專利名稱：微管內(nèi)等電聚焦和剪斷吹出培養(yǎng)測定微生物等電點(diǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明應(yīng)用一種微管內(nèi)等電聚焦和將微管等分剪斷，再吹出微生 物進(jìn)行培養(yǎng)，測定微生物等電點(diǎn)的方法，屬于生物分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微生物具有表面電荷和兩性特性，具有等電點(diǎn)(pl)。微生物表面 電荷和等電點(diǎn)特性是由微生物細(xì)胞膜或細(xì)胞壁表面的氨基酸殘基、糖 蛋白和脂類等分子的總體帶電性質(zhì)所決定。因此，不同微生物以及不 同生長代謝狀態(tài)時(shí)的微生物均可用其表面電荷特性以及等電點(diǎn)特性 進(jìn)行表征。研究微生物表面電荷的帶電特征，可表征微生物自身的生 理生化特性，并對研究其生長代謝狀態(tài)、檢測和表征微生物表面的生 化反應(yīng)等具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。已有毛細(xì)管電泳方法主要是將 微生物樣品進(jìn)行等點(diǎn)聚焦分離，以初步分離不同的微生物，通過比較 微生物樣品與等電點(diǎn)標(biāo)記物遷移時(shí)間的相對關(guān)系估算等電點(diǎn)。此等點(diǎn) 聚焦方法需要經(jīng)過復(fù)雜的進(jìn)樣步驟，且不能直觀地檢測到活體微生物 和準(zhǔn)確測定微生物等電點(diǎn)。目前生物學(xué)尚沒有通用的確定微生物等電 點(diǎn)的測定方法和報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決簡單、快速、直觀判斷微生物等電點(diǎn) 范圍的問題，而提供一種微管內(nèi)等電聚焦和剪斷吹出培養(yǎng)測定微生物 等電點(diǎn)的方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明的一種微管內(nèi)等電聚焦和剪斷吹出培養(yǎng)測定微生物等電 點(diǎn)的方法，具體測量步驟為
1)用0.1M鹽酸對微管壁進(jìn)行沖洗，去除管壁上附著的雜質(zhì)；然 后將體積分?jǐn)?shù)為4%的載體兩性電解質(zhì)和體積分?jǐn)?shù)為0.1%為甲基纖維素加入無菌水，向其中加入微生物樣品，濃度為105cfti/ml，構(gòu)成 樣品溶液，注滿微管； 一端插入陰極緩沖液，另一端插入陽極緩沖液， 然后加10~25KV的恒定電壓進(jìn)行聚焦，待電流平穩(wěn)后，聚焦完成， 停止加電壓，使微管內(nèi)部形成連續(xù)pH梯度的兩性電解質(zhì)。
其中微管材料為石英熔融、光纖或高分子聚合物，內(nèi)徑 25-1000pm，長度20-200cm。
2) 將微管取出，根據(jù)所加兩性電解質(zhì)形成的pH梯度與微管總長 的線性關(guān)系，對微管進(jìn)行等分剪斷，使每段微管指示了一定的pH范 圍。
3) 用無菌水將微管內(nèi)溶液吹出到固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。 對細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行菌落觀察，根據(jù)有菌落生長的微管在總管長中所 處的位置來確定微生物的pH范圍，即等電點(diǎn)范圍。
本發(fā)明的有益效果是
1) 自由溶液等電聚焦操作簡單，對所用微管要求不高，無需對 微管內(nèi)壁進(jìn)行修飾和復(fù)雜的前處理。
2) 檢測方法采用細(xì)菌培養(yǎng)的生物學(xué)方法，成熟可靠。
3) 測定方法簡單，快速，直觀，該方法不僅可用于各種微生物 等電點(diǎn)測定，并可用于微生物菌種的篩選。


圖l為微管內(nèi)充滿溶液示意圖2為微管內(nèi)等電聚焦完成示意圖3為微管等分剪斷示意圖4為每段微管內(nèi)液體吹出培養(yǎng)示意圖。
其中l(wèi)-檢測窗口。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11) 將熔融石英毛細(xì)管(100|umi.d.柱長52cm)用0.1MHC1沖 洗5 min。
用磷酸鹽緩沖液(PBS pH 7.0)將菌樣制成菌懸液。使用時(shí)用PBS 溶液稀釋至10SCFU/ml濃度，并加入4%兩性電解質(zhì)(Ampholine ， pH范圍3.5-10.0)和0.1%甲基纖維素制成細(xì)菌樣品。
2) 用手動(dòng)泵向毛細(xì)管內(nèi)注入制備好的細(xì)菌樣品，使用陰極緩沖 液20mMNaOH，陽極緩沖液20 mM H3P04，加15kV進(jìn)行聚焦。聚 焦15min后，電流趨于平穩(wěn)，聚焦完成，停止加電壓。
3) 輕輕水平取出含細(xì)菌溶液的毛細(xì)管，將毛細(xì)管等分切斷，每 4cm長為一段，52cm共切成13段，則每段對應(yīng)的pH范圍為0.5。 用無菌水將每段的樣品液吹出至已滅菌的固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)菌 培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置空白對照。細(xì)菌培養(yǎng)條件為37'C恒溫培養(yǎng)18~24h。 對培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行觀察。在pH范圍為6.5~7 —段毛細(xì)管吹出的樣品， 有微生物Exoli JM83菌落生長，而其它平板及空白對照組均無菌落 生長，從而可以確定微生物E.coliJM83的等電點(diǎn)在pH6.5 7之間。
實(shí)施例2
將熔融石英毛細(xì)管(lOOiumi.d.柱長52cm)用0.1MHC1沖洗5
min。
改變菌懸液濃度，菌懸液用PBS溶液稀釋至106CFU/ml濃度， 并加入4%兩性電解質(zhì)Ampholine (pH范圍3.5-10.0)和0.1%甲基
纖維素制成細(xì)菌樣品。
等電聚焦其他條件同上。
每4cm長為一段，52cm共切成13段，用無菌水將每段的樣品 液吹出至已滅菌的固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置空白對 照。細(xì)菌培養(yǎng)條件為37。C恒溫培養(yǎng)18 24h。
實(shí)施例3
將熔融石英毛細(xì)管(lOOpmi.d.柱長52cm)用0.1MHC1沖洗5mm0
改變菌懸液濃度。菌懸液用PBS溶液稀釋至107CFU/ml濃度， 并加入4%載體兩性電解質(zhì)(Ampholine ， pH范圍3.5-10.0)和0.1%
甲基纖維素制成細(xì)菌樣品。 等電聚焦其他條件同上。
每4cm長為一段，52cm共切成13段，用無菌水將每段的樣品 液吹出至已滅菌的固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置空白對 照。細(xì)菌培養(yǎng)條件為37"C恒溫培養(yǎng)18~24h。
權(quán)利要求
1、微管內(nèi)等電聚焦和剪斷吹出培養(yǎng)測定微生物等電點(diǎn)的方法，其特征在于具體測量步驟如下1)用0.1M鹽酸對微管壁進(jìn)行沖洗，去除管壁上附著的雜質(zhì)；然后將體積分?jǐn)?shù)為4％的載體兩性電解質(zhì)和體積分?jǐn)?shù)為0.1％為甲基纖維素加入無菌水，向其中加入微生物樣品，濃度為105cfu/ml，構(gòu)成樣品溶液，注滿微管；一端插入陰極緩沖液，另一端插入陽極緩沖液，然后加10～25KV的恒定電壓進(jìn)行聚焦，待電流平穩(wěn)后，聚焦完成，停止加電壓，使微管內(nèi)部形成連續(xù)pH梯度的兩性電解質(zhì)；2)將微管取出，根據(jù)所加兩性電解質(zhì)形成的pH梯度與微管總長的線性關(guān)系，對微管進(jìn)行等分剪斷，使每段微管指示了一定的pH范圍；3)用無菌水將微管內(nèi)溶液吹出到固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)；對細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行菌落觀察，根據(jù)有菌落生長的微管在總長中所處的位置來確定微生物的pH范圍，即等電點(diǎn)范圍。
2、 如權(quán)利要求1所述的微管內(nèi)等電聚焦和剪斷吹出培養(yǎng)測定微生物等 電點(diǎn)的方法，其特征在于其中微管材料為石英熔融、光纖或高分子聚合 物，內(nèi)徑25 1000iim，長度20 200cm。
全文摘要
本發(fā)明為微管內(nèi)等電聚焦和剪斷吹出培養(yǎng)測定微生物等電點(diǎn)的方法，屬于生物分析領(lǐng)域。本發(fā)明首先將載體兩性電解質(zhì)溶液在毛細(xì)管內(nèi)采用恒定電壓進(jìn)行等電聚焦，使毛細(xì)管內(nèi)形成了連續(xù)pH梯度的兩性電解質(zhì)；然后根據(jù)所加兩性電解質(zhì)形成的pH梯度與毛細(xì)管總長的線性關(guān)系，對毛細(xì)管進(jìn)行等分剪斷；最后對每段微管樣品進(jìn)行菌落培養(yǎng)，根據(jù)有菌落生長的微管在總管長中所處的位置來確定微生物的pH范圍。本發(fā)明測定方法簡單，快速，直觀，該方法不僅可用于各種微生物等電點(diǎn)測定，并可用于微生物菌種的篩選。
文檔編號C12Q1/02GK101556261SQ20091008483
公開日2009年10月14日 申請日期2009年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月25日
發(fā)明者鋒 屈, 蔡波太, 馬文韜 申請人:北京理工大學(xué)