC-MT得到的3.3kb大小的片段，與BamHI單切pRL-489后得到的9.0kb左右的大片段，分別電泳回收后，連接，構(gòu)建重組穿梭表達(dá)載體。用含有15μg/mL氨芐青霉素和10μg/mL卡那霉素的雙抗平板可以得到重組質(zhì)粒。BamHI單酶切后連接，將導(dǎo)致外源基因從正和反兩個(gè)方向插入到啟動(dòng)子pPSBA的下游。正連重組中MT位于pPSBA啟動(dòng)子的下游，能有效表達(dá)；而反連重組中MT距離啟動(dòng)子較遠(yuǎn)，使得外源MT基因不能得到表達(dá)。利用pPSBA啟動(dòng)子上游和MT基因3’端的EcoRI位點(diǎn)，單酶切篩選正反重組穿梭表達(dá)載體。BamHI單切重組載體得到9.0kb左右的大片段和3.3kb大小的小片段，表明MT基因及克隆載體插入到在pRL-489的兩個(gè)BamHI位點(diǎn)之間。經(jīng)EcoRI單酶切得到1.0kb的小片段，如圖4所示，為重組穿梭表達(dá)載體的鑒定圖譜。1為pRL-489/BamH I；2為pUC-MT/BamH I；3為λ/HindIII；4為pRL-MT/BamH I；5為pRL-MT/EcoRI；6為pRL-489/EcoRI，表明MT基因插入正向連接的重組穿梭表達(dá)載體pPSBA啟動(dòng)子的下游。
3、藍(lán)藻的培養(yǎng) 藍(lán)藻一般培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中，置于光照冷卻旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱中搖振培養(yǎng)，定期更換一次培養(yǎng)液，傳代按一定比例接種。
純化藻種時(shí)可采用劃線分離和涂布分離的方法。在含有瓊脂的固體培養(yǎng)基平板上，取藻種樣品稀釋不同剃度，涂布或劃線，倒置照光培養(yǎng)，待出現(xiàn)單藻落后，光鏡下確認(rèn)藻種，重復(fù)劃線純化。固體平板更適于藍(lán)藻藻種的保存。將平板置于弱光下，室溫可保存幾個(gè)月。液體培養(yǎng)物靜置于室溫弱光下，定期更換培養(yǎng)液。收集藍(lán)藻培養(yǎng)物，加入滅菌甘油，-70℃可長(zhǎng)時(shí)間保存。從平板上挑取單藻落，接種至含培養(yǎng)液的試管中，待培養(yǎng)物變綠，再逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，也可在大體積的容器中通氣培養(yǎng)。
4、用三親接合轉(zhuǎn)移的方法進(jìn)行藍(lán)藻的轉(zhuǎn)化 (1)E.coli預(yù)處理在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中，分別接種含有穿梭表達(dá)載體的大腸桿菌及含有RP4接合質(zhì)粒和pRL542輔助質(zhì)粒的HB101大腸桿菌，37℃下培養(yǎng)，離心收菌，重新懸于LB培養(yǎng)液中，等體積混合兩種菌液備用。
(2)藍(lán)藻的準(zhǔn)備取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期藍(lán)藻培養(yǎng)物離心收集細(xì)胞，用培養(yǎng)液洗滌兩次，再以適當(dāng)體積的培養(yǎng)液懸浮藻細(xì)胞。藍(lán)藻細(xì)胞數(shù)的粗略計(jì)算公式(ElhaiJ等，1988)為藍(lán)藻細(xì)胞濃度(cells/ml)＝O.D.665x 4.5x10′C2 (3)接合轉(zhuǎn)移將收集的藻細(xì)胞與細(xì)菌按一定比例混合均勻，輕輕地將其涂于無抗生素的BG-11固體培養(yǎng)基上的纖維素脂濾膜上(0.45μm)，盡量使濾膜上的混合液均勻。待液體完全滲入培養(yǎng)基中。光照培養(yǎng)數(shù)天后，使藍(lán)藻表達(dá)抗性。小心地轉(zhuǎn)移濾膜到含有相應(yīng)抗生素的平板上，繼續(xù)光照培養(yǎng)，直到出現(xiàn)陽性克隆，表明得到轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻。
(4)轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的篩選與純化將陽性單藻落接種到含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)液中，抗生素的濃度由低到高逐漸增加。也可以將整個(gè)濾膜投入含抗生素的培養(yǎng)液中，待轉(zhuǎn)基因藻生長(zhǎng)穩(wěn)定后，在平板上劃線得單藻落。除去轉(zhuǎn)基因藻中細(xì)菌的方法是在培養(yǎng)液中加入蔗糖，離心收集沉淀。
5、轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的分子檢測(cè) 提取轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增檢測(cè)穿梭表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻中的存在，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖5顯示，1泳道為對(duì)照；2為1.pRL-MT PCR擴(kuò)增(模板為轉(zhuǎn)pRL-MT載體的魚腥藻質(zhì)粒)；3為pRL-489PCR擴(kuò)增(模板為轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的魚腥藻質(zhì)粒)；4為pRL-489PCR擴(kuò)增(模板為轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的大腸桿菌質(zhì)粒)；5為pRL-MT PCR擴(kuò)增(模板為轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的大腸桿菌質(zhì)粒)；6為maker DL2000，由圖上可知在轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻中有目的基因即溪蟹金屬硫蛋白基因存在。
實(shí)施例3包含轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的金屬吸附材料的制備方法 將上述得到的轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻和甲殼素以體積比3∶1的比例混合，然后再加入濃度為0.75mol/L、相當(dāng)于轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻和甲殼素混合液體積2-4倍的NaOH溶液，在50℃下加熱10min，得到細(xì)胞泥；然后將1％～3％的海藻酸鈉溶液和細(xì)胞泥以體積比1∶1混合均勻，用靜電液滴法將得到的混合液注入濃度為0.05-0.2mol/L、體積為該混合液體積5倍的CaCl2溶液中，海藻酸鈉溶液與氯化鈣溶液反應(yīng)生成海藻酸鈣膠球，同時(shí)將轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻包埋在海藻酸鈣膠球中，固定化0.5-1h，然后用生理鹽水洗脫，得到含有轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的包埋體，該包埋體即為金屬的吸附材料，可直接用于不同領(lǐng)域的金屬吸附。
SEQUENCE LISTING
<110>山西九龍灣農(nóng)林科技開發(fā)有限公司
<120>溪蟹金屬硫蛋白基因及其轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻以及金屬吸附材料的制備
<160>1
<210>1
<211>177
<212>DNA
<213>Sinopotamon yangtsekiense
<221>1-177
<400>1
atggatgatc cttgctgcac agaaggaacg tgcgagtgtg ctgagggcaa gtgcaagtca 60
gggtgtaagt gctcctcctg tcgctgttca ccttgcgagt aatgcatttc cgagtgctag 120
tgcagcaatg cggaggaaag cgccaagaac tgctcgaagc cttgctcctg ctgcccc 17權(quán)利要求
1、一種溪蟹金屬硫蛋白基因，其特征是該基因的核苷酸序列如下
5`ATGGATGATCCTTGCTGCACAGAAGGAACGTGCGAGTGTGCTGAGGGCAAGTGCAAGTCAGGGTGTAAGTGCTCCTCCTGTCGCTGTTCACCTTGCGAGTAATGCATTTCCGAGTGCTAGTGCAGCAATGCGGAGGAAAGCGCCAAGAACTGCTCGAAGCCTTGCTCCTGCTGCCCC 3`。
2、利用如權(quán)利要求1所述的溪蟹金屬硫蛋白基因獲得的轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻，其特征是將得到的溪蟹金屬硫蛋白基因通過表達(dá)載體和穿梭表達(dá)載體轉(zhuǎn)入藍(lán)藻中，得到轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用溪蟹金屬硫蛋白基因獲得的轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻，其特征是表達(dá)載體優(yōu)選pUC19，穿梭表達(dá)載體優(yōu)選pRL-489。
4、利用如權(quán)利要求2或3所述的轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻制備金屬吸附材料的方法，其特征是將上述得到的轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻和甲殼素以體積比3∶1的比例混合，然后再加入濃度為0.75mol/L、相當(dāng)于轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻和甲殼素混合液體積2-4倍的NaOH溶液，在50℃下加熱10min，得到細(xì)胞泥；然后將1％～3％的海藻酸鈉溶液和細(xì)胞泥以體積比1∶1混合均勻，用靜電液滴法將得到的混合液注入濃度為0.05-0.2mol/L、體積為該混合液體積5倍的CaCl2溶液中，海藻酸鈉溶液與氯化鈣溶液反應(yīng)生成海藻酸鈣膠球，同時(shí)將轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻包埋在海藻酸鈣膠球中，固定化0.5-1h，然后用生理鹽水洗脫，得到含有轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的包埋體，該包埋體即為金屬的吸附材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種溪蟹金屬硫蛋白基因及其轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻以及金屬吸附材料的制備，解決現(xiàn)有哺乳類動(dòng)物MT基因在含有金屬的廢物處理過程中很難直接用于吸附金屬以及結(jié)合金屬種類比較單一的問題，該基因的核苷酸序列如下5`ATGGATGATCCTTGCTGCACAGAAGGAACGTGCGAGTGTGCTGAGGGCAAGTGCAAGTCAGGGTGTAAGTGCTCCTCCTGTCGCTGTTCACCTTGCGAGTAATGCATTTCCGAGTGCTAGTGCAGCAATGCGGAGGAAAGCGCCAAGAACTGCTCGAAGCCTTGCTCCTGCTGCCCC 3`，本發(fā)明具有極大的發(fā)展?jié)摿?，具有成本低、效益高、不造成二次污染等?yōu)點(diǎn)，同時(shí)利用基因工程、分子生物學(xué)等技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供了有利條件。整個(gè)操作過程在處理污染的同時(shí)不僅美化了環(huán)境，還可以獲得相當(dāng)?shù)慕?jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12R1/89GK101298614SQ200810054598
公開日2008年11月5日 申請(qǐng)日期2008年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月5日
發(fā)明者馬小軍, 峰 趙, 濤 顏 申請(qǐng)人:山西九龍灣農(nóng)林科技開發(fā)有限公司