專利名稱：：水稻源抗螟蟲和縱卷葉螟基因rlep1及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別地，涉及一種水稻源抗螟蟲和縱巻葉螟基因iL五i^及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著全球人口的增加和耕地面積的減少，人們對(duì)糧食單產(chǎn)的要求越來(lái)越高。蟲害造成的糧食損失一般約占糧食總產(chǎn)量的10-30%,重災(zāi)年份則顆粒無(wú)收，因此如何減少蟲害以增加糧食總產(chǎn)量，是人們面臨的迫切問題。僅僅依賴化學(xué)農(nóng)藥無(wú)法解決，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道水稻螟蟲對(duì)幾乎所有現(xiàn)在使用的殺蟲劑都產(chǎn)生了或多或少的抗藥性；現(xiàn)在研究和開發(fā)一款新殺蟲劑的費(fèi)用越來(lái)越高，周期也越來(lái)越長(zhǎng)，并且每一個(gè)新的殺蟲劑投入使用幾年后都會(huì)面臨抗藥性產(chǎn)生的問題。培育抗性品種是減少害蟲危害的一個(gè)重要措施，是我國(guó)農(nóng)業(yè)病蟲害綜合防治的重要組成部分，是減少化學(xué)農(nóng)藥施用、減少環(huán)境污染、保證糧食生產(chǎn)安全的重要保障之一。水稻螟蟲和縱巻葉螟是水稻的重要害蟲，稻縱巻葉螟幼蟲取食水稻嫩葉和劍葉，水稻分蘗期、孕穗期受害時(shí)，大大影響水稻光合作用，使生長(zhǎng)受阻；抽穗期劍葉受害對(duì)產(chǎn)量更有直接的影響，造成千粒重降低，秕谷率大幅增加，一般使水稻減產(chǎn)10-15%,重者可達(dá)50%。二化螟幼蟲鉆入葉鞘內(nèi)部為害，隨后轉(zhuǎn)入莖稈，導(dǎo)致水稻枯鞘、枯心、白穗等癥狀，導(dǎo)致10-30%的減產(chǎn)。由于耕作制度的改變，免耕技術(shù)、機(jī)械收割等實(shí)施有利于水稻害蟲越冬，以及濫用農(nóng)藥和單一用藥導(dǎo)致害蟲的抗藥性十分突出，導(dǎo)致從上世紀(jì)末以來(lái)連年大爆發(fā)，危害造成的損失不斷加重，而且呈現(xiàn)北上之勢(shì)。據(jù)全國(guó)農(nóng)技中心調(diào)査，二化螟在江淮、長(zhǎng)江流域、江南大部稻區(qū)連續(xù)大發(fā)生，華南北部、華北和東北稻區(qū)發(fā)生危害明顯上升；從全國(guó)范圍看，二化螟發(fā)生比上世紀(jì)90年代初上升了43%，受災(zāi)嚴(yán)重地區(qū)(如湖南、江西等部分地區(qū))達(dá)到5-10倍；二化螟導(dǎo)致的水稻損失率比90年代初上升了2-3倍，已對(duì)我國(guó)水稻安全生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。有關(guān)水稻對(duì)縱巻葉螟和螟蟲的抗性研究已經(jīng)進(jìn)行了數(shù)十年，雖然國(guó)際水稻研究所通過雜交獲得了幾個(gè)抗螟蟲的水稻品系。但是，至今為止在對(duì)水稻抗縱巻葉螟和螟蟲的分子生物學(xué)機(jī)理未取得突破，尚未有抗性基因被分離和鑒定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種水稻源抗螟蟲和縱巻葉螟基因W五尸/及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種水稻源抗螟蟲和縱巻葉螟基因它具有SEQIDNo.l的DNA序列。一種上述水稻源抗螟蟲和縱巻葉螟基因iL五尸7的編碼蛋白，它包含SEQIDNo.2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQIDNo.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或者添加且具有與SEQIDNo.2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQIDNo.2衍生的蛋白質(zhì)。上述水稻源抗螟蟲和縱巻葉螟基因iI五尸/在轉(zhuǎn)基因植物中和作物育種中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明利用抑制消減雜交mRNA技術(shù)SSH方法和基因芯片技術(shù)分析了水稻在害蟲為害后的差異表達(dá)基因，結(jié)合RT-PCR和RACE技術(shù)分離獲得了水稻源抗螟蟲和縱巻葉螟基因i^五P7;以基因片段合成同位素探針，應(yīng)用Northern雜交方法分析了M￡P(guān)7基因分別在水稻螟蟲和縱巻葉螟取食為害后的表達(dá)情況；通過將RLEP1蛋白與綠色熒光蛋白GFP融合結(jié)合激光共聚焦技術(shù)對(duì)M五尸7基因編碼蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)RLEP1蛋白在葉綠體內(nèi)發(fā)揮蛋白生化功能。利用基因沉默和過量表達(dá)技術(shù)研究了ifL五i^基因的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)/^Ei^基因是水稻抗螟蟲和縱巻葉螟的重要抗蟲基因。該基因的分離與克隆，對(duì)于作物的抗蟲育種，尤其對(duì)水稻的抗螟蟲和縱巻葉螟育種將起到重要的促進(jìn)作用。圖1是/Z^W基因特異PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖2是反義抑制雙元表達(dá)載體pl301-An^I五戶7基因酶切鑒定；圖3是水稻受二化螟為害后^Z^尸/基因基因的表達(dá)情況電泳圖；圖4是基因在水稻染色體上的定位圖；圖5是^^尸7基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位圖6是以基因片段構(gòu)建的反義抑制植物表達(dá)載體質(zhì)粒圖譜；圖7是二化螟取食對(duì)反義抑制基因水稻與正常水稻危害程度比較；圖8是稻縱巻葉螟取食對(duì)反義抑制iL五尸7基因水稻與正常水稻危害程度比較。具體實(shí)施例方式本發(fā)明利用抑制消減雜交技術(shù)SSH和基因芯片檢測(cè)技術(shù)，分析了水稻在害蟲為害后所誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因。并從SSH克隆庫(kù)中分離獲得iL五i^基因片段，分別通過3'-RACE和5'-RACE方法獲得了該基因的5'端和3'端基因序列片段。利用DNAstar軟件，將獲得的5'端、3，端和SSH克隆庫(kù)中分離的基因片段，拼接出iZ^/^基因全長(zhǎng)序列。以此獲得的基因全長(zhǎng)序列為基礎(chǔ)，在5'端和3'端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物RLEP1-F1和RLEP1-R1。提取螟蟲取食為害后的水稻葉片總RNA分離純化出mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板并以RLEP1-F1和RLEP1-R1為引物，用pfli高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得/1^戶/基因序列并連接到TAKARA公司的pMD19-T克隆載體進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證。同位素標(biāo)記i^五尸/基因特異性片段進(jìn)行Northern雜交，結(jié)果證明水稻螟蟲和縱巻葉螟取食誘導(dǎo)iL五尸/基因的表達(dá)。對(duì)基因的開放閱讀框序列編碼的蛋白生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)RLEP1蛋白的N端存在葉綠體信號(hào)肽，預(yù)示該基因可能定位于水稻葉綠體，我們?cè)赗LEP1蛋白的C端連接了一個(gè)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)，構(gòu)成一個(gè)RPH1/EGFP融合蛋白證實(shí)RLEP1蛋白在葉綠體中發(fā)揮生化功能。并且，構(gòu)建了iL五尸/基因的反義、過量表達(dá)載體、RNAi表達(dá)載體，以電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌獲得i^五i^基因的3個(gè)工程菌。通過基因沉默技術(shù)對(duì)iL五P7基因抗水稻螟蟲和縱巻葉螟等生物學(xué)功能進(jìn)行了深入研究。以本實(shí)驗(yàn)建立的水稻愈傷遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了基因反義、RNAi和正義轉(zhuǎn)基因水稻植株。通過生物測(cè)定，證明了iZ^尸/基因是水稻的一個(gè)重要抗水稻螟蟲和縱巻葉螟基因。該基因的分離和克隆以及生物學(xué)功能的分析，對(duì)于作物的抗蟲育種，尤其對(duì)水稻的抗螟蟲、縱巻葉螟育種將起到重要的促進(jìn)作用。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下1.水稻源抗螟蟲和縱巻葉螟基因iLEP/的分離和序列分析利用基因芯片技術(shù)和SSH技術(shù)分析了水稻在二化螟取食為害后的差異表達(dá)基因，獲得害蟲為害誘導(dǎo)的特異表達(dá)基因克隆庫(kù)，并篩選到單克隆L-Y200G6411。測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)此克隆并沒有覆蓋該基因的完整編碼區(qū)。為了獲得該片段的完整編碼區(qū)序列，我們用3'-RACE和5'-RACE技術(shù)擴(kuò)增該片段的3'末端和5'末端片段。根據(jù)L-Y200G6411序列，設(shè)計(jì)用于RACE的正向引物RLEP1-RACE-F和反向引物RLEP1-RACE-R，根據(jù)TaKaRaRace試劑盒方法，以二化螟取食水稻莖稈mRNA為模板合成cDNA第一鏈和第二鏈。以正向引物RLEP1-RACE-F與3'RACE錨定引物P3配對(duì)，反向引物RLEP1-RACE-R與5'RACE錨定引物P5配對(duì)作常規(guī)PCR分別獲得L-Y200G6411的5'RACEPCR片段和3'RACEPCR片段，PCR片段分別經(jīng)PCR片段回收試劑盒純化后，送上海生物工程有限公司測(cè)序，得到L-Y200G6411的5'末端和3'末端序列。以L-Y200G6411的5'末端和3'末端序列信息，分別在5'端和3'端非編碼區(qū)重新設(shè)計(jì)一對(duì)引物RLEP1-F1和RLEP1-R1，并以上面合成的cDNA雙鏈為模板，以TAKARApfb高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段經(jīng)瓊脂糖分離純化后連接入pMD-19克隆載體，挑取4個(gè)克隆送上海生物工程公司測(cè)序驗(yàn)證，每個(gè)克隆分別從正向與反向測(cè)通2次。測(cè)序結(jié)果，用生物信息專業(yè)DNA拼接軟件Conting3.1拼接獲得iL五尸7基因DNA序列(序列表SEQIDNo.l)。根據(jù)該序列的開放閱讀框(ORF)，推算出該基因編碼蛋白的氨基酸序列，如SEQIDNo.2所示。2.iL五P7基因在害蟲為害后的表達(dá)譜分析水稻經(jīng)二化螟(SSB)取食為害0，2，4，8，12，24，48h的莖桿，以及部分時(shí)間點(diǎn)的葉片組織，用Trizol法提取其總RNA，分別將10嗎各時(shí)間點(diǎn)RNA經(jīng)1%甲醛電泳分離后，通過毛細(xì)管上吸的方法轉(zhuǎn)到帶正電尼龍膜上，經(jīng)紫外交聯(lián)固定RNA在膜上。以iI五尸/基因特異性片段合成同位素探針，對(duì)膜進(jìn)行雜交分析。Northern雜交結(jié)果證明^￡戶/在害蟲取食1h就開始誘導(dǎo)表達(dá)，24h后表達(dá)豐度達(dá)到最大(圖3，SSB-S)。此外，在二化螟未直接取食為害的水稻葉片中，也檢測(cè)到iL5i^基因的mRNA被誘導(dǎo)表達(dá)(圖3，SSB-L)。3.虹￡尸7基因編碼蛋白亞細(xì)胞定位ME尸/基因測(cè)序獲得的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)^￡戶/基因定位于水稻第8染色體上(圖4A和B)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)含有葉綠體定位信號(hào)肽。為了證實(shí)基因編碼蛋白定位于葉綠上，我們將iL五尸/基因全編碼序列不含終止密碼子(TGA)插入pEGFP(Clotech，USA)的GFP序列前，再用Xbal將RLEP1-GFP融合序列切下，插入植物表達(dá)載體pCAMBIA1301的CaMV35S'啟動(dòng)子下游和CaMV35S'終止子的上游，該RLEP1-GFP融合表達(dá)載體，命名為pl301-RLEPl-GFP。構(gòu)建的pl301-RLEPl-GFP質(zhì)粒用電擊法導(dǎo)入根瘤農(nóng)桿菌EHA105中，獲得含p1301-RLEP1-GFP的EHA105工程菌株。用注射法將EHA105工程菌注入煙草葉片中，具體實(shí)驗(yàn)步驟*從-80。C冰箱取出保存的pl301-RLEPl-GFP農(nóng)桿菌菌株，在LB平板(20mg/LRif，50-100mg/LKan)劃板，在28。C培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)2天后挑取單克隆，接種到5mlLB培養(yǎng)基(20mg/LRif,50-100mg/LKan)，28°C，250rpm搖床上培養(yǎng)過夜(16h以上)。*取2ml菌液，加入到50mlAAM培養(yǎng)基(20mg/LRif，50-100mg/LKan，100uMAS)，28°C，250rpm搖床上培養(yǎng)至OD600-0.4以上*4°C，4000rpm離心10min，棄上清，沉淀用不含抗生素的AAM培養(yǎng)基(含100uMAS，pH=5.2)重新懸浮，懸浮液的OD600值在0.4-0.7范圍內(nèi)*在煙草葉片的背面用注射器針頭扎一個(gè)小孔，用無(wú)針頭注射器吸0.5mlpl301-RLEPl-GFP農(nóng)桿菌懸浮液*注射器口對(duì)準(zhǔn)煙草葉片背面的小孔，在葉片正面小孔處用手指抵住注射器*緩慢的推進(jìn)注射器活塞桿，可以看到菌液慢慢地經(jīng)小孔往周邊擴(kuò)散*注射后的煙草，在培養(yǎng)箱中26。C黑暗培養(yǎng)24-48h注射的煙草葉片在LEICATCSSP5-DMI6000激光共聚焦顯微鏡中檢測(cè)觀察。葉綠素自發(fā)紅色熒光在488nm激發(fā)光下，500-530nm下觀察；GFP自發(fā)熒光在488nm激發(fā)光，620-700nm下觀察。結(jié)果如圖5所示，表明RLEP1蛋白定位于葉綠體中。圖5中，Ia:紅色亮點(diǎn)為葉綠素自發(fā)熒光；IIa:綠色亮點(diǎn)為GFP融合蛋白自發(fā)熒光；IIIa，葉綠素自發(fā)紅色熒光與和GFP融合蛋白自發(fā)熒光完全重合。4.利用反義、RNAi和過量表達(dá)技術(shù)分析其生物學(xué)功能分別構(gòu)建含CaMV35S組成型啟動(dòng)子的過量表達(dá)、RNAi和反義抑制處E尸/基因表達(dá)載體(圖6)。反義載體構(gòu)建是將iI五戶/的cDNA全長(zhǎng)或片段以PCR擴(kuò)增或內(nèi)切酶酶學(xué)操作亞克隆方法，反方向連接到CaMV35S啟動(dòng)子或其他啟動(dòng)子下游，再在其后添加一段NOS終止子序列，之后將構(gòu)建好的這個(gè)融合序列整體克隆載體中切下，亞克隆到pCAMBIA1301或其他表達(dá)載體上。RNAi載體是將/1￡尸/的cDNA全長(zhǎng)或片段以正、反方向連接在內(nèi)含子兩端，得到重組片段，重組片段連接入pMD-18為基礎(chǔ)的克隆載體，設(shè)計(jì)PCR引物以此重組克隆載體為模板，擴(kuò)增出正向序列-內(nèi)含子-反向序列片段，再連接到pCAMBIA1301表達(dá)在的CaMV35S啟動(dòng)子或其他啟動(dòng)子和NOS終止子之間。過量表達(dá)載體構(gòu)建是將iZ^戶/基因編碼鏈全序列，以平末端方式連接到pCAMBIA1301-35S表達(dá)載體的CaMV35S啟動(dòng)子或其他啟動(dòng)子和NOS終止子之間。構(gòu)建的表達(dá)載體以電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，獲得含有表達(dá)載體的工程農(nóng)桿菌，以本實(shí)驗(yàn)成熟的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因方法侵染水稻愈傷，愈傷經(jīng)抗性篩選后獲得整合了目的基因的愈傷組織，再經(jīng)分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得iL五iV基因反義、RNAi和過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因品系。對(duì)水稻反義抑制虹五i^植株進(jìn)行生物學(xué)功能測(cè)定。二化螟幼蟲分別取食反義抑制iL五尸7轉(zhuǎn)基因水稻和正常非轉(zhuǎn)基因水稻，結(jié)果表明，二化螟初孵幼蟲取食1周后，飼養(yǎng)于反義抑制轉(zhuǎn)基因品系上的SSB幼蟲比在正常水稻上取食的要重。反義抑制i^五戶7轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)二化螟抗性明顯降低，反義抑制虹五戶7轉(zhuǎn)基因水稻接入3齡二化螟幼蟲3天后嚴(yán)重失水，整株苗出現(xiàn)枯萎，還是保持綠色(圖7)。以反義抑制M^P7轉(zhuǎn)基因水稻為食稻縱巻葉螟明顯比以正常非轉(zhuǎn)基因水稻為食的稻縱巻葉螟幼蟲取食量要大，生長(zhǎng)要快，對(duì)水稻葉片損壞程度明顯要重(圖8)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1:全編碼cDNA的獲得1)水稻莖桿RNA的提取、質(zhì)量檢測(cè)及總cDNA第一鏈合成；2)從總cDNA第一連中以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得iL五戶/基因上游引物5'-ATAATACCCATACCATGTTG-3'下游弓I物5'-ATAAAGATTTGGGAGTGACA-3'PCR擴(kuò)增條件95。CX3min—(94°CX40sec—58°CXlmin—72°CX3min)X35循環(huán)一72°CX10min(PCR擴(kuò)增所用Buffer為TAKARAGCbuffer11)，得到特異PCR擴(kuò)增產(chǎn)物見附圖1。3)/JL五P基因序列堿基解析由2)經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分析,割膠回收并純化后在DNA末端轉(zhuǎn)移酶的催化下在兩端添加一個(gè)A堿基，并通過T-A克隆法連接入pMD-19-T載體?？寺〗?jīng)IPTG和X-GAL的LB培養(yǎng)平板藍(lán)白斑篩選，以及PCR鑒定后，送上海生物工程有限公司測(cè)序。用軟件Chromas和Contig對(duì)測(cè)序進(jìn)行拼接獲得序列表中的序列SEQIDNo.l。將此cDNA的基因命名為M五戶7。實(shí)施例2:iL五i^基因表達(dá)譜分析-Northem雜交將各種材料的總RNA熒光法定量后，取lOjag各個(gè)樣品在1.0%的瓊脂糖凝膠上75V電壓電泳60min，在GENE凝膠成像儀成像后，浸泡于0.05M的NaOH中25min，用DEPC處理的ddH20淋洗3-4次，放入10倍體積的20xSSC中，溫和搖動(dòng)45min。用向上毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法，使RNA吸附在帶正電的尼龍膜上，經(jīng)UV交聯(lián)儀交聯(lián)后，80。C烘烤120min固定。探針標(biāo)記按Prime-a-GeneLabelingSyntem(Promega)試齊U盒說(shuō)明書進(jìn)行。因DNA模板25ng，經(jīng)95。C水浴變性5min，立即放冰上冷卻，按表1要求加入相應(yīng)的試劑，加入同位素的操作需在有機(jī)屏擋板后進(jìn)行。25'C反應(yīng)60min后，95。C變性5min，冰上放置5min，備用。表1探針標(biāo)記反應(yīng)《係<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>預(yù)雜交和雜交雜交膜在0.25M磷酸緩沖液(pH7.2)緩沖液中潤(rùn)濕，放入雜交管，加入10ml的預(yù)雜交液(0.5MpH7.2磷酸緩沖液；0.5MpH8.0EDTA;20%SDS;0.1gBSA)，在雜交爐中62-65。C預(yù)雜交1-4小時(shí)。加入iP/^同位素探針，65'C雜交12-18小時(shí)。倒去雜交液，雜交膜在WashsolutionI(lxSSPE，0.5%SDS(W/V))室溫洗脫2次，每次5min;在WashsolutionII(0.2xSSPE，0.1%SDS(W/V))65"C洗2次，每次15min。雜交膜用吸水紙吸干后，用保鮮膜包裹，平整放入磷屏。壓屏2小時(shí)后在臺(tái)風(fēng)掃描儀成像。圖3的結(jié)果表明，二化螟取食誘導(dǎo)Ji^/V基因的表達(dá)，從分子生物學(xué)的角度證明該基因在抗螟蟲防御中起正調(diào)控作用，虹fiP/基因參與水稻對(duì)螟蟲的防御抗性。實(shí)施例3:利用基因沉默技術(shù)研究處五i^基因生物學(xué)功能1)iI五尸7基因反義抑制植物表達(dá)載體pl301-AniLEP/構(gòu)建W五i^基因3'端的一段760bp左右DNA片段用于構(gòu)建反義抑制表達(dá)載體。含5"附HI酶切位點(diǎn)正向引物aniL五尸7-F和含酶切位點(diǎn)的反向引物ani^五PJ-R用來(lái)從iJLE尸7質(zhì)粒模板中擴(kuò)增760bp片段。anJL五i^-F:5'-ggatccCATCTGGGACGCCATCAAG-3'aniL五i^-R:5'-gtcgacATAAAGATTTGGGAGTGACATA-3'擴(kuò)增760bpDNA片段和pCAMBIA1301載體分別都用SamHI和Sa/I雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠分離并割膠回。在T4DNALigase催化下，按目的片段和載體3:1比例于4"C連接24h，轉(zhuǎn)化感受態(tài)TG1細(xì)胞。重組克隆經(jīng)PCR和酶切方法鑒定(圖2)，并送上海生物工程技術(shù)有限公司以肌化￡尸/{引物測(cè)序確定序列是否正確。此反義表達(dá)載體命名為pl301-An虹五尸7。圖2中Line1是以aniLE尸7-F和an虹五/V-R為引物PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；Line2是pCAMBI1301空質(zhì)粒萬(wàn)amHI和&/I酶切；Line3是pl301-AnRLEPl經(jīng)Bamffl和Sail酶切。2)將pl301-AniJI五戶7反義抑制表達(dá)載體，以電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，獲得農(nóng)桿菌工程細(xì)胞系。以農(nóng)桿菌浸染法侵染水稻愈傷組織，在含AS的共培養(yǎng)基上22。C暗培養(yǎng)3天;水稻愈傷轉(zhuǎn)入含有潮霉素的NBDS篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，第1次篩選20天。當(dāng)新的抗性愈傷長(zhǎng)出后，將抗性愈傷從母體上剝離，轉(zhuǎn)入新的篩選培養(yǎng)基NBDS2，一個(gè)抗性愈傷即為一個(gè)株系?？剐杂鷤?jīng)繼代擴(kuò)繁后，在預(yù)分化培養(yǎng)基MS-PG上，26-28。C避光培養(yǎng)7-10天；然后，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基MS-RG，16h光照、26-28'C培養(yǎng)2-3周，愈傷先轉(zhuǎn)綠后分化出r。代植株。3)K代轉(zhuǎn)基因植株獲得的r;代種子，經(jīng)含潮霉素的培養(yǎng)基篩選，去除未含^"反義ii五P7片段的植株，并單株種植。收獲7^代種子，對(duì)每個(gè)單株的種子進(jìn)行鑒定。獲得反義抑制虹五戶7轉(zhuǎn)基因基因的純合品系，用于后面的生物學(xué)功能分析。4)轉(zhuǎn)基因品系和非轉(zhuǎn)基因水稻都進(jìn)行害蟲為害試驗(yàn)，比較害蟲的生長(zhǎng)情況和植株的生存情況，分析iL五Pi的生物學(xué)功能。序列表<110>浙江大學(xué)〈120>水稻源抗螟蟲和縱巻葉螟基因RLEP1及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用<歸2<170〉Patentlnversion3.1〈210>1<211>2873〈212>腿<213〉水稻〈400>1ataatacccataccatgttgcgtcctcagctc犯tcceitctagccaceicgacgacgacga60gcagcagcagcagcacgcagctgttcgcatcctcgtcgtgcatcgctagccttcgccggc120cgtcgtcgtcgtcgtcgtcggtggtcgccgccgcacgccggacgcgggggcaaggtagca180gtcgggttgttgttgtgtgcgcgtcgtcgtcggcgacggcg柳鄉(xiāng)ggagatagttctt240cggacatggcggcggcggcggcggtgcgggtga郷cggtggcgacgatcaaggtcaccg300tcggcgeigttgatcaacaggtcgatcgacatcagggatctcatcggcaggtcgctctccc360tcgagctcgtcagctccgagcttgacgcga卿ccgggaaggagaaagcaactgtgcgga420gctacgcgcacaMgtggacgaCgaCg3tCatagcgtcgtcacctacgaggccgacttcg480acgtgccgagtggattcggccccatcggcgccatcatcgtceiccaacg犯ctccggcagg540agatgttcctcgaggacatcaacctcaccgccagcgatggcgccggcaactccactgtcc600tccccatccgctgcaactcctgggtccaacccaagtccgtcggcgatgagggcacgccta660gcaaacgcatcttcttcgccaacaagacttacttgccggg已cagacgccggcggggctcc720ggagctaccggaagaatgacctccagcaga已gcgcggtgacggcactggcg卿ggg3gg780ccgacgaccgtgtctacgactacgacgtttacaacgaxxtcggtaacccggacsgcaacg840gcgatctcgcccgccccgtccttggcggcacccctaccctcgccgctgcc900gcaccggccgccccccctccctaagtcggagacgagg卿ggc獄gtgt960acgtgccgagggacg鄉(xiāng)agttctcaccggctacttcctccgcaagacgg1020tggggtcggtgctccaggccgccgtgccggcggcgcagtcgctgctcctcgacaagctgei1080aatggaaccttccgttcccgtccttcttcgtcatcgacaagctgttcgaggacggcgtcg1140agcttcccggcgtcgacaagctcaacttcctcgagagcgtcgtgccccgcctgctcgaac1200acctccgcgacacccccgccgagaagatcctccgcttcgaaactccggccs<acatccstaa1260aggacaagttcgcatggctcag卿cgaggagttcgcgagggaaacgctcgctggcatca1320acccgtacgccatcgagctcgtc鄉(xiāng)gaMttccgctgaagagcaagctcgacccggcgg1380<image>imageseeoriginaldocumentpage12</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>PheProTyr290AspProLys305GluGluPheSerProArgArgCys295GlySerAspLysVal355PheSerGluThr310ProGluLysGluAsp325GinAlaAlaValArgThrGlyArgProProSerLysLysLysGlyAsnPro300TyrValProVal315PheLeuArgLysLeu340LysTrpAsnLeuGluAspGlyTyr330AlaAlaGinSerLysLeu370PheLeuGluSerValVal385390ProAlaGluLyslieLeuPro345ProPheProSerPhe360GluLeuProGlyArgAsp320ThrVal335L6UL6ULeu350VallieAspVal375ProArgLeuLeuAspLysAlaGlylie405TrpLeuArgAspArgPheGluArgVal380GluHisLeuArg395ProAlaAsnliePhe365AspLysLeuAsnPheAla420lieAsnProTyrAlalie435440LysLeuAspProAlaValThr410GluPheAlaArgGlu425GluLeuValArgAspThr400GinLys415GluThrLeu430PheProLeuLysSer450ThrAlaAspLeuLeu465GluAlalieSerGin485ValPheLeuProTyr500ArgThrValPheAla455GluGinMetArgLeuPheLysTyrGlyProGlu470LysHisLyslieGlyArgGlu445GluSerAlalieTyrGlySer515AlalieGluLeuArg505LeuMet490SerArg475LeuAla460ValMetThrAspAspThrAspAspLeuAspHisValGlu480PheHisAspLeu495ThrMetThr535ProPhe520ArgProAlaSerThr510ThrLeuGinLeuLeu530TrpArgGinValPheThrProSerThrAspAlaThrMetSerTrpLeuPro540ThrGly525SerGinProGin14545TrpArgMetAlaLys565GluLeulieThrHis580Ala550AlaHisValArgAsnArgGinlielieAla595ArgProHisPheTrpLeuArgArg555AlaHisAspAla570HisCysAlaValThr585SerGluMetHis560GlyHisHis575ProTyrLeuLeu610ArgSerAlaLeulie625ProGinLysTyrLeuSerGluMetHisPro600605TyrThrMetArglieAsnArg615AlaGlyGlylieSer630MetGluLeuSerlie620GluGlu590lieAlaSerSer645ThrGluAlaLeuTrpArgPheAsp660GluAspProThrMetAlaGlu675TyrProPheMaPro665GluSer650AlalieGluArg635ValAlaTyrAspHisGlyLeuGluAsp690LysThrTrpValGin705SerValAlaGlyAla680AspGlyLeuLeuAspLeuValGlyTyrGinArgAlaPheSer640LysLeu655ArgGlyAsn695TyrValAlaArgAla710GluGluLeuGinThrLysAspSerGlyAsp725GlyAspLysLysHis740GluSerLeuAlaAla730AlaPhe715Phelie700TyrTrpTrpLys685TrpProArg670LeuAlalieAspAlalieAspProTrpTrpPro755AlaHisHisAlaAsp745ThrLeuThrThrAlaAsp720ThrGluValArg735LysLeuAlaAla770GlyTyrPheProAsn785GluGluProValAsp805His760ValAsnPheGlyAla775ProSerlieAlalie765TyrPro750ValAspArg790GlyAlaAlaMetGin780ThrValMetGlu810Arg795ArgPheLeuAspTrpVslPheGlyProVal800AsnPro815AspGinAlaLeuArgGluCysPheProSerGinValGinAlaThrVal820825830ValMetAlaValLeuAspValLeuSerSerHisSerThrAspGluGlu835840845TyrLeuGlyGlyGluGinThrArgProTrpAsnSerAspAlaAlaVal850855860GinAlaAlaTyrAspGlyPheAlaAlaArgLeuLysGlulieGluGly865870875880VallieAspGlyArgAsnLysAspArgLysLeuLysAsnArgCysGly885890艦AlaGlylieLeuProTyrGinLeuMetLysProPheSerAspSerGly900905910ValThr1權(quán)利要求1、一種水稻源抗螟蟲和縱卷葉螟基因RLEP1。其特征在于，它具有SEQIDNo.1的DNA序列。2、一種權(quán)利要求1所述水稻源抗螟蟲和縱巻葉螟基因的編碼蛋白。其特征在于，它包含SEQIDNo.2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQIDNo.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或者添加且具有與SEQIDNo.2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQIDNo.2衍生的蛋白質(zhì)。3、一種權(quán)利要求1所述水稻源抗螟蟲和縱巻葉螟基因W五P/在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。4、一種權(quán)利要求1所述水稻源抗螟蟲和縱巻葉螟基因i^五戶7在作物育種中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種水稻源抗螟蟲和縱卷葉螟基因RLEP1及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用，該抗螟蟲和縱卷葉螟基因RLEP1具有SEQIDNo.1的DNA序列。用于反義抑制的載體是將RLEP1的cDNA全長(zhǎng)或片段以反義方式連接到CaMV35S啟動(dòng)子或其他啟動(dòng)子下得到的表達(dá)載體；用于RNAi技術(shù)的載體是將RLEP1的cDNA全長(zhǎng)或片段以正、反方向連接在內(nèi)含子兩端，得到重組片段，再連接到CaMV35S啟動(dòng)子或其他啟動(dòng)子下得到的表達(dá)載體；用于過量表達(dá)的載體是將RLEP1的cDNA全長(zhǎng)連接到CaMV35S啟動(dòng)子或其他啟動(dòng)子下游得到的表達(dá)載體。生物測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化體水稻對(duì)螟蟲和縱卷葉螟基因的抗性產(chǎn)生明顯變化。本發(fā)明將在作物育種，特別是在水稻抗蟲育種中得到廣泛應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N15/29GK101525623SQ200910097049公開日2009年9月9日申請(qǐng)日期2009年3月30日優(yōu)先權(quán)日2009年3月30日發(fā)明者楠任,周國(guó)鑫,婁永根,齊金峰申請(qǐng)人:浙江大學(xué)