專利名稱：用于細(xì)胞固定和溶液稀釋的微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程和分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及細(xì)胞分析，生物及化學(xué)反應(yīng)溶 液的混合，濃度梯度的產(chǎn)生的微流控芯片結(jié)構(gòu)。
背景技術(shù)：
近年來，微流控芯片技術(shù)在分析化學(xué)和生化檢測領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。其 中，細(xì)胞分析和溶液的混合操作(包括定量稀釋、濃度梯度產(chǎn)生)是兩個重要的應(yīng)用方 向。在很多芯片上的細(xì)胞分析方法中，把細(xì)胞按一定的位置排列固定是進(jìn)行進(jìn)一步生化 檢測的前提。而芯片中的溶液按一定的比例稀釋或者快速混合，可以得到所需要的反應(yīng) 濃度、組分配比或者濃度梯度，提高反應(yīng)速度，對生化檢測或者高通量分析芯片的開發(fā) 有極其重要的意義。
目前，能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞固定的方法很多，如力學(xué)方法(介電力，光鉗)，表面吸附，微 水壩結(jié)構(gòu)上的細(xì)胞排列等等。這些方法通常都需要復(fù)雜的結(jié)構(gòu)、表面修飾或者精細(xì)的操 作，實(shí)現(xiàn)起來相當(dāng)困難，難以推廣。進(jìn)行溶液混合或者稀釋的方法也有不少。精確的混 合需要選擇合適的流動驅(qū)動力或者混合通道結(jié)構(gòu)，在加工和控制上都有一定的難度。而 高速的混合更需要采用復(fù)雜的微細(xì)結(jié)構(gòu)來讓溶液多次分開、融合以增加不同溶液間的接 觸面積，提高擴(kuò)散融合速度?；蛘咄ㄟ^很強(qiáng)的驅(qū)動力或者很粗糙的通道表面設(shè)計，使溶 液盡量從層流變成紊流，提高M(jìn)合效率。這些方法在加工和實(shí)現(xiàn)上都相當(dāng)困難。如果能 實(shí)現(xiàn)流動的有效控制，配合特定的微結(jié)構(gòu)設(shè)計，細(xì)胞固定和溶液混合操作都將成為可能。
最近，美國哈佛大學(xué)的Whitesides等人通過改變流動通道的形狀來實(shí)現(xiàn)流動方向的控 制。他們通過改變彈性橡膠微流換向結(jié)構(gòu)的幾何尺寸來改變液流在通道中的位置，從而 控制流體的運(yùn)動。這種換向方法需要在上下兩層芯片結(jié)構(gòu)中加工交錯的通道，設(shè)計相對 困難，除了能改變流動方向外，也沒太多用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，在Whitesides等人的研究基礎(chǔ)上提出 一種用于細(xì)胞 固定和溶液稀釋的微水池芯片，采用兩基層上的微水池與微通道相互交疊，通過選擇不 同的微水池結(jié)構(gòu)或者用外力改變已有微水池的尺寸來控制整個芯片中的流動狀況，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的固定或者溶液的稀釋。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種用十細(xì)胞固定和溶液稀釋的微流控芯片，它包括一面加工有多條微通道的透明 硬質(zhì)基底層，微通道兩端通過進(jìn)、出樣口與外界管道連接，所述微通道是相互獨(dú)立的； 另外它還包括有一面加工有微水池的透明彈性橡膠層，透明硬質(zhì)基底層加工有微通道的 一面與透明彈性橡膠層微加工有微水池的一面相互緊貼并結(jié)合在一起，微通道與微水池 部分交疊，形成封閉的細(xì)胞懸液或溶液流動通路，液體可以在微通道和微水池之間來回 流動。
所述透明硬質(zhì)基底層采用硬質(zhì)芯片加工材料硅或有機(jī)玻璃等。 所述透明彈性橡膠層采用聚二甲基硅氧烷PDMS制成。
選擇具有不同尺寸的微水池結(jié)構(gòu)的透明彈性橡膠層與透明硬質(zhì)基底層結(jié)合，形成具 有不同流動分布的微流控芯片，或采用外力擠壓透明彈性橡膠層，改變微水池的形狀， 從而改變芯片中的流動分布。即本芯片可以通過選擇不同的微水池結(jié)構(gòu)或者用外力改變 己有微水池的尺寸來控制整個芯片中的流動狀況。
本芯片當(dāng)用于在細(xì)胞固定中，通過設(shè)定或者改變微水池的尺寸，使微通道與微水池 相連的部分產(chǎn)生橫向(與通道延伸方向垂直〉的流動，使細(xì)胞在這個方向的液體壓力下 沿通道壁固定。
當(dāng)用于溶液混合、稀釋時，來自不同微通道的液體可以在微水池中擴(kuò)散混合，通過 調(diào)整微水池的尺寸(即選用不同尺寸大小的微水池，或用外力擠壓透明彈性橡膠層，可 以改變進(jìn)出微水池的流體數(shù)量及速度，從而控制融合的稀釋程度或者混合物中不同組分 的比例，溶液在微水池和微通道間的垂直混合模式還有助于提高溶液的混合速度。
本發(fā)明提出的微水池芯片結(jié)構(gòu)具有以下優(yōu)點(diǎn)
本芯片通過選擇不同的微水池結(jié)構(gòu)或者用外力改變己有微水池的尺寸可控制整個芯 片中的流動狀況，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的固定或者溶液的稀釋，操作方便，結(jié)構(gòu)簡單，加工方 便，成本低廉，有利于推廣。它可以用于在微芯片上固定不同的生物活細(xì)胞或者非生物 顆粒(如聚苯乙烯顆粒，可以吸附生物大分子)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞、分子為基礎(chǔ)的生物分 析。也可以控制不同液體按設(shè)定的比例、擴(kuò)散條件進(jìn)行混合，得到所需要的溶液濃度或 者濃度梯度，用于高通量生物樣品分析。該芯片結(jié)構(gòu)中混合液可以在通道和微水池間垂 直擴(kuò)散混合，大大提高混合速度。


圖1是本微水池芯片的平面示意圖。 圖2是本微水池芯片的透視圖(結(jié)合前)。 圖3是本微水池芯片的剖視圖(結(jié)合后)。
圖4是較寬矩形微水池結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞固定情況，其中圖4A是示意圖，圖4B是實(shí)際
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果照片。
圖5是較窄矩形微水池結(jié)構(gòu)中的液體流動情況(圖中箭頭表示不同區(qū)域間液體的流 動方向)。
圖6是較窄矩形微水池結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞固定情況，其中圖6A是示意圖，圖6B是水池 上游的細(xì)胞固定情況照片，圖6C是水池中游的細(xì)胞固定情況照片，圖6D是水池下游的 細(xì)胞固定情況照片。
圖7是梯形微水池結(jié)構(gòu)中的液體流動情況(圖中箭頭表示不同區(qū)域間液體的流動方向)。
圖8是不在對稱中心上的較寬矩形微水池結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞固定情況，其中圖8A是示意 圖，圖8B是在微水池上游實(shí)際細(xì)胞固定實(shí)驗(yàn)結(jié)果照片。
圖9是本微水池芯片上溶液的擴(kuò)散混合及不同微水池長度、寬度、位置的結(jié)果分析， 其中圖9A是擴(kuò)散混合的實(shí)驗(yàn)照片，熒光物質(zhì)從中間向兩側(cè)擴(kuò)散，圖9B是不同微水池長 度對混合終濃度的影響曲線，圖9C是不同微水池寬度對混合終濃度的影響曲線，圖9D 是微水池位置變化對混合終濃度的影響曲線。
圖10是本微水池芯片上溶液在微水池與微通道間的擴(kuò)散混合示意圖及其混合效率與 傳統(tǒng)擴(kuò)散混合方法的比較，其中圖IOA是熒光物質(zhì)在芯片中的擴(kuò)散情況示意圖，圖10B 微水池芯片結(jié)構(gòu)的擴(kuò)散梯度圖，混合距離是大約250 pm，圖IOC是相似尺寸的傳統(tǒng)芯片 的擴(kuò)散梯度圖，混合距離是5mm。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
參見圖l、圖2和圖3，微流控芯片由兩層組成，第I層是透明硬質(zhì)基底層1,采用 玻璃，第II層是透明彈性橡膠層2，采用PDMS制成。透明硬質(zhì)基底層1層的一面加工 有三條平行的微通道3、 4、 5，微通道兩端有進(jìn)樣口6、 7、 8和出樣口9、 10、 11。在微 型泵的驅(qū)動下，樣品液體可以從進(jìn)樣口 6、 7、 8進(jìn)入微通道，然后從出樣口 9、 10、 11 流出。透明彈性橡膠層2的一面加工有長方體形狀的凹槽，形成微水池12，微水池12 的長度和寬度根據(jù)應(yīng)用目的的不同有所區(qū)別。結(jié)合前，先把透明彈性橡膠層2用氧等離子體處理30秒鐘，然后水平放置，微水池12朝上。把透明硬質(zhì)基底層1表節(jié)青潔后， 微通道3、 4、 5朝下覆蓋在透明彈性橡膠層2上，兩層基片通過物理作用緊密結(jié)合在一 起。透明硬質(zhì)基底層1上的微通道3、 4、 5和透明彈性橡膠層2上的微水池12相互交疊 在一起構(gòu)成封閉的流動通路。在微通道3、 4、 5中流動的液體可以不斷的流進(jìn)和流出微 水池12。微水池12的尺寸對其附近的流動情況有很大的影響，通過對尺寸的改變可以調(diào) 整液體的流動方向、速度等參數(shù)。
整個芯片的尺寸為30 (長)x20 (寬)x5(高)mm,微通道3、 4、 5的長度、 寬度和深度分別為20 mm， 100 pm和30 nm，相鄰?fù)ǖ赖拈g隔為20 nm。微水池12的深 度是8pm，長度和寬度根據(jù)需求來調(diào)整。所有進(jìn)樣口6、 7、 8和出樣口9、 10、 11的直 徑為2mm。
實(shí)施例2:利用微水池芯片結(jié)構(gòu)固定細(xì)胞
從實(shí)施例1中所述的芯片的進(jìn)樣口 6、 7、 8分別加入人早幼粒白血病細(xì)胞HL 60懸 浮液，通過微量泵在進(jìn)樣口上施加40Pa的壓力，出口壓力為0。
在透明彈性橡膠層2與透明硬質(zhì)基底層1結(jié)合時，微水池12的對稱中線和中間那條 微通道4的對稱中線重合。當(dāng)微水池12的寬度大于或者等于340 pm (3條微通道的寬度 加t它們中間的間隔)時，來自微通道3、 4、 5中的液體充滿微水池12后就不再有液體 流入或者流出微水池12，因此也不存在經(jīng)過微水池12的橫向流動和細(xì)胞的固定，如圖4 的圖4A和圖4B所示。
如圖6的圖6A所示，當(dāng)微水池12的寬度小于340 pm時，微水池與各個微通道3、 4、 5間的接觸面積不相同(如圖5中的3'、 4，、 5',這里3'、 4'、 5'分別代表微水池中與 通道3、 4、 5相接觸的區(qū)域)，其中與微通道4的接觸區(qū)域4，的面積更大一些，由于微水 池12相對于整個流路來說所占比例較小，從各個微通道3、 4、 5中流入微水池12以及 從微水池12中流出到各微通道3、 4、 5的液體量基本相同，因此，在微水池12的上游 存在由外向內(nèi)的流動，下游存在由內(nèi)向外的流動，如圖5所示，懸液中的細(xì)胞也會跟隨 液流沿這些方向運(yùn)動。芯片中，微水池12的深度(8 nm)小于HL60細(xì)胞的直徑(15 pm 左右)， 一條微通道中的細(xì)胞不可能順微水池12流到相鄰的微通道，它們會被微水池12 與透明硬質(zhì)基底層1之間的縫隙擋住，從而沿通道壁的方向固定。如圖6B，在水池上游， 外側(cè)通道的液體向內(nèi)側(cè)通道流動，外側(cè)通道流動的部分細(xì)胞會固定在通道3和5靠近通 道4一側(cè)的通道壁上；當(dāng)在水池中游時，如圖6C，由于沒有側(cè)向流動，沒有明顯的細(xì)胞 固定出現(xiàn)；而在水池下游，見圖6D，內(nèi)側(cè)通道的液體向外側(cè)流動，內(nèi)側(cè)通道流動的部分細(xì)胞會固定在兩側(cè)的通道壁上。
如果用外力改變微水池12的尺寸或者選用不同形狀的微水池12,如圖7中的梯形， 可以改變微水池12附近的流動情況，從而使細(xì)胞固定在不同的位置。如果把微水池12 沿橫向(與微通道垂直的方向)移動，兩側(cè)通道的流動會出現(xiàn)差異，細(xì)胞的固定位置也 會出現(xiàn)變化，例如只在一側(cè)的通道壁附近固定，見圖8A和圖8B。
實(shí)施例3:利用本芯片進(jìn)行溶液混合
在微流控系統(tǒng)中，液體的流動主要呈層流狀態(tài)，物質(zhì)擴(kuò)散是主要的混合方式?；旌?的程度與物質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)和擴(kuò)散(駐留)時間成正比，與擴(kuò)散距離成反比，混合速度也 與擴(kuò)散距離成反比。
在溶液稀釋實(shí)驗(yàn)中，有熒光的溴乙啶溶液從芯片的進(jìn)樣口 4加入，而三蒸水從進(jìn)樣 口3和5加入，在壓力作用下，不同溶液都從進(jìn)樣口流向出樣口，通過激光共聚焦顯微 鏡檢測，可以得到溴乙啶分子在微通道中的流動及擴(kuò)散情況。
在微通道3、 4、 5與微水池12接觸處，液體可以進(jìn)入微水池12中。來自不同微通 道的流體并排流動，擴(kuò)散是這些不同液流間混合的主要方式，它受流動狀態(tài)和駐留時間 的影響，而這些又受流動速度和微水池12形狀的影響。在實(shí)驗(yàn)中，溴乙啶分子逐漸向鄰 近的水里擴(kuò)散，見圖9A。不同長度(圖9B)、寬度(圖9C)的矩形微水池12，以及相 同微水池12在不同的位置(圖9D， 340 nm寬的微水池由對稱中心向一側(cè)水平移動)所 形成的混合濃度都有區(qū)別。
由于微水池12和微通道3、 4、 5分別在兩層基底上，這種分子擴(kuò)散不但在水平方向 的不同液流間進(jìn)行(微水池12內(nèi)部)，同樣也在垂直方向的液流間進(jìn)行(微水池12與微 通道4之間，圖10A)。由于普通微加工方法都適于加工深寬比(深度/寬度)比較小的微 通道結(jié)構(gòu)。通常，兩層通道(或者通道加微水池)的深度還要遠(yuǎn)小于微通道的寬度。因 此，這種擴(kuò)散的擴(kuò)散距離更短，其擴(kuò)散速度比傳統(tǒng)的通過水平方向的擴(kuò)散混合更快，有 利于提高混合效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表面，相似的結(jié)構(gòu)條件下，微水池芯片完全混合所需要的 擴(kuò)散距離(圖10B)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)的擴(kuò)散混合芯片(圖IOC)。
權(quán)利要求
1.一種用于細(xì)胞固定和溶液稀釋的微流控芯片，它包括一面加工有多條微通道的透明硬質(zhì)基底層，微通道兩端通過進(jìn)、出樣口與外界管道連接；其特征在于所述微通道是相互獨(dú)立的；另外還包括有一面加工有微水池的透明彈性橡膠層，透明硬質(zhì)基底層加工有微通道的一面與透明彈性橡膠層微加工有微水池的一面相互緊貼并結(jié)合在一起，微通道與微水池部分交疊，形成封閉的細(xì)胞懸液或溶液流動通路。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于細(xì)胞固定及溶液稀釋的微水池芯片，其特征在于所述透 明硬質(zhì)基底層采用硬質(zhì)芯片加工材料玻璃、硅或有機(jī)玻璃。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于細(xì)胞固定及溶液稀釋的微水池芯片，其特征在于所述透 明彈性橡膠層采用聚二甲基硅氧烷PDMS制成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2或3所述的用于細(xì)胞固定及溶液稀釋的微水池芯片，其特征在于-選擇具有不同尺寸的微水池結(jié)構(gòu)的透明彈性橡膠層與透明硬質(zhì)基底層結(jié)合，形成具有 不同流動分布的微流控芯片。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2或3所述的用于細(xì)胞固定及溶液稀釋的微水池芯片，其特征在于采用外力擠壓透明彈性橡膠層，改變微水池的形狀，從而改變芯片中的流動分布。
全文摘要
本發(fā)明提出一種用于細(xì)胞固定和溶液稀釋的微流控芯片，它包括一面加工有多條微通道的透明硬質(zhì)基底層，還包括一面加工有微水池的透明彈性橡膠層，透明硬質(zhì)基底層加工有微通道的一面與透明彈性橡膠層微加工有微水池的一面相互緊貼，微通道與微水池部分交疊，形成封閉的細(xì)胞懸液或溶液流動通路。通過選擇不同的微水池結(jié)構(gòu)或用外力改變已有微水池的尺寸，可控制整個芯片中的流動狀況，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的固定或者溶液的稀釋。本發(fā)明可用于在微芯片上固定不同的生物活細(xì)胞或者非生物顆粒，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞、分子為基礎(chǔ)的生物分析；也可控制不同液體按設(shè)定的比例、擴(kuò)散條件進(jìn)行混合，得到所需的溶液濃度或濃度梯度，用于高通量生物樣品分析。
文檔編號C12Q1/02GK101290314SQ20081006943
公開日2008年10月22日 申請日期2008年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日
發(fā)明者劉向紹, 張麗果, 李圓怡, 軍 楊, 敏 王, 翟盛杰, 鄭小林 申請人:重慶大學(xué)