專利名稱：定量或檢測dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測的方法等。
背景技術(shù)：
作為對標(biāo)本中所含的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測的方法，例如 有從標(biāo)本提取DNA之后，通過利用DNA聚合酶的DNA合成的鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ；以下有時記為PCR)，從而將具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA擴(kuò)增的檢測方法；使標(biāo)本 中的DNA所具有的目標(biāo)DNA區(qū)域與熒光標(biāo)記了的寡核苷酸雜交的檢測方法等(例如，參考 J. Cataract. Refract. Surg.，2007 ；33 (4) :635_641、Environ. Mol. Mutagen.，1991 ； 18 (4) 259-262)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供對具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA簡便進(jìn)行定量或檢測的方法。S卩，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案[發(fā)明1]一種方法(以下，有時記為本發(fā)明方法)，其是對標(biāo)本中所含的具有目標(biāo)DNA區(qū)域 的DNA進(jìn)行定量或檢測的方法，其特征在于，具有以下工序(1)從標(biāo)本制備要檢測的目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA的第一工序；(2)用DNA甲基化酶對由第一工序制備的DNA進(jìn)行處理的第二工序；(3)從經(jīng)第二工序處理了的DNA制備單鏈甲基化DNA，使該單鏈甲基化DNA與檢測 寡核苷酸結(jié)合，得到被測DNA復(fù)合體的第三工序；(4)使由第三工序得到的被測DNA復(fù)合體與固定化甲基化DNA抗體相結(jié)合，得到檢 測復(fù)合體的第四工序；以及，(5)對由第四工序所得的檢測復(fù)合體中所含檢測寡核苷酸，利用其識別功能進(jìn)行 定量或檢測，從而對上述單鏈DNA中的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測的第五工序。[發(fā)明2]根據(jù)發(fā)明1所述的方法，其中，第三工序中，在得到被測DNA復(fù)合體時，添加反向寡 核苷酸(counter oligonucleotide)。[發(fā)明3]根據(jù)發(fā)明1或2所述的方法，其中，固定化甲基化DNA抗體為甲基胞嘧啶抗體。[發(fā)明4]根據(jù)發(fā)明1 3中任一項所述的方法，其中，DNA甲基化酶為胞嘧啶甲基化酶或 SssI甲基化酶。[發(fā)明5]根據(jù)發(fā)明1 4中任一項所述的方法，其中，標(biāo)本中所含的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA為從RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶而生成的DNA中的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA。[發(fā)明6] 根據(jù)發(fā)明1 5中任一項所述的方法，其中，標(biāo)本為下述任一種生物來源的標(biāo)本，(a)哺乳動物來源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細(xì)胞溶解液或組織溶解液、(b)從選自哺乳動物來源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細(xì)胞溶解液及組織溶解液 的一種中提取的DNA、(c)將從選自哺乳動物來源的組織、細(xì)胞、組織溶解液及細(xì)胞溶解液的一種中提取 的RNA作為模板而制得的DNA、(e)從細(xì)菌、真菌或病毒提取的DNA、或(f)將從細(xì)菌、真菌或病毒提取的RNA作為模板而制得的DNA。[發(fā)明7]根據(jù)發(fā)明1 6中任一項所述的方法，其中，由第一工序得到的上述具有目標(biāo)DNA 區(qū)域的DNA為事先用不以目標(biāo)DNA區(qū)域為識別剪切位點的限制性酶消化處理而得的DNA、合 成寡核苷酸、或精制而成的DNA。[發(fā)明8]根據(jù)發(fā)明1 7中任一項所述的方法，檢測寡核苷酸的識別功能是以下任一種的 識別功能。(a) FITC的熒光檢測、或(b)利用FITC抗體的檢測[發(fā)明9]根據(jù)發(fā)明1 8所述的任一項所述的方法，其中，檢測寡核苷酸包括人基因組中的 重復(fù)序列、重復(fù)基因或假基因的堿基序列或者能夠與其一部分相互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列。[發(fā)明10]根據(jù)發(fā)明9所述的方法，其中，人基因組中的重復(fù)序列為LINE或SINE。[發(fā)明11]根據(jù)發(fā)明1 10中任一項所述的方法，其中，檢測寡核苷酸包括能夠與以下所示 任一種堿基序列相互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列。(1)序列編號37所示的堿基序列或與其有80%以上序列一致性(sequence identity)的堿基序列、(2)序列編號37所示堿基序列的互補(bǔ)序列或與其有80%以上序列一致性的堿基 序列、(3)序列編號39所示的堿基序列或與其有80%以上序列一致性的堿基序列、或(4)序列編號39所示堿基序列的互補(bǔ)序列或與其有80%以上序列一致性的堿基 序列。[發(fā)明12]根據(jù)發(fā)明1 10中任一項所述的方法，其中，檢測寡核苷酸包括以下所示的任一 種的堿基序列。(1)序列編號38所示的堿基序列或與其有80%以上序列一致性的堿基序列、(2)序列編號38所示堿基序列的互補(bǔ)序列或與其有80%以上序列一致性的堿基序列、(3)序列編號40所示的堿基序列或與其有80%以上序列一致性的堿基序列、或(4)序列編號40所示堿基序列的互補(bǔ)序列或與其有80%以上序列一致性的堿基 序列[發(fā)明13]根據(jù)發(fā)明1 12中任一項所述的方法，其中，第一工序中，在用于從標(biāo)本制備DNA 的DNA提取操作中所使用的溶液中的鈉鹽的濃度為IOOmM以上IOOOmM以下。[發(fā)明14]根據(jù)發(fā)明1 12中任一項所述的方法，其中，第一工序中，在用于從標(biāo)本制備DNA 的DNA提取操作中所使用的溶液中的鈉鹽的濃度為IOOmM以上200mM以下。[發(fā)明15]一種方法，其是篩選癌患者來源標(biāo)本的方法，其中，包括以下工序通過發(fā)明1 14中任一項所述的方法使用被檢者來源的標(biāo)本而定量或檢測的DNA 的定量結(jié)果或檢測結(jié)果，與通過相同方法使用健康者來源標(biāo)本而定量或檢測的DNA的定量 結(jié)果或檢測結(jié)果之間的差異如有顯著性意義，則將被檢者來源標(biāo)本評價為癌患者來源標(biāo) 本，根據(jù)該評價結(jié)果來指定癌患者來源標(biāo)本。[發(fā)明16]根據(jù)發(fā)明15所述的方法，其中，標(biāo)本為哺乳動物來源的血清。[發(fā)明17]根據(jù)發(fā)明15 16中任一項所述的方法，其中，具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA為哺乳動 物來源血清中的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的游離DNA。


圖1是顯示實施例1中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端FITC 標(biāo)記寡核苷酸Fl而實施結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶液A(10ng/10 μ L TE緩沖液)、 溶液 Bdng/lOyL TE 緩沖液)、溶液 C(0. Ing/lOyL TE 緩沖液)、溶液 D (Ong/lO μ L TE 緩 沖液(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm)測得DNA量的值。圖2是顯示在實施例2中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體0.5μ g/mL及5’末 端FITC標(biāo)記寡核苷酸Fl進(jìn)行實施后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶液MA(10ng each/20 μ L TE緩沖液)、溶液MB(lng each/20 μ L TE緩沖液)、溶液MC(0. Ing each/20 μ L TE緩沖液)、溶液MD (Ong each/20 μ L TE緩沖液(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm) 測定的DNA量的值。 圖3是顯示在實施例3中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體0. 5μ g/mL及5’末 端FITC標(biāo)記寡核苷酸F2進(jìn)行實施后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶液MA(10ng each/20 μ L TE緩沖液)、溶液MB (lng each/20 μ L TE緩沖液)、溶液MC(0. Ing each/20 μ L TE緩沖液)、溶液MD (Ong each/20 μ L TE緩沖液(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm) 測定的DNA量的值。圖4是顯示在實施例4中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體0.5yg/mL及5’末 端FITC標(biāo)記寡核苷酸Fl及F2進(jìn)行實施后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶液MA(10ng each/20 μ L TE 緩沖液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖液)、溶液 MC (0· Ing each/20 μ L TE緩沖液)、溶液MD (Ong each/20 μ L TE緩沖液(陰性對照液))，顯示利用吸 光度(450nm))測定的DNA量的值。圖5是顯示在實施例5中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端 FITC標(biāo)記寡核苷酸F3進(jìn)行實施后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶液A(10ng/10yL TE緩沖液)、溶液Bdng/lOyL TE緩沖液)、溶液C(0. lng/10 μ L TE緩沖液)、溶液 D (0ng/10 μ L TE緩沖液(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm)測定的DNA量的值。圖6是顯示在實施例6中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體0. 5μ g/mL及5’末 端FITC標(biāo)記寡核苷酸F3進(jìn)行實施后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶液MA(10ng each/20 μ L TE 緩沖液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖液)、溶液 MC (Ong each/20 μ L TE緩沖液(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm)測定的DNA量的值。圖7是顯示在實施例7中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端 FITC標(biāo)記寡核苷酸F3及F4進(jìn)行實施后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶液MA(IOng each/20 μ L TE 緩沖液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖液)、溶液 MC (Ong each/20 μ L TE緩沖液(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm)測定的DNA量的值。圖8是顯示在實施例8中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端 FITC標(biāo)記寡核苷酸F5進(jìn)行實施后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶液A(100ng/5yL TE緩沖液)、溶液B(10ng/5l·! L TE緩沖液)、溶液C(lng/5l·! L TE緩沖液)、溶液D(0ng/5l·! L TE緩沖液(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm)測定的DNA量的值。圖9是顯示在實施例9中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端 FITC標(biāo)記寡核苷酸F6進(jìn)行實施后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶液A(100ng/5yL TE緩沖液)、溶液B(10ng/5l·! L TE緩沖液)、溶液C(lng/5l·! L TE緩沖液)、溶液D(0ng/5l·! L TE緩沖液(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm)測定的DNA量的值。圖10是顯示在實施例10中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端 FITC標(biāo)記寡核苷酸F3進(jìn)行實施后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶液A(10ng/10yL TE緩沖液)、溶液Bdng/lOyL TE緩沖液)、溶液C(0. lng/ΙΟμ L TE緩沖液)、溶液 D (0ng/10 μ L TE緩沖液(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm)測定的DNA量的值。圖11是顯示在實施例11中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末 端FITC標(biāo)記寡核苷酸F3進(jìn)行實施后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶液MA(10ng each/20 μ L TE 緩沖液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖液)、溶液 MC (Ong each/20 μ L TE緩沖液(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm)測定的DNA量的值。圖12是顯示在實施例12中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末 端FITC標(biāo)記寡核苷酸F4進(jìn)行實施后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶液MA(10ng each/20 μ L TE 緩沖液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖液)、溶液 MC (Ong each/20 μ L TE緩沖液(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm)測定的DNA量的值。圖13是顯示在實施例13中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端 FITC標(biāo)記寡核苷酸F3及F4進(jìn)行實施后的結(jié)果的示圖。從右開始法分別依次對溶液MA(10ng each/20 μ L TE 緩沖液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖液)、溶液 MC (Ong each/20 μ L TE緩沖液(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm)測定的DNA量的值。
圖14是顯示在實施例14中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端 FITC標(biāo)記寡核苷酸F5進(jìn)行實施后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶液A(100ng/5yL TE緩沖液)、溶液B(10ng/5l·! L TE緩沖液)、溶液C(lng/5l·! L TE緩沖液)、溶液D(0ng/5l·! L TE緩沖液(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm)測定的DNA量的值。
圖15是顯示在實施例15中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端 FITC標(biāo)記寡核苷酸F6進(jìn)行實施后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶液A(100ng/5yL TE緩沖液)、溶液B(10ng/5l·! L TE緩沖液)、溶液C(lng/5l·! L TE緩沖液)、溶液D(0ng/5l·! L TE緩沖液(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm)測定的DNA量的值。圖16是顯示在實施例16中沒有進(jìn)行處理1而使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體和 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F6來實施DNA的檢測后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶 液A (10ng/10 μ L大鼠血清溶液)、溶液B(lng/10 μ L大鼠血清溶液)、溶液C(0. lng/10 μ L 大鼠血清溶液)、溶液D(大鼠血清(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm)測定的DNA 量的值。圖17是顯示在實施例16中沒有進(jìn)行處理2而使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體和 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F6來實施DNA的檢測后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶 液A (10ng/10 μ L大鼠血清溶液)、溶液B (lng/10 μ L大鼠血清溶液)、溶液C(0. lng/10 μ L 大鼠血清溶液)、溶液D(大鼠血清(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm)測定的DNA
量的值。圖18是顯示在實施例17中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體和5’末端FITC標(biāo)記 寡核苷酸F6來實施DNA的檢測后的結(jié)果的示圖。從右開始分別依次對溶液A(4ng/40 μ L 人血清溶液)、溶液B (2ng/40 μ L人血清溶液)、溶液C (lng/40 μ L人血清溶液)、溶液D (人 血清(陰性對照液))，顯示利用吸光度(450nm)測定的DNA量的值。圖19是顯示將在實施例18中使用生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體和5’末端FITC標(biāo) 記寡核苷酸F6檢測的結(jié)果與利用實時PCR定量了的結(jié)果相比較的示圖。圖中，將檢測結(jié)果 示于縱軸，將利用實時PCR的定量結(jié)果示于橫軸，進(jìn)行繪圖。另外，圖中的直線顯示回歸直 線(粗線)以及標(biāo)準(zhǔn)誤差范圍(細(xì)線)。圖20是顯示將在實施例18中對57歲以下的人血清樣品使用生物素標(biāo)記甲基胞 嘧啶抗體和5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F6檢測的DNA的結(jié)果分為癌患者和健康者繪制的 圖，分別對其顯示平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
具體實施例方式本發(fā)明方法中的“標(biāo)本”，可例舉如(a)哺乳動物來源的血液、體液、糞尿、體分泌 物、細(xì)胞溶解液或組織溶解液、(b)從選自哺乳動物來源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細(xì)胞 溶解液及組織溶解液的任一種中提取的DNA、(c)將從選自哺乳動物來源的組織、細(xì)胞、組 織溶解液及細(xì)胞溶解液的任一種中提取的RNA作為模板制得的DNA、(e)從細(xì)菌、真菌或病 毒提取的DNA、(f)將從細(xì)菌、真菌或病毒提取的RNA作為模板制得的DNA等。上述組織是 指包括血液、淋巴結(jié)等廣泛的含義?！安溉閯游铩笔潜环诸悶閯游锝缂顾鲃游镩T脊椎動物亞門哺乳綱(Mammalia)的動 物，具體可例舉如人、猴、狨、豚鼠、大鼠、小鼠、牛、綿羊、犬、貓等。
“體液”是指在構(gòu)成個體的細(xì)胞間存在的液體，具體可例舉如血漿和間質(zhì)液，在大 多數(shù)情況下，起到維持個體的恒定性的功能。更具體可例舉如淋巴液、組織液(組織間液、 細(xì)胞間液、間質(zhì)液)、體腔液、漿膜腔液、胸水、腹水、心包液、腦脊髓液(髓液)、關(guān)節(jié)液(滑 液)、眼房水(房水)、腦脊髓液等?！绑w分泌物”是指 來自外分泌腺的分泌液，具體可例舉如唾液、胃液、膽汁、胰液、腸 液、汗、淚、鼻涕、精液、陰道分泌液、羊水、乳汁等。在標(biāo)本為人的血液、體液或體分泌物等時，可以利用在人的定期健康診斷中的臨 床檢查用中所采用的試料。作為“細(xì)胞溶解液”，可例舉如將利用細(xì)胞培養(yǎng)用板等培養(yǎng)而得的細(xì)胞例如細(xì)胞 株、原代培養(yǎng)細(xì)胞、或血細(xì)胞等破碎而得的包括細(xì)胞內(nèi)液的溶解液。作為將細(xì)胞破碎的方 法，可例舉如利用超聲波的方法、使用表面活性劑的方法、使用堿溶液的方法等。為了將細(xì) 胞溶解，也可以利用市售的試劑盒等。例如，利用IOcm板培養(yǎng)細(xì)胞直到融合后，棄去培養(yǎng)液，向該板中加入0.6mL 的RIPA緩沖液(1 X TBS, 1 %諾乃洗滌劑(nonidet) P-40,0. 5 %脫氧膽酸鈉(sodium deoxysholate) ,0. 1 % SDS，0· 004%疊氮化鈉(sodium azide))。在 4°C將板緩慢搖動 15 分 鐘后，利用刮具等將該板上的粘附細(xì)胞剝離，將該板上的液體轉(zhuǎn)移到微型管中。添加該液體 的1/10容量的lOmg/mL PMSF之后，將該管在冰上放置30-60分鐘之后，在4°C以10000 X g 離心10分鐘，取得上清液作為細(xì)胞溶解液。作為“組織溶解液”可例舉如通過將從哺乳動物等動物采取的組織中的細(xì)胞破壞 而取得的包括細(xì)胞內(nèi)液的溶解液。具體而言，測定從動物取得的組織的重量后，使用剃刀等將該組織剪切成小片。如 使用冷凍組織時，需要切成更小的小片。剪切后，以每Ig組織為3mL的比率，添加冰冷RIPA 緩沖液，在4°C進(jìn)行均質(zhì)加工。在此，也可以向RIPA緩沖液中，加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑 制劑等，例如，也可以添加RIPA緩沖液的1/10容量的lOmg/mL PMSF。在均質(zhì)中，使用超聲 波破碎器、加壓型細(xì)胞破碎裝置。在均質(zhì)的操作中，以將均質(zhì)液恒定地維持在4°C，抑制發(fā)熱 的方式進(jìn)行。將均質(zhì)液轉(zhuǎn)移到微型管，在4°C以IOOOOXg離心10分鐘，取得上清液作為組 織溶解液。作為本發(fā)明方法中的“標(biāo)本”，可例舉如從食品、河川、土壤或一般市售制品采取的 試料、表面附著物等，可以包括真菌、細(xì)菌、病毒等微生物、它們的核酸。對于作為標(biāo)本而使用的DNA，可例舉如可以從上述生體試料、上述微生物提取的基 因組DNA、基因組DNA來源的DNA斷片或RNA等。從哺乳動物來源的試料獲得基因組DNA的 過程中，可以使用例如市售的DNA提取用試劑盒等。另外，為了從RNA獲得DNA，可以使用市 售的cDNA制造試劑盒等逆轉(zhuǎn)錄酶。另外，作為標(biāo)本，也可以使用人工合成的DNA。本發(fā)明方法中“目標(biāo)DNA區(qū)域”(以下，有時也記為目標(biāo)區(qū)域)是指，在標(biāo)本中所 含的DNA中，希望通過本發(fā)明方法來檢測或定量的DNA區(qū)域。當(dāng)標(biāo)本為DNA時，目標(biāo)DNA區(qū) 域以DNA上的堿基序列表示。當(dāng)標(biāo)本為RNA時，目標(biāo)DNA區(qū)域以從RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶制得的 DNA上的堿基序列表示，是與RNA上的成為檢測對象的規(guī)定堿基序列相互補(bǔ)的堿基序列。本 發(fā)明方法中，將胞嘧啶甲基化進(jìn)行檢測或定量時，目標(biāo)區(qū)域優(yōu)選包含富有胞嘧啶或后述CpG 的區(qū)域。
第一工序為從標(biāo)本中制備要檢測目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA的工序。作為由第一工序制備的DNA，可例舉如用不以該DNA具有的目標(biāo)DNA區(qū)域為識別剪 切位點的限制性酶事先消化處理了的DNA試料、事先精制了的DNA試料、血液中的游離DNA、 微生物基因組來源的DNA、及從標(biāo)本中的RNA利用逆轉(zhuǎn)錄酶制得的DNA等。作為由第一工序 制備的DNA，也可例舉為根據(jù)標(biāo)本的基因信息設(shè)計而人工合成了的DNA。將血液作為標(biāo)本使用時，根據(jù)通常的方法從血液制備血漿或血清，將制備的血漿 或血清作為標(biāo)本，分析其中含有的游離DNA(含有胃癌細(xì)胞等癌細(xì)胞來源的DNA)，則可以避 開血細(xì)胞來源的DNA而分析胃癌細(xì)胞等癌細(xì)胞來源的DNA，可以使檢測胃癌細(xì)胞等癌細(xì)胞、 含有其的組織等的靈敏度提高。作為在第一工序中制備的DNA，可例舉如革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌等細(xì) 菌、真菌、病毒、病原性原蟲等微生物等來源的DNA、從該微生物等來源RNA通過逆轉(zhuǎn) 錄酶而獲得的DNA。例如，從生殖器支原體(Mycoplasma genitalium)、肺炎支原體 (Mycoplasma pneumoniae)、布氏疏螺方寵體 B31 (Borrelia burgdorferi B31)、普氏立 克次氏體(Rickettsia prowazekii)、蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)、月市炎衣 原體(Chlamydia pneumoniae)、沙目艮衣原體(Chlamydia trachomatis)、幽門螺桿菌 J99 (Helicobacter pylori J99)、幽門螺桿菌 26695、流感嗜血桿菌 Rd (Haemophilus influenzae Rd)、結(jié)核分支桿菌 H37Rv (Mycobacterium tuberculosis H37Rv)、銅綠假單 胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、侵月市軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、粘質(zhì)沙雷氏 菌(Serratia marcescens)、大腸桿菌(Escherichia coli)、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌 (Listeria monocytogenes)、J 夕少 |、二 ft 胃(Salmonella enterica) >ffiff ^2SJSM ft (Campylobacter jejuni subsp. Jejuni)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) > 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、蠟狀芽孢桿菌(Baci llusu cereus)、肉毒梭 菌(Clostridium botulinum)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、結(jié)腸耳口氏菌 (Yersinia enterocolitica)、假結(jié)核耳口氏菌(Yersinia pseudotuberuculosis)、紅色毛 癬菌(Trichophyton ruburum)、須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、白色念珠 菌(Candida albicans)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、煙曲霉菌(Aspergi Ilus fumigatus)、卡市肺包子蟲(Pneumocystis carinii)、粗球抱子菌(Coccidioides immitis)、細(xì)胞巨化病毒(Cytomegalovirus)、人皰疫病毒 5 (human herpesvirus 5)、埃 巴病毒(Epstein-Barr virus)、人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)、人 乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus)、腸病毒(Enterovirus)、諾如病毒(Norovirus)、 流感病毒(Influenza Virus)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)、小球隱孢子蟲 (Cryptosporidium parvum)、溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)的基因組 DNA 或 從RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶制備的DNA可以利用到標(biāo)本中的感染癥治病菌、或食品中的食中毒治 病菌等的檢測中。在制備基因組DNA中，例如，當(dāng)標(biāo)本為哺乳動物來源的試料時，可以使用市售的 DNA提取用試劑盒(Genfind v2 Kit (貝克曼庫爾特公司制)、FastPure DNA試劑盒(寶生 物株式會社制))等。標(biāo)本為真菌等微生物時，可以通過“Methods in Yeast Genetics”(Cold Spring Harbor Laboratory Press)記載的一般的酵母基因組的制備方法來制備基因組DNA，標(biāo)本為大腸菌之類的原核生物時，可以使用“Molecular Cloning-Α Laboratory Manual-"(Co Id Spring Harbor Laboratory Press)中記載的一般的微生物基因組制備方法等。
另外，標(biāo)本為食品試料時，也可以將微生物等從食品分離后來制備DNA，也可以同 時獲取食品中所含的微生物以外的基因組DNA和微生物來源的基因組。另外，當(dāng)標(biāo)本為哺 乳動物來源的組織、目標(biāo)DNA區(qū)域為病毒來源的DNA時，也可以使用市售的RNA提取用試 劑盒(IS0GEN(311-02501)(日本基因公司制)、或者FastRNA Pro Green Kit (船越公司 制)、FastRNA Pro Blue Kit (船越公司制)、FastRNA Pro Red Kit (船越公司制)等)等 從組織中提取RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶來獲得DNA。另外，當(dāng)標(biāo)本為哺乳動物來源的標(biāo)本時，也可 以提取病毒粒子之后再提取病毒的DNA，或者也可以提取病毒粒子之后，使用市售的試劑盒 (QuickGene RNA tissue kit S II、富士膠片公司制)等提取病毒RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶來獲 得病毒來源的DNA。也可以從病毒感染了的組織提取RNA，再利用逆轉(zhuǎn)錄酶獲得病毒來源的 DNA，也可以從病毒感染了的組織獲得DNA，再獲得病毒來源的DNA。另外，利用逆轉(zhuǎn)錄酶從 RNA獲得DNA時，可以使用市售的試劑盒(轉(zhuǎn)錄物高精度cDNA合成試劑盒(Transcripter high fidelity cDNA synthesis kit)、羅氏診斷公司制)等?！凹谆疍NA”中，構(gòu)成基因(基因組DNA)的4種堿基的任意種被甲基化。例如， 在哺乳動物中已知有5’-CG-3’所示的堿基序列(C表示胞嘧啶，G表示鳥嘌呤。以下，也可 以將該堿基序列記為“CpG”)中僅胞嘧啶被甲基化的現(xiàn)象。胞嘧啶的甲基化部位為5位。 在細(xì)胞分裂之前進(jìn)行DNA復(fù)制時的新生雙鏈DNA中，為母細(xì)胞來源的模板鏈中的“CpG”中 僅胞嘧啶為甲基化的狀態(tài)，在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下立即將新生鏈的“CpG”中的胞嘧啶也甲 基化。該胞嘧啶甲基化將與母細(xì)胞來源的DNA鏈中的包括甲基化了的胞嘧啶的CpG相互補(bǔ) 結(jié)合的新生DNA鏈的CpG的胞嘧啶甲基化。因此，母細(xì)胞的DNA的甲基化狀態(tài)在DNA復(fù)制 后也被直接傳給新的2組DNA。本發(fā)明中的“CpG對”是指CpG所示的堿基序列和與其相互 補(bǔ)的CpG結(jié)合而成的雙鏈DNA?！皢捂溂谆疍NA”是指單鏈DNA的堿基序列中的5 ’ -CG-3 ’所示的堿基序列中胞 嘧啶的5位被甲基化了的單鏈DNA。作為“目標(biāo)DNA區(qū)域”，可例舉如賴氨酰氧化酶(Lysyl oxidase)、HRAS樣阻抑 因子(HRAS-like suppressor)、bA305P22. 2. 1、Y-細(xì)絲蛋白(Gamma filamin)、HANDl、 RIKEN2210016F16 的同系物(Homologue of RIKEN2210016F16)、FLJ32130、PPARG 血管生成 素相關(guān)蛋白(PPARG angiopoiet in-related protein)、凝血調(diào)節(jié)蛋白(Thrombomodulin)、 p53-應(yīng)答基因 2(p53-responsive gene 2)、微纖維蛋白 2 (Fibrillin〗)、神經(jīng) 絲蛋白3 (Neurofilaments)、解聚素及金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域23 (disintegrin and metalloproteinase domain 23)、G-蛋白偶聯(lián)受體 7 (G protein-coupled receptor 7)、 G-蛋白偶聯(lián)生長抑素及血管緊張素樣肽受體(G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide rec印tor)、溶質(zhì)載體蛋白家族6神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白去甲腎上 腺素成員 2 (Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2)等有用蛋白質(zhì)基因的啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)等，可以 優(yōu)選例舉在這些堿基序列中存在的含有一個以上CpG的DNA區(qū)域。本發(fā)明方法中，也可以 分別檢測或定量“目標(biāo)DNA區(qū)域”的甲基化后的DNA，但如果例如在1個檢測系中，檢測更多 的“目標(biāo)DNA區(qū)域”的甲基化了的DNA，則可以相應(yīng)地提高定量精度及檢測靈敏度。
具體而言，例如有用蛋白質(zhì)基因為賴氨酰氧化酶基因時，作為在其啟動子區(qū)域、非 翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG的堿基序列，可 以舉出含有人來源的賴氨酰氧化酶基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動子區(qū)域的基因 組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出用序列編號1表示的堿基序列(相當(dāng)于基因庫 檢索號No. AF270645記載的堿基序列的堿基編號16001 18661所示的堿基序列)。就序 列編號1所示的堿基序列而言，對人來源的賴氨酰氧化酶蛋白質(zhì)的氨基末端的蛋氨酸進(jìn)行 編碼的ATG密碼子，用堿基編號2031 2033表示，上述外顯子1的堿基序列用堿基編號 1957 2661表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為HRAS樣阻抑因子基因的情況下，作為 在其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上 CpG的堿基序列，可以舉出含有人來源的HRAS樣阻抑因子基因的外顯子1和位于其5’上游 的啟動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出用序列編號2表示的堿基序 列(相當(dāng)于基因庫檢索號No. AC068162記載的堿基序列的堿基編號172001 173953表示 的堿基序列)。就序列編號2表示的堿基序列而言，人來源的HRAS樣阻抑因子基因的外顯 子1的堿基序列用堿基編號1743 1953表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為bA305P22. 2. 1基因的情況下，作為在 其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG 的堿基序列，可以舉出含有人來源的bA305P22. 2. 1基因的外顯子1和位于其5’上游的啟 動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號3表示的堿基序列(相 當(dāng)于基因庫檢索號No. AL121673記載的堿基序列的堿基編號13001 13889表示的堿基序 列)。就序列編號3表示的堿基序列而言，對人來源的bA305P22. 2. 1蛋白質(zhì)的氨基末端的 蛋氨酸進(jìn)行編碼的ATG密碼子，用堿基編號849 851表示，上述外顯子1的堿基序列用堿 基編號663 889表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為Y-細(xì)絲蛋白基因的情況下，作為在其 啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG 的堿基序列，可以舉出含有人來源的Y-細(xì)絲蛋白基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動 子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號4表示的堿基序列(相當(dāng) 于基因庫檢索號No. AC074373記載的堿基序列的堿基編號63528 64390表示的堿基序列 的互補(bǔ)序列)。就序列編號4表示的堿基序列而言，對人來源的Y-細(xì)絲蛋白質(zhì)的氨基末端 的蛋氨酸進(jìn)行編碼的ATG密碼子，用堿基編號572 574表示，上述外顯子1的堿基序列用 堿基編號463 863表示。 另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為HANDl基因的情況下，作為在其啟動子 區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG的堿基 序列，可以舉出含有人來源的HANDl基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動子區(qū)域的基因 組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號5表示的堿基序列(相當(dāng)于基因庫檢 索號No. AC026688記載的堿基序列的堿基編號24303 26500表示的堿基序列的互補(bǔ)序 列)。就序列編號5表示的堿基序列而言，對人來源的HANDl蛋白質(zhì)的氨基末端的蛋氨酸進(jìn) 行編碼的ATG密碼子，用堿基編號1656 1658表示，上述外顯子1的堿基序列用堿基編號 1400 2198表示。
另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為RIKEN2210016F16基因的同系物的情 況下，作為在其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含 有一個以上CpG的堿基序列，可以舉出含有人來源的RIKEN2210016F16基因的同系物的外 顯子1和位于其5’上游的啟動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序 列編號6表示的堿基序列(相當(dāng)于基因庫檢索號No. AL354733記載的堿基序列的堿基編 號157056 159000表示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列)。就序列編號6表示的堿基序列而 言，人來源的RIKEN2210016F16蛋白質(zhì)的同系物的外顯子1的堿基序列用堿基編號1392 1945表示。
另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為FLJ32130基因的情況下，作為在其啟 動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG的 堿基序列，可以舉出含有人來源的FLJ32130基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動子區(qū) 域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號7表示的堿基序列(相當(dāng)于基 因庫檢索號No. AC002310記載的堿基序列的堿基編號1 2379表示的堿基序列的互補(bǔ)堿 基序列)。就序列編號7表示的堿基序列而言，對人來源的FLJ32130蛋白質(zhì)的氨基酸末端 的蛋氨酸進(jìn)行編碼的ATG密碼子，用堿基編號2136 2138表示，認(rèn)為是上述外顯子1的堿 基序列用堿基編號2136 2379表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為PPARG血管生成素相關(guān)蛋白基因的情 況下，作為在其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有 一個以上CpG的堿基序列，可以舉出含有人來源的PPARG血管生成素相關(guān)蛋白基因的外顯 子1和位于其5’上游的啟動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列 編號8表示的堿基序列。就序列編號8表示的堿基序列而言，對人來源的PPARG血管生成 素相關(guān)蛋白質(zhì)的氨基末端的蛋氨酸進(jìn)行編碼的ATG密碼子，用堿基編號717 719表示，上 述外顯子1的5’側(cè)部分的堿基序列用堿基編號1957 2661表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為凝血調(diào)節(jié)蛋白基因的情況下，作為在其 啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG 的堿基序列，可以舉出含有人來源的凝血調(diào)節(jié)蛋白基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動 子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號9表示的堿基序列(相 當(dāng)于基因庫檢索號No. AF495471記載的堿基序列的堿基編號1 6096表示的堿基序列)。 就序列編號9表示的堿基序列而言，對人來源的凝血調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的氨基末端的蛋氨酸進(jìn)行 編碼的ATG密碼子，用堿基編號2590 2592表示，上述外顯子1的堿基序列用堿基編號 2048 6096表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為P53-應(yīng)答基因2基因的情況下，作為在 其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG 的堿基序列，可以舉出含有人來源的P53-應(yīng)答基因2基因的外顯子1和位于其5’上游的 啟動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號10表示的堿基序列 (相當(dāng)于基因庫檢索號No. AC009471記載的堿基序列的堿基編號113501 116000表示的 堿基序列的互補(bǔ)序列。)。就序列編號10表示的堿基序列而言，人來源的p53-應(yīng)答基因2 基因的外顯子1的堿基序列用堿基編號1558 1808表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為微纖維蛋白2基因的情況下，作為在其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG 的堿基序列，可以舉出含有人來源的微纖維蛋白2基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動 子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號11表示的堿基序列(相 當(dāng)于基因庫檢索號No. ACl 13387記載的堿基序列的堿基編號118801 121000表示的堿基 序列的互補(bǔ)序列)。就序列編號11表示的堿基序列而言，人來源的微纖維蛋白2基因的外 顯子1的堿基序列用堿基編號1091 1345表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為神經(jīng)絲蛋白3基因的情況下，作為在其 啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG 的堿基序列，可以舉出含有人來源的神經(jīng)絲蛋白3基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動 子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號12表示的堿基序列(相 當(dāng)于基因庫檢索號No. AF106564記載的堿基序列的堿基編號28001 30000表示的堿基序 列的互補(bǔ)序列)。就序列編號12表示的堿基序列而言，人來源的神經(jīng)絲蛋白3基因的外顯 子1的堿基序列用堿基編號614 1694表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為解聚素及金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域23基因的 情況下，作為在其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含 有一個以上CpG的堿基序列，可以舉出含有人來源的解聚素及金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域23基因的 外顯子1和位于其5’上游的啟動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出 序列編號13表示的堿基序列(相當(dāng)于基因庫檢索號No. AC009225記載的堿基序列的堿基 編號21001 23300表示的堿基序列)。就序列編號13表示的堿基序列而言，人來源的解 聚素及金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域23基因的外顯子1的堿基序列，用堿基編號1194 1630表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為G蛋白偶聯(lián)受體7基因的情況下，作為 在其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上 CpG的堿基序列，可以舉出含有人來源的G蛋白偶聯(lián)受體7基因的外顯子1和位于其5’上 游的啟動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號14表示的堿基 序列(相當(dāng)于基因庫檢索號No. AC009800記載的堿基序列的堿基編號75001 78000表示 的堿基序列)。就序列編號14表示的堿基序列而言，人來源的G蛋白偶聯(lián)受體7基因的外 顯子1的堿基序列，用堿基編號1666 2652表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為G-蛋白偶聯(lián)生長抑素及血管緊張素樣 肽受體基因的情況下，作為在其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序 列中存在的含有一個以上CpG的堿基序列，可以舉出含有人來源的G-蛋白偶聯(lián)生長抑素及 血管緊張素樣肽受體基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序 列，更具體而言，可以舉出序列編號15表示的堿基序列(相當(dāng)于基因庫檢索號NO.AC008971 記載的堿基序列的堿基編號57001 60000表示的堿基序列的互補(bǔ)序列)。就序列編號15 表示的堿基序列而言，人來源的G-蛋白偶聯(lián)生長抑素及血管緊張素樣肽受體基因的外顯 子1的堿基序列，用堿基編號776 2632表示。 另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為溶質(zhì)載體家族6神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白去 甲腎上腺素成員2基因的情況下，作為在其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū) 域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG的堿基序列，可以舉出含有人來源的溶質(zhì)載體 家族6神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白去甲腎上腺素成員2基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號16表示的堿基序列(相當(dāng) 于基因庫檢索號No. AC026802記載的堿基序列的堿基編號78801 81000表示的堿基序列 的互補(bǔ)序列)。就序列編號16表示的堿基序列而言，人來源的溶質(zhì)載體家族6神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn) 運蛋白去甲腎上腺素成員2基因的外顯子1的堿基序列，用堿基編號1479 1804表示。

第二工序是用DNA甲基化酶對由第一工序制備的DNA進(jìn)行處理的工序。"DNA甲基化酶”是指將DNA中的堿基甲基化的酶，以從哺乳動物細(xì)胞、細(xì)菌等分離 了多種DNA甲基化酶。DNA甲基化酶根據(jù)基質(zhì)的堿基的種類，被分為腺嘌呤甲基化酶、胞嘧 啶甲基化酶等多個種類。胞嘧啶甲基化酶是識別DNA堿基序列中的特定序列，并將該序列 附近的胞嘧啶甲基化的酶，已知根據(jù)識別的堿基序列不同而不同的胞嘧啶甲基化酶。在被稱為制限修飾體系的原始免疫系中有大量由DNA甲基化酶催化的DNA的甲 基化反應(yīng)。限制修飾體系是指通過細(xì)菌中發(fā)揮功能的基因組全體定期甲基化而不會被識 別特定序列的限制酶(限制內(nèi)切酶)消化，進(jìn)而利用通過限制酶消化外來DNA(特別優(yōu)選 噬菌體)的功能，防御微生物基因組免受噬菌體感染的系統(tǒng)。在基因組的甲基化中發(fā)揮功 能的酶，已知將胞嘧啶或腺嘌呤甲基化，大多數(shù)情況下是將嘌呤殘基的6位的氮(N6)、或5 位的碳(C5)甲基化。作為這樣的酶當(dāng)中將胞嘧啶的C5甲基化的胞嘧啶甲基化酶，已知有 SssI (M. SssI)甲基化酶、AluI甲基化酶、HhaI甲基化酶、HpaII甲基化酶、MspI甲基化酶、 HaeIII甲基化酶等。另外，這些將胞嘧啶的C5位甲基化的酶所識別的堿基序列不同，對CpG 進(jìn)行識別的胞嘧啶甲基化酶僅為SssI0作為人基因組中的DNA的甲基化反應(yīng)，作為外遺傳(產(chǎn)生不依賴于基因序列的基 因表達(dá)的多樣性的機(jī)制)，已知CpG的胞嘧啶的5位(C5)的甲基化，作為這樣的胞嘧啶甲基 化酶，已知有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，已知有DnmtI甲基轉(zhuǎn)移酶。在人細(xì)胞中，由于CpG序列的胞嘧啶的C5位被甲基化，所以在人為的將基因組甲 基化的情況下，通過使用SssI，可以將與人細(xì)胞內(nèi)的甲基化相同序列(CpG)的、相同胞嘧啶 的、相同位置甲基化。為了通過胞嘧啶甲基化酶將DNA甲基化，具體而言，例如向DNA試樣中分別添加 最適的IOX緩沖液(NEBuffer2 (NEB公司制))5μ L、S-腺苷甲硫氨酸(3. 2mM, NEB公司 制)0. 5 μ 1、胞嘧啶甲基化酶SssI(NEB公司制)0. 5 μ L，接著，向該混合物中加入滅菌超純 水，使液量為50μ L，在37°C下孵育30分鐘。第二工序中的甲基化是為了通過使目標(biāo)DNA 區(qū)域與甲基化DNA抗體結(jié)合從而結(jié)合到支持體而實施的，因此如果提取的DNA試料的目標(biāo) DNA區(qū)域被甲基化，則沒有必要實施第二工序。第二工序中，當(dāng)構(gòu)成經(jīng)DNA甲基化酶修飾了的甲基化DNA的甲基化堿基與后述的 檢測寡核苷酸所具有的甲基化堿基不同時，該檢測寡核苷酸上的甲基化堿基可以作為識別 功能而被利用。例如，當(dāng)檢測寡核苷酸為6-甲基腺嘌呤，經(jīng)第二工序胞嘧啶可以被修飾成 5-甲基胞嘧啶時，作為檢測寡核苷酸的識別功能，利用6-甲基腺嘌呤抗體，向支持體的固 定可以使用甲基胞嘧啶抗體。具體而言，第二工序中被SssI甲基化酶修飾時，向支持體的 固定可以使用甲基胞嘧啶抗體。即，當(dāng)檢測寡核苷酸具有甲基腺嘌呤且利用甲基腺嘌呤抗 體檢出檢測寡核苷酸時，不會檢出具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA的甲基胞嘧啶，而僅檢出檢測寡 核苷酸的甲基腺嘌呤。第三工序是從由第二工序獲得的經(jīng)DNA甲基化酶處理后的DNA制備單鏈甲基化DNA,且使具有目標(biāo)DNA區(qū)域的單鏈甲基化DNA與檢測寡核苷酸結(jié)合而取得被測DNA復(fù)合體 的工序。本發(fā)明方法中的“檢測寡核苷酸”是指如下的寡核苷酸，S卩，構(gòu)成寡核苷酸的核苷 酸的堿基具有用于檢測或定量該檢測寡核苷酸的識別功能，并具有作為用于通過互補(bǔ)性與 具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA相結(jié)合的堿基序列的檢測用粘附序列。另外，本發(fā)明中的“檢測寡核苷酸”也可來自后述的人基因組中的重復(fù)序列、重復(fù) 基因或假基因的堿基序列或可以與其一部分互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列。具體可例如，序列編號 38、40所示的堿基序列或具有它們的互補(bǔ)序列的堿基序列等。檢測用粘附序列是為了形成與含有目標(biāo)DNA區(qū)域的單鏈DNA的結(jié)合體(雙鏈)而 必要的堿基序列，也就是，含有通過互補(bǔ)堿基配對可以與目標(biāo)DNA區(qū)域的堿基序列的一部 分結(jié)合的序列的堿基序列，或含有與比目標(biāo)DNA區(qū)域的5’末端更靠近5’末端側(cè)DNA區(qū)域 的堿基序列的一部分相互補(bǔ)的堿基序列的堿基序列，或者含有與比目標(biāo)DNA區(qū)域的3’末端 更靠近3’末端側(cè)的堿基序列的一部份相互補(bǔ)的堿基序列的堿基序列，另外，且優(yōu)選不抑制 甲基化DNA抗體與目標(biāo)DNA區(qū)域中被甲基化了的DNA相結(jié)合。“不抑制甲基化DNA抗體與目標(biāo)DNA區(qū)域中被甲基化了的DNA相結(jié)合”是指，在甲 基化DNA抗體與被甲基化了的單鏈DNA結(jié)合所需的占有空間內(nèi)，不會發(fā)生該寡核苷酸與上 述單鏈DNA的互補(bǔ)結(jié)合。即，認(rèn)為，在甲基化DNA抗體與被甲基化了的堿基(胞嘧啶)的 結(jié)合中，不僅僅是直接結(jié)合的被甲基化了的堿基(胞嘧啶)，而且被甲基化了的堿基(胞嘧 啶)所存在的周邊空間也被占有。檢測用粘附序列，只要針對在甲基化DNA抗體與被甲基 化了的DNA結(jié)合時所需要的占有空間而言，是不與上述單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列即可。 在上述單鏈DNA上結(jié)合的檢測用粘附序列沒有必要是1種，只要不抑制甲基化DNA抗體的 結(jié)合，可以使用2種以上。如果使用該寡核苷酸，就可以使定量精度及檢測靈敏度提高。第三工序中的“取得具有目標(biāo)DNA區(qū)域的單鏈甲基化DNA，使該單鏈甲基化DNA與 檢測寡核苷酸結(jié)合而得到被測DNA復(fù)合體”是指，形成被甲基化了的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的 DNA (以下，有時記為單鏈甲基化DNA)與檢測寡核苷酸相互補(bǔ)結(jié)合而成的被測DNA復(fù)合體。 具體而言，將上述第二工序中被DNA甲基化酶甲基化了的單鏈甲基化DNA用Tris-HCl緩 沖液(IOmM)制備成Ing/yL的溶液，將可以與該單鏈甲基化DNA互補(bǔ)結(jié)合的檢測寡核苷 酸用Tris-HCl緩沖液(IOmM)制備成0. 02 μ M的溶液，將各寡核苷酸溶液與緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽 pH 7.9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2 溶 液10 μ L、lmg/mL BSA溶液10 μ L混合，再向該混合物中添加滅菌超純水使液量為100 μ L。 之后，在95°C加熱10分鐘，而后迅速冷卻至70°C并保溫10分鐘，再之后冷卻至50°C并保溫 10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返回至室溫，從而促進(jìn)單鏈甲基化DNA與檢測寡核苷酸的 被測DNA復(fù)合體的形成即可?！盎パa(bǔ)結(jié)合”是指通過基于堿基之間的氫鍵的堿基配對而形成雙鏈DNA。例如，形成 構(gòu)成DNA的雙鏈中各單鏈DNA的堿基，通過嘌呤和嘧啶的堿基配對形成雙鏈，更具體而言， 通過多個連續(xù)的、基于胸腺嘧啶和腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶的氫鍵的堿基結(jié)合而形成雙鏈 DNA。也將通過互補(bǔ)性進(jìn)行結(jié)合稱為“互補(bǔ)結(jié)合”?！盎パa(bǔ)結(jié)合”也寫成“互補(bǔ)的結(jié)合”、“互補(bǔ) 的堿基配對”、“通過互補(bǔ)性結(jié)合”或“通過互補(bǔ)性的結(jié)合(基于互補(bǔ)(堿基配對)的結(jié)合)”。 還將可以互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列相互寫成“具有互補(bǔ)性”、或“為互補(bǔ)性“。人工制作的寡核苷酸中所含的肌苷與胞嘧啶、或腺嘌呤、或胸腺嘧啶通過氫鍵的結(jié)合也包括在互補(bǔ)結(jié)合中。在本發(fā)明方法中，在單鏈甲基化DNA與檢測寡核苷酸“通過互補(bǔ)性進(jìn)行結(jié)合”的 情況下，也包括構(gòu)成檢測寡核苷酸的檢測用粘附序列的堿基序列的一部分未與單鏈甲基化 DNA形成堿基配對的情況。例如，構(gòu)成檢測用粘附序列的堿基當(dāng)中至少75%、優(yōu)選80%以上 的堿基與單鏈甲基化DNA形成堿基配對，且也包括與被測寡核苷酸有至少75%以上、優(yōu)選 80%以上的同源性的寡核苷酸和檢測用粘附序列可以結(jié)合的情況。本發(fā)明方法的第三工序中，作為使單鏈甲基化DNA與檢測寡核苷酸的被測DNA復(fù) 合體形成時的優(yōu)選方式，可列舉如添加反向寡核苷酸等。反向寡核苷酸是將含有與目標(biāo)DNA區(qū)域相同的堿基序列的聚核苷酸分割成短的 寡核苷酸后得到的核苷酸。其中，“短”是指10 100個堿基、更優(yōu)選20 50個堿基的長 度。另外，反向寡核苷酸未設(shè)計在檢測寡核苷酸與單鏈甲基化DNA相結(jié)合的堿基序列上。反 向寡核苷酸與目標(biāo)DNA區(qū)域相比，大量過剩添加，目的在于，在目標(biāo)DNA區(qū)域為正鏈時，使目 標(biāo)DNA區(qū)域(正鏈)成為單鏈之后，在使其與后述的固定化甲基化DNA抗體結(jié)合時，防止目 標(biāo)DNA區(qū)域的互補(bǔ)鏈(負(fù)鏈)和目標(biāo)DNA區(qū)域(正鏈)通過互補(bǔ)性再結(jié)合。這是因為，在 使甲基化了的目標(biāo)DNA區(qū)域與甲基化DNA抗體結(jié)合，測定目標(biāo)DNA的量或與其有相關(guān)關(guān)系 的指標(biāo)值時，被甲基化了的目標(biāo)區(qū)域為單鏈時更容易與甲基化DNA抗體結(jié)合。另外，反向寡 核苷酸與目標(biāo)DNA區(qū)域相比，優(yōu)選添加至少10倍、通常為100倍以上的量。第一工序中制備的DNA試料中的目標(biāo)DNA區(qū)域為單鏈DNA時，即使沒有為了進(jìn)行 第三工序中的“制備單鏈甲基化DNA”而進(jìn)行特別的作業(yè)，也可以得到單鏈甲基化DNA作為 DNA試料。具體而言，作為DNA試料，可列舉如利用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA合成的單鏈DNA、在由病 毒提取的DNA中從以單鏈DNA作為基因組的病毒獲得的單鏈DNA。另外，當(dāng)?shù)谝还ば蛑兄?備的DNA試料中的目標(biāo)DNA區(qū)域為雙鏈DNA時，為了進(jìn)行第三工序中的“制備單鏈甲基化 DNA”，進(jìn)行用于將雙鏈DNA成為單鏈的操作即可。此時，具體而言，在95°C加熱數(shù)分鐘，再驟 冷至4°C以下即可。檢測寡核苷酸中的“檢測用粘附序列”是指含有與目標(biāo)DNA區(qū)域所具有的堿基序 列相互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸，是與能和檢測用粘附序列配對的目標(biāo)DNA區(qū)域的堿基序 列有75%以上、優(yōu)選90%以上同源性的序列。另外，檢測用粘附序列為不抑制后述的固定 化甲基化DNA抗體與被測DNA復(fù)合體的結(jié)合的序列即可。另外，“檢測用粘附序列”被設(shè)定 為具有與目標(biāo)DNA區(qū)域或目標(biāo)DNA區(qū)域附近結(jié)合的堿基序列，可以在后述的第四工序中形 成檢測復(fù)合體即可。另外，檢測用粘附序列在后述的同一重復(fù)序列中(目標(biāo)DNA區(qū)域中) 可以設(shè)計一個，也可設(shè)計兩個以上。設(shè)計兩個以上時，多個檢測用粘附序列與后述的特定粘 附序列不相互抑制與單鏈甲基化DNA的結(jié)合即可。第四工序是使由第三工序獲得的被測DNA復(fù)合體與固定化甲基化DNA抗體結(jié)合而 獲得檢測復(fù)合體的工序?！肮潭ɑ谆疍NA抗體”是將以DNA中的被甲基化了的堿基作為抗原而結(jié)合的甲 基化DNA抗體固定化到“支持體”后而得的。作為抗體，優(yōu)選具有識別單鏈DNA中的5位被 甲基化了的胞嘧啶并結(jié)合的性質(zhì)的抗體即可，更優(yōu)選為甲基胞嘧啶抗體。另外，即使為市售 的甲基化DNA抗體，只要為可以特異性識別本說明書中記載的甲基化狀態(tài)的DNA并特異性 結(jié)合的抗體即可。
作為“支持體”只要是甲基化DNA抗體可以結(jié)合的支持體，對其材質(zhì)和形狀就沒有 限制。例如，形狀適于使用目的即可，可以舉出管狀、試驗板狀、濾器狀、盤狀、珠狀等。另 外，作為材質(zhì)，可以是通常的免疫測定法用支持體用的材料，例如可以是聚苯乙烯、聚丙烯、 聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚砜、聚丙烯腈、尼龍等合成樹脂，或向上述合成樹脂中導(dǎo) 入了磺基、氨基等反應(yīng)性官能團(tuán)得到的材料。另外，還可以是玻璃、多糖類或其衍生物(纖 維素、硝基纖維素等)、硅膠、多孔性陶瓷、金屬氧化物等?！爸С煮w”也可以為微粒，另外，微粒可以與支持體一樣結(jié)合在檢測寡核苷酸中。作 為微粒，可列舉如乳膠珠、金膠體(金納米粒)等。在支持體和檢測寡核苷酸中，如果結(jié)合有相同種類的微粒，則作為支持體的微粒 和與檢測寡核苷酸結(jié)合的微粒同時結(jié)合到具有目標(biāo)DNA區(qū)域的被甲基化了的DNA上，微粒 之間有可能發(fā)生凝集。即是指，通過固定化甲基化DNA抗體、檢測寡核苷酸、被甲基化了的 單鏈DNA結(jié)合而形成檢測復(fù)合體，作為支持體的微粒和與檢測寡核苷酸結(jié)合的微粒成為凝 集體。這時，如微粒為乳膠珠，則凝集體有可能通過濁度的變化而被檢測。另外，如微粒為 金膠體(金納米粒)，則凝集體有可能通過色調(diào)變化(從粉色到紫色)而被檢測。當(dāng)具有一個目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA上同時結(jié)合多個在支持體固定化了的甲基化DNA 抗體時，通過將具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA上的多個甲基化DNA與固定化到微粒上的甲基化 DNA抗體結(jié)合，可以檢測微粒的凝集。例如，支持體為乳膠珠時，微粒的凝集體可以通過濁 度的變化而被檢出。另外，支持體為金膠體(金納米粒)時，微粒的凝集體可以通過色調(diào)變 化(從粉色到紫色)而被檢出。另外，此時，即使不添加檢測寡核苷酸而進(jìn)行實施，也可以 得到與添加檢測寡核苷酸的情況相同的檢測結(jié)果。通過微粒的凝集體檢測的量成為與直到第二工序的被甲基化了的DNA的總和相 關(guān)的值。當(dāng)?shù)谝还ば蛑蝎@得的DNA為組織中的細(xì)胞中含有的DNA時，由于組織中的細(xì)胞中 含有的DNA的甲基化程度因組織的不同而不同，因此，在第二工序中所得的DNA的甲基化程 度包括組織中的細(xì)胞中的甲基化程度，和第二工序被甲基化了的程度兩者。即，第二工序中 不實施DNA甲基化酶處理時通過微粒的凝集體檢測的量成為與組織中的細(xì)胞中的甲基化 程度相關(guān)的值。“甲基化DNA抗體”是指以DNA中甲基化后的堿基為抗原而結(jié)合的抗體。具體可 以舉出甲基胞嘧啶抗體，可以舉出具有識別單鏈DNA中的5位被甲基化后的胞嘧啶并結(jié)合 的性質(zhì)的抗體。只要是可以特異性識別本說明書中記載的甲基化狀態(tài)的DNA并特異性結(jié)合 的抗體，也可以利用市售的甲基化DNA抗體。甲基化DNA抗體可以將甲基化后的堿基、甲基 化DNA等作為抗原并利用普通的方法作成。具體而言，為了作成甲基胞嘧啶抗體，通過從以 5-甲基胞苷、5-甲基胞嘧啶、或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等為抗原而制作的抗體中，以對 DNA中的甲基胞嘧啶的特異結(jié)合為指標(biāo)而選出。如果考慮該固定化甲基化DNA抗體的性質(zhì) (在1個甲基化后的堿基(胞嘧啶)上結(jié)合1個抗體)，作為目標(biāo)DNA區(qū)域，選出多個甲基 化后的堿基(胞嘧啶)即CpG存在的區(qū)域，由此可以期待定量精度及檢測靈敏度的提高。作為使動物接觸抗原而得到的抗體，有作為對動物施以抗原免疫而得到的、IgG部 分的抗體(多克隆抗體)的方法、生產(chǎn)單克隆的抗體(單克隆抗體)等。本發(fā)明中優(yōu)選能 夠特異性識別甲基化DNA、或甲基胞嘧啶的抗體，所以優(yōu)選利用單克隆抗體。作為制作單克隆抗體的方法，可以舉出利用細(xì)胞融合法的方法。例如，細(xì)胞融合法通過使免疫后的小鼠來源的脾細(xì)胞(B細(xì)胞)和骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞融合而制作雜交瘤，選 出雜交瘤生產(chǎn)的抗體，制作甲基胞嘧啶抗體(單克隆抗體)。在利用細(xì)胞融合法制作單克 隆抗體的情況下，沒有必要精制抗原，例如將5-甲基胞苷、5-甲基胞嘧啶、或含有5-甲基 胞嘧啶的DNA等的混合物作為抗原，可以給用于免疫的動物使用。作為給藥方法，將5-甲 基胞苷、5-甲基胞嘧啶、或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等直接對產(chǎn)生抗體的小鼠使用。在難 以產(chǎn)生抗體的情況下，可以使抗原與支持體結(jié)合進(jìn)行免疫。另外，通過將佐劑溶液(例如混 合液體石蠟和Aracel A并混合結(jié)核菌的死菌作為佐劑得到的溶液)和抗原充分混合而使 用，或?qū)⒖乖瓝饺胫|(zhì)體使其免疫，由此可以提高抗原的免疫性?；蛘撸械攘刻砑雍锌?原的溶液和佐劑溶液，充分成為乳液狀之后，向小鼠的皮下或腹腔內(nèi)注射的方法；在與明礬 水充分混合之后，以百日咳死菌為佐劑并添加的方法。另外，也可以在經(jīng)最初的免疫之后經(jīng) 過合適的期間后，對小鼠的腹腔內(nèi)或靜胍內(nèi)追加免疫。另外，在抗原量少的情況下，可以將 抗原懸浮的溶液直接注入小鼠脾臟進(jìn)行免疫。自最終免疫起數(shù)日后摘除脾臟并剝離脂肪組 織之后，制作脾細(xì)胞懸浮液。使該脾細(xì)胞和例如HGPRT缺失骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞融合而制 作雜交瘤。作為細(xì)胞融合劑，只要是可以將脾細(xì)胞(B細(xì)胞)和骨髓瘤細(xì)胞有效融合的方法 即可，例如可以舉出使用仙臺病毒(HVJ)、聚乙二醇(PEG)的方法等。另外，可以利用使用高 電壓脈沖的方法進(jìn)行細(xì)胞融合。在細(xì)胞融合操作之后，用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，選擇脾細(xì)胞 和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜交瘤的克隆，等待細(xì)胞發(fā)育直到可以篩選。用于選擇生產(chǎn)目標(biāo)抗 體的雜交瘤的抗體的檢測法、抗體效價的測定法，可以利用抗原抗體反應(yīng)體系。具體而言， 在針對可溶性抗原的抗體測定法中，可以舉出放射性同位素免疫定量法(RIA)、酶免疫定量 法(ELISA)等。如果在單鏈DNA中存在的CpG有至少一處被甲基化，則可以與抗甲基化抗體結(jié)合。 因此，本發(fā)明的方法中的“甲基化后”是指在DNA中存在的CpG至少一處被甲基化的DNA，并 非僅指在DNA中存在的CpG全部被甲基化的DNA。第四工序中的“檢測復(fù)合體”是指第三工序中獲得的被測DNA復(fù)合體與固定化甲 基化DNA抗體結(jié)合后的復(fù)合體。甲基化DNA抗體被作為固定化至支持體的抗體來使用，因 此，甲基化DNA抗體可以最終以形成目標(biāo)DNA區(qū)域中含有被甲基化了的DNA的單鏈DNA與 檢測寡核苷酸的被測DNA復(fù)合體的狀態(tài)，固定化到支持體即可，(1)可以是，在被測DNA復(fù)合體與甲基化DNA抗體結(jié)合前的階段，甲基化DNA抗體 被固定化到支持體，或者(2)也可以是，在被測DNA復(fù)合體與甲基化DNA抗體結(jié)合后的階段，甲基化DNA抗 體被固定到支持體。 為了將甲基化DNA抗體固定到支持體，具體而言，可以例舉將甲基化DNA抗體生物 素化而得的生物素化甲基化DNA抗體固定在用抗生蛋白鏈菌素覆蓋的支持體(例如，用抗 生蛋白鏈菌素覆蓋的PCR管、用抗生蛋白鏈菌素覆蓋的磁珠、用抗生蛋白鏈菌素覆蓋一部 分的色譜條等)的方法。 另外，使甲基化DNA抗體與具有氨基、硫醇基、醛基等活性官能團(tuán)的分子共價結(jié)合 之后，使其與表面被硅烷偶聯(lián)劑等活化后的玻璃、多糖類衍生物、硅膠、或上述合成樹脂等、 或耐熱性塑料制的支持體共價結(jié)合的方法。另外，共價結(jié)合例如可以舉出通過將5個甘油 三酯串聯(lián)連結(jié)而成的間隔區(qū)、交聯(lián)劑等使甲基化DNA抗體與上述具有活性官能團(tuán)的分子共價結(jié)合即可。另外甲基化DNA抗體也可以直接固定化到支持體，另外，可以將對甲基化DNA 抗體的抗體(二次抗體)固定化到支持體，再使二次抗體與甲基化抗體結(jié)合，從而固定到支 持體即可。第四工序的“使被測DNA復(fù)合體與固定化甲基化DNA抗體結(jié)合而獲得檢測復(fù)合體” 是指，使第三工序中獲得的被測DNA復(fù)合體中所含的單鏈甲基化DNA與固定化甲基化DNA 抗體相結(jié)合，從而固定化到支持體。例如，“在被測DNA復(fù)合體與甲基化DNA抗體的結(jié)合前 的階段，將甲基化DNA抗體固定化到支持體”時，具體可例如，作為可以固定化到支持體的甲 基化DNA抗體，使用“被生物素標(biāo)記了的生物素化甲基化DNA抗體”，標(biāo)本來源的DNA試料為 生物來源標(biāo)本來源標(biāo)本中所含基因組來源的DNA試料時，可以如下實施。(a)將生物素化甲基化DNA抗體添加到適量(例如，4 μ g/mL溶液，100 μ L/孔)抗 生物素蛋白覆蓋板中，之后，在室溫下靜置例如約2小時，從而，促進(jìn)生物素化甲基化DNA抗 體與抗生物蛋白鏈菌素的固定化。之后，進(jìn)行殘留溶液的除去和清洗。以例如300yL/孔 的比例，添加清洗緩沖液(例如，含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4))，除去溶液。將該清洗操作重復(fù)數(shù)次，在孔上殘留固定化至支持 體的生物素化甲基胞嘧啶抗體。(b)標(biāo)本來源的DNA試料是在生物來源標(biāo)本來源標(biāo)本中所含的基因組來源的DNA 試料中，添加NEBuffer2 (NEB公司制)5 μ L、S_腺苷甲硫氨酸(3. 2mM,NEB公司制)0. 5 μ 1、 胞嘧啶甲基化酶(NEB公司制)各0. 5 μ L，接著，向該混合物中添加滅菌超純水使液量 為50 μ L，再在37°C孵育30分鐘之后，再混合使雙鏈DNA分離而得的甲基化單鏈DNA、檢測 寡核苷酸和退火緩沖液(例如，33mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、66mM KOAcUOmM Mg0Ac2、0. 5mM 二硫蘇糖醇)，在95°C加熱例如數(shù)分鐘。之后，為了形成含有目標(biāo)DNA區(qū)域的單鏈DNA與檢 測寡核苷酸的結(jié)合體，迅速降低到比檢測寡核苷酸的Tm值低約10 20°C的溫度，在該溫度 下保溫例如數(shù)分鐘，之后返回至室溫(在該階段形成的結(jié)合體除了目標(biāo)DNA區(qū)域中含有被 甲基化了的DNA的甲基化單鏈DNA與檢測寡核苷酸的結(jié)合體之外，還包括目標(biāo)DNA區(qū)域中 不含被甲基化了的DNA的單鏈DNA與檢測寡核苷酸的結(jié)合體)。(c)將形成的甲基化單鏈DNA與檢測寡核苷酸的結(jié)合體添加到固定化有生物素 化甲基化DNA抗體的抗生物素蛋白覆蓋板，之后，在室溫下靜置3小時，促進(jìn)生物素化甲基 化DNA抗體、上述甲基化單鏈DNA中在目標(biāo)DNA區(qū)域含有被甲基化了的DNA的甲基化單鏈 DNA與檢測寡核苷酸的復(fù)合體的形成(復(fù)合體的形成)(在該階段，如果含有目標(biāo)DNA區(qū)域 的DNA試料沒有被甲基化，則單鏈DNA與檢測寡核苷酸的結(jié)合體沒有形成與甲基化DNA抗 體的復(fù)合體)。之后，進(jìn)行殘留溶液的除去及清洗。例如以300 μ L/孔的比例，添加清洗 緩沖液(例如，含 0. 05% Tween20 磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl PH7.4))，除去溶液。通過將該清洗操作重復(fù)數(shù)次，將復(fù)合體殘留到孔上(復(fù)合體到分離)。作為(b)中使用的退火緩沖液，只要是適于使檢測寡核苷酸、含有目標(biāo)DNA區(qū)域的 甲基化單鏈DNA結(jié)合即可，不限于上述退火緩沖液。如果使用以1 600mM的濃度溶解有 二價離子優(yōu)選鎂離子的溶液，即可以使結(jié)合的穩(wěn)定性增加。關(guān)于(a)及(c)中的清洗操作，是從反應(yīng)溶液除去在溶液中懸浮的未被固定化的 甲基化DNA抗體、沒有與甲基化DNA抗體結(jié)合的在溶液中懸浮的未被甲基化的單鏈DNA、以 及沒有形成與檢測寡核苷酸的結(jié)合體的目標(biāo)DNA區(qū)域以外的甲基化單鏈DNA等，所以比較重要。另外，清洗緩沖液只要適于除去上述的游離的甲基化DNA抗體、在溶液中懸浮的甲基 化單鏈DNA等即可，不限于上述清洗緩沖液，可以是DELFIA緩沖液(PerkinElmer公司制、 Tris-HCl pH 7. 8with Tween 80)、TE 緩沖液等。上述(a) (c)中，將上述的目標(biāo)DNA區(qū)域甲基化而得的甲基化單鏈DNA與檢測寡 核苷酸的結(jié)合后，使生物素化甲基化DNA抗體結(jié)合到生成的結(jié)合體，形成復(fù)合體，但不限于 該順序。即，可以是，使上述的含有目標(biāo)DNA區(qū)域的甲基化單鏈DNA與生物素化甲基化DNA 抗體結(jié)合后，再使生成的結(jié)合體與檢測寡核苷酸結(jié)合，形成復(fù)合體。例如，向被固定化到用 抗生蛋白鏈菌素覆蓋的支持體的生物素化甲基化DNA抗體中，添加基因組來源的DNA試料、 NEBuffer2(NEB公司制)5yL、S-腺苷甲硫氨酸(3. 2mM, NEB公司制)0. 5 μ 1、胞嘧啶甲基 化酶ksl (NEB公司制)各0. 5 μ L，接著，向該混合物中添加滅菌超純水使液量為50 μ L，在 37°C孵育30分鐘之后，添加從雙鏈DNA分離而得的甲基化單鏈DNA，由此，形成被固定化至 支持體的生物素化甲基化DNA抗體與該甲基化單鏈DNA的結(jié)合體(在該階段形成的結(jié)合體 除了在目標(biāo)DNA區(qū)域中包括被甲基化了的DNA的甲基化單鏈DNA與甲基化抗體的結(jié)合體之 外，還包括在目標(biāo)DNA區(qū)域以外被甲基化了的甲基化單鏈DNA與甲基化抗體的結(jié)合體)。之 后，向其中添加檢測寡核苷酸，形成與上述結(jié)合體中具有在目標(biāo)DNA區(qū)域含有被甲基化了 的DNA的甲基化單鏈DNA的結(jié)合體的復(fù)合體，也可以分離(在該階段，目標(biāo)DNA區(qū)域以外區(qū) 域中含有被甲基化了的DNA的甲基化單鏈DNA與甲基化抗體的結(jié)合體沒有形成復(fù)合體)?？梢允褂蒙V條來進(jìn)行上述(a) (C)的操作。此時，具體如下實施。例如，首先， 將適量的生物素化甲基化DNA抗體通過用抗生物蛋白鏈菌素覆蓋一部分的色譜條展開。通 過該操作，生物素化甲基化DNA抗體被固定化到用抗生物蛋白鏈菌素覆蓋的部分。接著，將 (b)所得的上述甲基化單鏈DNA與檢測寡核苷酸的結(jié)合體(在該階段形成的結(jié)合體，除了在 目標(biāo)DNA區(qū)域中含有被甲基化了的DNA的甲基化單鏈DNA與檢測寡核苷酸的結(jié)合體之外， 還包括目標(biāo)DNA區(qū)域中不包括被甲基化了的DNA的單鏈DNA與檢測寡核苷酸的結(jié)合體)用 上述的色譜條展開。通過這些操作，添加基因組DNA來源的DNA試料、NEBuffer2 (NEB公司 制)5 μ L、S-腺苷甲硫氨酸(3. 2mM,NEB公司制)0. 5 μ 1、胞嘧啶甲基化酶ksl (NEB公司制) 各0. 5 μ L，接著，向該混合物中添加滅菌超純水使液量為50μ L，在37°C中孵育30分鐘后， 含有將雙鏈DNA分解而得到的甲基化單鏈DNA、檢測寡核苷酸和生物素化甲基化DNA抗體的 復(fù)合體被固定化到用抗生蛋白鏈菌素覆蓋的部分(復(fù)合體的形成，向支持體的固定)(在該 階段，目標(biāo)DNA區(qū)域中不含有被甲基化了的DNA的單鏈DNA與檢測寡核苷酸的結(jié)合體沒有 形成復(fù)合體)。對于用于復(fù)合體形成的操作的順序，不限于該操作的順序。也可以是例如， 形成含有目標(biāo)DNA區(qū)域中包括被甲基化了的DNA的單鏈DNA、檢測寡核苷酸和生物素化甲基 化DNA抗體的復(fù)合體后，將其用色譜條展開，在用抗生蛋白鏈菌素覆蓋的部分固化定該復(fù) 合體。在這些操作中，利用色譜條將溶液展開可以將不需要的成分除去，因此可以省略清洗 操作。也可以在各操作間實施清洗操作(利用清洗緩沖液(例如，含0. 05% Tween20磷酸 緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)的色譜條的展開)。第五工序是通過對第四工序所得的檢測復(fù)合體中所含的檢測寡核苷酸利用其識 別功能進(jìn)行定量或檢測，而將上述單鏈DNA中的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA定量或檢測的工 序。在此所謂的“檢測”是指通過檢測寡核苷酸的識別功能，來判斷直到第二工序的被甲基化的DNA的甲基化程度是否為一定程度以上。即，通常是指通過后述的識別功能而得 到有意義的值。另外，“定量”是指第五工序中所要求的利用識別功能檢測的量的數(shù)值化。S卩，是指 得到與第一工序獲得的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA與第二工序中通過DNA甲基化酶處理而被 甲基化了的甲基化DNA的總和量相關(guān)的值。例如，作為后述的識別功能而對甲基化DNA抗 體或該寡核苷酸的量進(jìn)行定量的值是與標(biāo)本中的目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA的量相關(guān)的值，例如 標(biāo)本為ImL的血清時，是指獲得在血清ImL中所含的目標(biāo)區(qū)域的DNA的、由第一工序獲得的 具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA和第二工序中通過DNA甲基化酶處理而被甲基化了的甲基化DNA 的總量相關(guān)的值。第五工序中的“識別功能”是可以對檢測寡核苷酸檢測或定量的功能。只要該識別 功能是檢測寡核苷酸所具有的功能即可，可列舉如，基于檢測寡核苷酸的標(biāo)記的識別功能、 通過與檢測寡核苷酸結(jié)合的檢測分子而向檢測寡核苷酸賦予的識別功能。具體而言，可列 舉如對檢測寡核苷酸完成了在其5’末端或3’末端的銪標(biāo)記、金膠體標(biāo)記、乳膠珠標(biāo)記、放 射性同位素標(biāo)記、熒光物質(zhì)(FITC等)標(biāo)記、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記、堿性磷酸酶標(biāo)記 等的檢測寡核苷酸的熒光·發(fā)色等的特性。為了銪的檢測，添加促進(jìn)溶液(Enhancement Solution) (PerkinElmer公司制)并 進(jìn)行混合，在室溫下靜置約45分鐘后，用熒光檢測器測定熒光(激發(fā)340nm/熒光612nm) 即可。另外，檢測寡核苷酸為甲基化寡核苷酸時，作為檢測分子，具體而言，可列舉如甲基化 DNA抗體、鋨絡(luò)合物(J.Am. Chem. Soc.，2007 ；129 =5612-5620)等。甲基化寡核苷酸是指，構(gòu) 成寡核苷酸的核苷酸的堿基的至少一個被甲基化的寡核苷酸，更具體而言，是指包含5-甲 基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤等的寡核苷酸。進(jìn)而，檢測寡核苷酸被FITC標(biāo)記時，作為檢測分子 可列舉如FITC抗體。當(dāng)檢測分子為甲基化DNA抗體時，只要是使抗體結(jié)合可以定量或檢測的功能，就 可以賦予抗體識別功能。但是，不能使用與固定化甲基化DNA抗體有基質(zhì)交差性的甲基化 DNA抗體。例如，固定化甲基化DNA抗體使用甲基胞嘧啶抗體時，不能使用可以與甲基胞嘧 啶結(jié)合的甲基化DNA抗體。具體而言，有銪標(biāo)記、金膠體標(biāo)記、乳膠珠標(biāo)記、放射性同位素標(biāo) 記、熒光物質(zhì)(FITC等)標(biāo)記、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記、堿性磷酸酶標(biāo)記、生物素標(biāo)記等 標(biāo)記發(fā)生熒光·發(fā)色等的功能。另外，作為對作為這些檢測分子的抗體賦予識別功能的方 法，可列舉如，可以使直接識別功能結(jié)合到作為檢測分子的抗體，也可以使具有識別功能的 二次抗體或三次抗體結(jié)合到作為檢測分子的抗體。具體而言，熒光物質(zhì)標(biāo)記的抗體、辣根過 氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體、生物素標(biāo)記的抗體、銪標(biāo)記的抗體是 市售的，因此可以作為二次抗體或三次抗體使用。另外，也可以是結(jié)合了可以通過酶循環(huán)法 檢測的基質(zhì)的抗體。作為這些功能的定量或檢測方法，例如可列舉如利用放射線檢測器、分 光光度計等儀器的測定，或肉眼觀察等。例如，作為通過其識別功能檢測或定量檢測寡核苷 酸的情況，具體而言當(dāng)作為可以檢測或定量的功能而使用附加了銪的二次抗體時，使檢測 復(fù)合體結(jié)合二次抗體后，添加混合促進(jìn)溶液(PerkinElmer公司制)，在室溫下靜置約45分 鐘。之后用熒光檢測器測定熒光(激發(fā)340nm/熒光612nm)即可。當(dāng)使檢測寡核苷酸上的甲基化DNA與甲基化DNA抗體(與固定化甲基化DNA抗 體具有不同的基質(zhì)特異性的甲基化DNA抗體)結(jié)合，利用其功能進(jìn)行檢測或定量時，具體而言，例如當(dāng)將抗體自身的特性作為功能使用時，可以進(jìn)行如下的操作。使復(fù)合體與甲基 化DNA抗體結(jié)合后，添加對甲基化DNA抗體的二次抗體(例如，Eu-Nl標(biāo)記小鼠IgG抗體 PerkinElmer公司制)，在室溫下靜置約1小時，促進(jìn)二次抗體向復(fù)合體的結(jié)合。之后，添加 促進(jìn)溶液(PerkinElmer公司制)并進(jìn)行混合，在室溫下靜置例如45分鐘。之后，通過用熒 光檢測器測定熒光(激發(fā)340nm/熒光612nm)而進(jìn)行檢測或定量。當(dāng)將與檢測寡核苷酸上的甲基化DNA結(jié)合的甲基化DNA抗體用FITC標(biāo)記時，作為 二次抗體也可以使用使FITC結(jié)合了的抗體。此時，也可以通過公知的方法，測定FITC的熒 光，進(jìn)行檢測或定量，也可以將抗FITC抗體作為二次抗體來進(jìn)行檢測或定量。進(jìn)而，使檢測 寡核苷酸直接結(jié)合FITC時，可以將FITC作為識別功能而利用，也可以通過辣根過氧化物酶 (HRP)標(biāo)記了的FITC抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記了的FITC抗體、生物素標(biāo)記了的FITC抗體、銪 標(biāo)記了的FITC抗體等，賦予標(biāo)記功能。具體而言，作為檢測寡核苷酸，將FITC標(biāo)記的寡核 苷酸作為檢測寡核苷酸使用時，向被固定化到包括該檢測寡核苷酸的支持體的檢測復(fù)合體 中，添加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記了的抗體(例如，HRP標(biāo)記FITC抗體(Jackson Immuno Research Laboratories公司制)，在室溫下靜置約1小時 2小時，促進(jìn)FITC抗體向檢測 復(fù)合體的結(jié)合。之后，清洗除去FITC抗體溶液，添加、混合合適的基質(zhì)(例如，Substrate Reagent Pack #DY999 :R&D SYSTEMS公司制)。在室溫下靜置約5 60分鐘后，添加停止 溶液QN H2S04水溶液)使辣根過氧化物酶(HRP)的反應(yīng)停止，在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi) 進(jìn)行450nm的吸光度即可。當(dāng)甲基化DNA抗體的固定化中沒有利用生物素時，可以將生物素化檢測寡核苷酸 用于檢測或定量。檢測或定量生物素化了的檢測寡核苷酸時，例如，將HRP標(biāo)記抗生物蛋白 鏈菌素添加、混合到被固定化了的檢測復(fù)合體中，形成生物素化檢測寡核苷酸與HRP標(biāo)記 抗生物蛋白鏈菌素的結(jié)合體，并將其分離后，通過公知的方法測定HRP的活性，從而可以檢 測或定量生物素化甲基化DNA抗體。作為識別功能，可以是利用在酶循環(huán)法等高靈敏度檢測法中使用的基質(zhì)等的識別 功能。具體而言，將結(jié)合了在酶循環(huán)法中所用酶的抗體作為檢測分子，使之與檢測復(fù)合體結(jié) 合即可，另外，本發(fā)明方法中作為賦予檢測分子的識別功能不限于上述記載的方法?！皺z測分子”只要具有檢測或定量檢測寡核苷酸的性質(zhì)即可。另外，檢測分子也 可以是識別檢測寡核苷酸的檢測序列的檢測分子，也可以事先與檢測寡核苷酸結(jié)合。艮口， 檢測分子具有與檢測寡核苷酸特異性結(jié)合的性質(zhì)，并且具有作為在定量或檢測中利用的功 能 特性的“識別功能”，或者被賦予了識別功能而得到的分子。具體而言，當(dāng)檢測序列為甲 基化寡核苷酸時，檢測分子是可以與該甲基化寡核苷酸結(jié)合并檢測該甲基化寡核苷酸的分 子即可，是與該甲基化寡核苷酸特異性結(jié)合并顯示識別功能的分子即可。(但是，不能使用 與固定化甲基化DNA抗體有基質(zhì)交差性的甲基化DNA抗體。例如，固定化甲基化DNA抗體 使用甲基胞嘧啶抗體時，不能將甲基胞嘧啶抗體作為檢測分子)。另外，例如檢測分子也可 以是甲基化DNA抗體。但是，不能使用與固定化甲基化DNA抗體有基質(zhì)交差性的甲基化DNA 抗體。例如，當(dāng)固定化甲基化DNA抗體使用甲基胞嘧啶抗體時，不能利用甲基胞嘧啶抗體作 為檢測分子。另外，當(dāng)檢測序列為檢測分子本身時，為了對檢測寡核苷酸進(jìn)行檢測，也可以 不添加新的檢測分子，通過檢測摻入到檢測寡核苷酸的檢測分子，可以進(jìn)行該檢測寡核苷 酸的檢測。
作為對血液、尿等生物體試樣中所含的微量物質(zhì)進(jìn)行定量或檢測的方法，廣泛使 用的是免疫學(xué)測定方法。在該方法當(dāng)中，使用了色譜法的所謂免疫色譜法法操作簡單，檢驗 所需的時間也短，所以當(dāng)前在大多數(shù)情況下廣泛用于例如醫(yī)院的臨床檢查、研究室的檢驗 試驗等。另外，近年來使用如下的所謂雜交色譜法，即，使標(biāo)記過的DNA(基因)在色譜條上 展開，使用能夠捕捉目標(biāo)DNA(基因)的探針進(jìn)行雜交，由此檢測出目標(biāo)DNA(基因)。該方 法也由于操作簡便，檢驗所需的時間也短，所以當(dāng)前在大多數(shù)情況下開始廣泛用于例如醫(yī) 院的臨床檢查、研究室的檢驗試驗等。本發(fā)明方法在概念上可以是混合了上述的免疫色譜 法和雜交色譜法的方法。在本發(fā)明方法中，關(guān)于復(fù)合體的形成及復(fù)合體的獲得，其順序沒有 特別限定，可以為各種方法。具體而言，例如，如下所示加以實施即可。方法1 向剛結(jié)束第二工序的試料中添加具有識別功能的檢測寡核苷酸，使含有 目標(biāo)DNA區(qū)域的被甲基化了的單鏈DNA與具有識別功能的檢測寡核苷酸形成結(jié)合體(在該 階段形成的結(jié)合體除了在目標(biāo)DNA區(qū)域中包含被甲基化了的DNA的單鏈DNA與檢測寡核苷 酸的結(jié)合體之外，還包括在目標(biāo)DNA區(qū)域不含被甲基化了的DNA的單鏈DNA與檢測寡核苷 酸的結(jié)合體)，接著，添加生物素化甲基化抗體，使在目標(biāo)DNA區(qū)域含有被甲基化了的DNA的 單鏈DNA、具有識別功能的檢測寡核苷酸與生物素化甲基化DNA抗體結(jié)合而得的復(fù)合體形 成。將所得的試料滴加(導(dǎo)入)到色譜條的導(dǎo)入部時，上述復(fù)合體通過毛細(xì)管現(xiàn)象在展開 部移動，被預(yù)先用抗生蛋白鏈菌素覆蓋的部分捕捉。隨后，利用其識別功能對所得復(fù)合體中 含有的檢測寡核苷酸進(jìn)行定量或檢測，由此可以對具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢 測。方法2 向剛結(jié)束第二工序的試料中，添加生物素化甲基化DNA抗體，使具有被甲 基化了的胞嘧啶的甲基化后的單鏈DNA (其中，存在包括目標(biāo)DNA區(qū)域的單鏈DNA和目標(biāo)之 外的單鏈DNA)與生物素化甲基化DNA抗體的結(jié)合體形成(在該階段形成的結(jié)合體除在目 標(biāo)DNA區(qū)域含有被甲基化了的DNA的單鏈DNA與甲基化抗體的結(jié)合體之外，還包括目標(biāo)DNA 區(qū)域以外的被甲基化了的單鏈DNA與甲基化抗體的結(jié)合體)。將所得的試料滴加(導(dǎo)入) 到色譜條的導(dǎo)入部時，上述結(jié)合體通過毛細(xì)管現(xiàn)象在展開部移動，被預(yù)先用抗生蛋白鏈菌 素覆蓋的部分捕捉(在該階段形成的結(jié)合體除了在目標(biāo)DNA區(qū)域含有被甲基化了的DNA的 單鏈DNA與甲基化抗體的結(jié)合體之外，還包括目標(biāo)DNA區(qū)域以外的被甲基化了的單鏈DNA 與甲基化抗體的結(jié)合體)。之后，將具有識別功能的檢測寡核苷酸滴加(導(dǎo)入)到導(dǎo)入部 時，在展開部移動，僅與結(jié)合體中包含目標(biāo)DNA區(qū)域的被甲基化了的單鏈DNA相結(jié)合，形成 在目標(biāo)DNA區(qū)域含有被甲基化了的DNA的單鏈DNA、具有識別功能的檢測寡核苷酸與生物素 化甲基化DNA抗體結(jié)合而成的復(fù)合體。利用其識別功能對所得復(fù)合體中含有的檢測寡核苷 酸進(jìn)行定量或檢測，由此可以對具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測。方法3 在將生物素化甲基化DNA抗體滴加(導(dǎo)入)到色譜條的導(dǎo)入部時，上述甲 基化DNA抗體通過毛細(xì)管現(xiàn)象在展開部移動，被預(yù)先用抗生蛋白鏈菌素覆蓋的部分捕捉。 接著，將剛結(jié)束第二工序的試料滴加(導(dǎo)入)到導(dǎo)入部時，在展開部移動，在已被捕捉的甲 基化DNA抗體中，具有被甲基化了的胞嘧啶的單鏈DNA被捕捉作為結(jié)合體(在該階段形成 的結(jié)合體除了在目標(biāo)DNA區(qū)域含有被甲基化了的DNA的單鏈DNA與甲基化抗體的結(jié)合體之 外，還包括目標(biāo)DNA區(qū)域以外的被甲基化了的單鏈DNA與甲基化抗體的結(jié)合體)。之后，將 具有識別功能的檢測寡核苷酸滴加(導(dǎo)入)到導(dǎo)入部，則在展開部移動，僅與結(jié)合體中含有目標(biāo)DNA區(qū)域的被甲基化了的單鏈DNA相結(jié)合，形成在目標(biāo)DNA區(qū)域含有被甲基化了的DNA 的單鏈DNA、具有識別功能的檢測寡核苷酸與生物素化甲基化DNA抗體結(jié)合而得的檢測復(fù) 合體。利用其識別功能對所得復(fù)合體中含有的檢測寡核苷酸進(jìn)行定量或檢測，由此可以對 具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測。方法4 將生物素化甲基化DNA抗體滴加(導(dǎo)入)到色譜條的導(dǎo)入部時，上述甲基 化DNA抗體通過毛細(xì)管現(xiàn)象在展開部移動，被預(yù)先用抗生蛋白鏈菌素覆蓋的部分捕捉。向 剛結(jié)束第二工序的試料中添加具有識別功能的檢測寡核苷酸，形成作為含有目標(biāo)DNA區(qū)域 的被甲基化了的單鏈DNA與具有識別功能的檢測寡核苷酸的結(jié)合體的被測DNA復(fù)合體。接 著，將所得的結(jié)合體滴加(導(dǎo)入)到導(dǎo)入部，則在展開部移動，結(jié)合體中僅僅是目標(biāo)DNA區(qū) 域含有被甲基化了的DNA的單鏈DNA結(jié)合到已經(jīng)捕捉的甲基化DNA抗體，形成在目標(biāo)DNA 區(qū)域含有被甲基化了的DNA的單鏈DNA、具有識別功能的檢測寡核苷酸與生物素化甲基化 DNA抗體結(jié)合而成的檢測復(fù)合體。利用其識別功能對所得復(fù)合體中含有的檢測寡核苷酸進(jìn) 行定量或檢測，由此可以對具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測。也可以使目標(biāo)DNA區(qū)域中存在多個檢測部位(使用可以與分別不同的目標(biāo)DNA區(qū) 域互補(bǔ)結(jié)合的檢測寡核苷酸)，依次對各目標(biāo)DNA區(qū)域進(jìn)行檢測或定量，另外，為了與多個 目標(biāo)DNA區(qū)域形成復(fù)合體，而使用可以同時檢測基因組中的重復(fù)序列、重復(fù)基因或多個不 同的基因的、可以與多個目標(biāo)DNA區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合的檢測寡核苷酸，也可以使檢測靈明度大 幅提高。再者，即使在一個目標(biāo)區(qū)域中，設(shè)計多個檢測寡核苷酸，將其在支持體側(cè)或檢測側(cè) 使用，也可以使檢測靈敏度顯著提高。作為實施形成檢測寡核苷酸、生物素化甲基化抗體、目標(biāo)DNA區(qū)域中被甲基化了 的單鏈DNA的復(fù)合體，并使其結(jié)合到支持體的過程的方法，不限于上述的方法1 方法4，也 可以為使用免疫抗體法的方法。例如，ELISA法中，由于使用了與色譜條法相同的原理，因 此可以按照方法1 4中記載的順序，實施形成復(fù)合體并使其結(jié)合到支持體的過程。這些在本發(fā)明方法中可以使用的DNA甲基化酶、檢測寡核苷酸或甲基化DNA抗體 作為檢測用試劑盒的試劑有用。本發(fā)明方法提供了含有這些DNA甲基化酶、特定寡核苷酸 或甲基化DNA抗體等作為試劑的檢測用試劑盒，也提供了將該寡核苷酸或甲基化DNA抗體 等固定化到支持體上而成到檢測用試劑盒，本發(fā)明方法的權(quán)利要求的范圍也包括利用該方 法的實質(zhì)原理而成的以上述檢測用試劑盒、檢測用芯片的方式的使用。通常在對活檢樣品、食品中是否含有病原性微生物進(jìn)行檢查的情況下，針對各微 生物抗原進(jìn)行基于免疫法的檢查，由此來考察有無該病原性微生物，或鑒定該病原性微生 物。但是，該免疫法中使用的抗體的制作并不容易，進(jìn)而為了檢測多個病原性微生物，有必 要制作針對各病原性微生物的抗原的抗體。通過使用本發(fā)明方法，可以在不制作這些繁瑣 的抗體的情況下對病原性微生物實施簡易檢查。另外，在本發(fā)明方法中，可以同時檢查不 同的病原性微生物的堿基序列，可以同時檢測出一個標(biāo)本中所含的數(shù)種病原性微生物。具 體而言，已知有單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腸沙門氏菌、空腸彎曲桿菌空腸亞種、金黃色葡 萄球菌、副溶血弧菌、蠟狀芽孢桿菌、肉毒梭菌、結(jié)腸耶氏菌、假結(jié)核耶氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌 等食物中的毒菌，尚不知曉同時檢測其中的數(shù)種食物中毒菌的技術(shù)。但是，通過使用本發(fā) 明方法，可以同時檢測數(shù)種食物中毒菌的堿基序列。另外，作為檢測對象的堿基序列，在通 過特定寡核苷酸選擇CRISPR(成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列=Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)區(qū)域那樣在基因組中多見的堿基序列的情況 下，能以比檢測一個基因組中的一個基因更高的靈敏度檢測出。這樣的技術(shù)在感染癥的診 斷、食物中毒菌的迅速檢測中也是有用的。另外，本發(fā)明方法也可以用于通過檢測環(huán)境中的 微生物的基因組進(jìn)行產(chǎn)業(yè)上有用的菌的鑒定，土壤、河川、湖沼的沉積物等的微生物群的簡 易調(diào)查?？梢源_認(rèn)環(huán)境中的微生物當(dāng)中例如詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、 嗜熱堿甲燒桿菌 deltaH(Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH)、超嗜熱 菌(Aquifex aeolicus)、超嗜熱古菌 0T3 (Pyrococcus horikoshii 0T3)、閃爍古生球菌 (Archaeoglobus fulgidus) > ^^ MSB8 (Thermotoga maritime MSB8) > Bf f!； ^ Ir Kl (Aeropyrum pernix ΚΙ)、地中海富鹽菌(Haloferax mediterranei)的生存。另夕卜，還可 以用于硫還原地桿菌(GecAacter sulfurreducens)這樣可以在工業(yè)上利用的細(xì)菌、唾液鏈 球菌(Str印tococcus thermophilus)這樣可以用于發(fā)酵的微生物的檢測、鑒定。本發(fā)明方法中的目標(biāo)DNA區(qū)域為微生物來源的堿基序列時，是指從標(biāo)本中提取的 基因組DNA或DNA斷片、獲知由從標(biāo)本中提取的RNA利用逆轉(zhuǎn)錄酶形成DNA的堿基序列。因 此作為可以與檢測寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列，只要選擇與該微生物特異的區(qū)域即可。 例如，本發(fā)明中的目標(biāo)DNA區(qū)域為微生物的堿基序列時，為了從標(biāo)本中選擇性提取目標(biāo)DNA 區(qū)域，將微生物基因組DNA、或由從標(biāo)本中提取的RNA利用逆轉(zhuǎn)錄酶而得的DNA等的堿基序 列中、位于目標(biāo)DNA區(qū)域附近的微生物特有的堿基序列作為與特定寡核苷酸特異結(jié)合的堿 基序列即可。例如，作為用于檢測微生物中的基因組的目標(biāo)DNA區(qū)域和檢測寡核苷酸互補(bǔ)結(jié) 合的區(qū)域，具體而言，可以是與基因庫檢索號No. NC_001139等所示的酵母染色體VII的 堿基編號271743-272083相當(dāng)?shù)膮^(qū)域(序列編號四)、像基因庫檢索號No. NC_001139等 所示的酵母染色體VII的堿基編號384569-384685(序列編號34)那樣不對基因進(jìn)行編 碼的堿基序列。另外，以各種病原性微生物共同的特征基因的、在病原性微生物間保存的 堿基序列為檢測對象，可以提供同時檢測多個病原性微生物的方法，因此是有用的。具體 而言，mce-family基因(結(jié)核桿菌Micobacterium tuber culosis)、13號染色體上的 tRNA-Tyr堿基序列(新型隱球菌)、幾丁質(zhì)合成酶活化劑(Chs3)，是煙曲霉菌及新薩托菌 (Neosartorya)屬特有的堿基序列，所以可以用于通過檢驗在從人的痰、肺的活檢樣品中提 取的DNA中是否含有這些微生物來源的DNA來檢驗微生物所致的感染癥。另外，actA(單 核細(xì)胞增生利斯特氏菌)>PvrG(NC 002163、空腸彎曲桿菌空腸亞種)是等食物中毒菌特有 的共同的基因，這些基因可以用于檢驗食物中毒的微生物。另外，thrA具有腸沙門氏菌、結(jié) 腸耶氏菌、大腸埃希氏菌中保存的序列，也可以通過一個基因?qū)Χ鄠€微生物進(jìn)行檢測?？梢詸z索數(shù)據(jù)庫上公開的堿基序列當(dāng)中微生物特有的堿基序列，探索微生物特有 的堿基序列。例如，只要是在PubMed等公開數(shù)據(jù)庫上的堿基序列，就可以通過常規(guī)的手續(xù) 獲得，所獲得的堿基序列可以通過進(jìn)行基于常規(guī)手續(xù)的Blast檢索來研究是否是特有的堿 基序列。需要說明的是，特有的堿基序列是指檢測對象中的堿基序列不具有與成為檢測對 象的微生物的基因組堿基序列以外的生物來源的堿基序列示出同源性的堿基序列。特別是在標(biāo)本為人活檢樣品的情況下，重要的是設(shè)計不與人基因互補(bǔ)結(jié)合的特定 寡核苷酸。另外，同樣在標(biāo)本是食品的情況下，重要的是設(shè)計不與食品中所含的檢測對象以 外的生物來源的堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的特定寡核苷酸。
為了檢測血液中的游離DNA，只要是與游離DNA的量相關(guān)的區(qū)域即可，在以游離 DNA的定量或檢測為目的的情況下，優(yōu)選基因組中的相同序列特別重復(fù)數(shù)次以上的所謂重 復(fù)序列，更優(yōu)選簡單重復(fù)序列(串聯(lián)重復(fù)序列、或稱為串聯(lián)重復(fù))、散在重復(fù)序列。簡單重復(fù)序列的特征在于，相同序列在相同方向上相鄰存在，已知有衛(wèi)星DNA、小 衛(wèi)星、微衛(wèi)星、著絲粒、端粒、動粒、核糖體集團(tuán)基因之類的一系列堿基序列等。散在重復(fù)序列的特征在于，相同序列不相鄰而散在，認(rèn)為是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子來源的 DNA。散在重復(fù)序列根據(jù)堿基序列的長度分類成SINE (Short Interspersed Repetitive Element 短鏈散在重復(fù)序列)和LINE (Long Interspersed Elements 長鏈散在重復(fù)序 列)，作為人的堿基序列，Alu序列、LINE-I序列分別作為代表性的重復(fù)序列而被周知。另 外，還已知有從RNA、蛋白質(zhì)反轉(zhuǎn)錄的失活的加工后的假基因、通過基因重復(fù)而擴(kuò)增的基因 序列。重復(fù)基因是指一個基因組上存在多個具有高同源性的基因的情況，在大多數(shù)情況 下，是在一個基因附近串聯(lián)排列而存在的堿基序列。需要說明的是，假基因也多是重復(fù)基因之一。作為重復(fù)序列的具體例，例如，作為含有比較短的堿基序列的重復(fù)，已知有(A) n、(T) η、(GA) η、(CA) η、(TAA) η、(GGA) η、(CAGC) η、(CATA) η、(GAAA) η、(TATG) η、(TTTG) η、 (TTTA) η、(TTTC) η、(TAAA) η、(TTCA) η、(TATAA) η、(TCTCC) η、(TTTCC) η、(TTTAA) η、(TTTTC) η、 (TTTTA) η、(TTTTG) η、(CAAAA) η、(CACCC) η、(TATATG) η、(CATATA) η、(TCTCTG) η、(AGGGGG) η、 (CCCCCA) η, (TGGGGG) η (η是指重復(fù)數(shù)量)等序列，作為轉(zhuǎn)錄因子來源的序列，hAT組可以舉 出 MERl-Charlie、Zaphod，Tc-I 組可以舉出 MER2_Tigger、iTc-I、Mariner。除此之外，具體 還已知有Tiggerl、Tiggerfa、Tigger5、Charlie4a、Charlie7等。這些序列通常是短且簡單 的堿基序列，難以設(shè)定后述的特定粘附序列和檢測用粘附序列，只要具有本發(fā)明方法中的、 可以設(shè)定為后述的特定粘附序列及檢測用粘附序列的設(shè)定對象的序列，就可以用于本發(fā)明 的方法，并不需要作為本發(fā)明方法的對象而將其排除。另外，衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星、微衛(wèi)星等是 被分類為簡單重復(fù)序列的重復(fù)序列另外，作為基因中有多拷貝的序列，除了作為存在于著絲粒的序列的ALR6、作為 snRNA的U2、U6、以及像tRNA、rRNA那樣已知通常在基因組中有多拷貝的基因之外，還可以 舉出通過基因重復(fù)在基因組中有存在多拷貝的基因等。再者，關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒、末端具有LTR(長末端重復(fù)序列Lomg terminal repeat)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、MaLRs (哺乳類顯性LTR-反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Mammalian apparent LTR-Retrotransposons)之類的認(rèn)為是病毒來源的內(nèi)源序列、逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的LTR，已知 在一個基因組中存在多個。例如，作為逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的LTR，具體而言，已知有LTR1、LTR1B、LTR5、LTR7、 LTR8、LTR16A1、LTR16A1、LTR16C、LTR26、LTR26E, MER48、MLT2CB 等亞家族。另外，反轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)座子來源的LTR被分類成ERV、ERVK, ERVL的各種類，具體而言，可以舉出LTR8A、LTR28、 MER21B、MER83、MER31B、MER49、MER66B、HERVH, ERVL, LTR16A1、LTR33A、LTR50、LTR52、 MLT2A1、MLT2E、MER11C、MERllC等亞家族。進(jìn)而，MaLRs是指與典型的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子一樣 在其序列的兩端含有LTR但夾在LTR之間的內(nèi)部序列是非來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒的序列的DNA 因子。例如可以舉出 MLTlAl、MLT1A2、MLTIB, MLT1C、MLTID, MLT1F、MLT1G、MLT1H、MLT1J、MLT1K、MLTlI、MLT2CB、MSTA、MSTA-int、MSTB、THE1A、THE IB, THElB-internal、THEl 等亞家族。散在重復(fù)序列的特征在于，相同序列不相鄰而是散在，認(rèn)為來源于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座 子。另外，散在重復(fù)序列根據(jù)其長度被分類成SINE(Short Interspersed Repetitive Element 短鏈散在重復(fù)序列)和LINE (Long In terspersed Elements 長鏈散在重復(fù)序 列)。SINE當(dāng)中大部分是屬于Alu家族的序列。作為特征，具有7SL RNA的3’側(cè)的序列或5’ 側(cè)的序列，且具有夾在稱為左單體(Left-monomer)和右單體(Right-monomer)的區(qū)域之間 AT-Rich 區(qū)域。作為 Alu 家族的亞家族，可以舉出 Alu、AluJb、AluJo、Ali^c、AluSg、AluSp、 AluSq、Alu&uAluY，進(jìn)而可以舉出 FAM (Fossil Alu Monomer)、具有 FAM 序列的 FLAM (Free Left Alu Monomer)禾口 FRAM(Free Right Alu Monomer)。作為 Alu 家族以夕卜的 SINE,已 知有MIR、及Ther/iOR3，作為亞家族，已知有MR、MIR3。除此之外，作為其他生物種的Alu 家族的亞家族，已知有Bi、B2、B4、PBU PBlD等。作為LINE，報告有LINEl Line23的亞 家族，但已知LINE-1、LINE2、LINE3廣泛存在于基因組。需要說明的是，關(guān)于LINE-1，例如 已知有 L1M1、L1M2、L1M3、LlM3d、L1M4、LlM4c、L1MA2、L1MA7、L1MA8、L1MA9、LlMBU LlMBU L1MB3、L1MB4、L1MB5、L1MB6、L1MB7、LIMCa、LlMCb、L1MC2、L1MC3、L1MC4、LlMC4a、L1MC5、 LIMDa, LIME、LlMEc, LlMEcU LIMEg、LlMEl、L1ME2、L1ME3、L1ME3A、L1ME3B、LlME4a、L1PB3、 L1P4、L1PA2、L1PA3、L1PA4、L1PA5、L1PA6、L1PA7、L1PA10、L1PA12、L1PA13、L1PA14、L1PA16、 L1PB1、L1PB3、L1PB4、L1PREC2、HAL1 的亞家族，作為 LINE-2，已知有 L2、L2c 的亞家族。需 要說明的是，例如，對于Alu家族或Alu的亞家族共同的序列、LINE-I家族或LINE-I的亞 家族共同的序列，只要能夠設(shè)定后述的特定粘附序列及檢測用粘附序列，一個基因組中可 以設(shè)定多個檢測對象，所以可以使基因組的檢測的靈敏度更高。作為目標(biāo)DNA區(qū)域，具體而言，例如可以舉出LINE-I的部分序列(序列編號37)、 Alu的部分序列(序列編號39所示的堿基序列)或與它們示出同源性的堿基序列等。例如在想要對某區(qū)域中的重復(fù)序列進(jìn)行調(diào)查時，難以在PubMed等通常的序 列檢索的數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，使用R印base (http //www. girinst. org/repbase/)、 RepeatMasker (http //www. repeatmasker. org/)等數(shù)據(jù)庫即可。只要能夠設(shè)定本發(fā)明方法 的特定粘附序列和檢測用粘附序列，就可以提高檢測靈敏度。進(jìn)而，對這些重復(fù)序列進(jìn)行測 定，例如可以作為血液中的游離DNA量的替代標(biāo)志進(jìn)行處理，在注意到生物種特異性的重 復(fù)序列的情況下，可以用于生物種的確定等。在本發(fā)明方法中，只要對重復(fù)序列進(jìn)行測定，就可以同時測定一個基因組中存在 的多個堿基序列。例如與序列編號37所示的堿基序列具有80%以上的序列一致性的堿基 序列在人基因組中有約280拷貝；與序列編號39所示的堿基序列具有80%以上的同源性 的堿基序列在人基因組中有約820拷貝。因此，只要可以在各堿基序列中設(shè)定檢測用粘附 序列和特定粘附序列，那么與在1個基因組中僅對一種序列設(shè)定檢測用粘附序列和特定粘 附序列的情況相比，理論上可以將1個基因組的檢測靈敏度提高觀0 820倍。“重復(fù)基因”是指通過基因重復(fù)使基因組中的特定基因或基因片段加倍而產(chǎn)生的 基因或基因片段?；蛑貜?fù)是指含有基因的DNA的某區(qū)域重復(fù)的現(xiàn)象。作為發(fā)生基因重復(fù) 的原因，有基因重組的異常、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移、染色體全體的重復(fù)等。例如是指1個基 因被復(fù)制而插入到基因組DNA，有向不同的染色體位置插入的情況和向原始基因的附近插入的情況。通過向原始基因附近的插入，將被拷貝的基因排列的場所稱為串聯(lián)重復(fù)，將通過 基因重復(fù)作成的基因的組稱為基因族(或基因家族)?！凹倩颉笔侵妇哂蠨NA的序列當(dāng)中假設(shè)已對基因產(chǎn)物(特別是蛋白質(zhì))進(jìn)行編碼 之類的特征性的堿基序列但當(dāng)前功能喪失的基因。認(rèn)為會有具有原始功能的序列發(fā)生了突 變的結(jié)果。例如，有通過突變而產(chǎn)生終止密碼子從而蛋白質(zhì)的肽鏈縮短而不能發(fā)揮作為蛋 白質(zhì)的功能的情況、通過一個堿基置換等突變使正常轉(zhuǎn)錄所需的調(diào)節(jié)序列喪失功能的情況 等。假基因多是原始正?；蚍珠_殘留的情況，也有單獨成為假基因的情況。假基因可以根據(jù)基因序列的特征分成3類。有插入到通過反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄 酶從mRNA作成的DNA基因組的情況(加工型假基因)、在基因組內(nèi)原始基因序列發(fā)生重復(fù) 且其拷貝當(dāng)中的一部分因突變等而功能喪失成為假基因的情況(重復(fù)假基因或非加工型 假基因)、及基因組內(nèi)的基因會因(沒有重復(fù)基因而是單基因情況)喪失功能而成為假基因 的情況。當(dāng)前，在作為假基因而被周知的基因中，作為被轉(zhuǎn)錄的例子、具有基因功能的例子 (是否應(yīng)被稱為假基因尚未確定)被周知，本發(fā)明方法中的“假基因”，并非指基因功能的有 無或是否可以轉(zhuǎn)錄，而是指上述的“加工型假基因”和“重復(fù)假基因(非加工型假基因)”。具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA為基因組中的重復(fù)序列時，重復(fù)序列為具有同源性的一 群堿基序列，因此具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA與檢測用粘附序列的互補(bǔ)堿基配對中，全部的堿 基序列有可能不與具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA堿基配對。具體而言，作為LINE序列，對序列 編號37具有80%以上同源性的堿基序列在基因組中為約280拷貝、作為SINE(Alu)序列， 對序列編號39具有80%以上同源性的堿基序列在基因組中可見約820拷貝。但是，在這些 基因組中可見的具有同源性的堿基序列相對于序列編號37及序列編號39含有一個堿基至 數(shù)個堿基不同。在本發(fā)明方法的第一工序中，優(yōu)選通過存在高濃度鈉鹽的體系從標(biāo)本提取DNA。具 體而言，作為用于在本發(fā)明方法的第一工序中從標(biāo)本中獲得DNA的DNA提取操作所使用的 溶液(例如緩沖液)中的鈉鹽濃度，至少為50mM以上，優(yōu)選為IOOmM以上。更具體而言，為 50mM以上IOOOmM以下，優(yōu)選IOOmM以上IOOOmM以下，更優(yōu)選IOOmM以上200mM以下。另 外，只要是含有鈉離子的鹽，可以是含有NaCl、NaC03、Na2SO4等的任意鹽，優(yōu)選NaCl。本發(fā)明是選出癌癥患者來源的標(biāo)本的方法，包括如下的工序通過發(fā)明1 13中 任一項記載的方法對被檢者來源的標(biāo)本進(jìn)行定量或檢測得到的DNA的定量結(jié)果或檢測結(jié) 果、與利用相同方法對健康者來源的標(biāo)本進(jìn)行定量或檢測得到的DNA的定量結(jié)果或檢測結(jié) 果之間的差異如有顯著性意義，則將被檢者來源的標(biāo)本作為癌癥患者來源的標(biāo)本進(jìn)行評 價，根據(jù)該評價的結(jié)果來鑒定癌癥患者來源的標(biāo)本的工序。作為該發(fā)明的優(yōu)選實施方式，可 以舉出標(biāo)本是哺乳動物來源的血清的發(fā)明，另外還可以舉出，具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA是哺 乳動物來源的血清中的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的游離DNA的發(fā)明。只要利用這些發(fā)明，就可以 通過血液檢查簡單確定癌癥患者。在這里，“癌癥患者”是指癌癥發(fā)病的被檢者，作為癌，包括肺癌(非小細(xì)胞肺癌、小 細(xì)胞肺癌)、食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、直腸癌、肝癌(肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌)、膽 囊癌、膽管癌、胰癌、結(jié)腸癌、肛門癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、外陰癌、陰道癌、前列 腺癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、陰莖癌、睪丸癌、上頌竇癌、舌癌、(鼻、口、下)咽癌、喉癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、惡性 淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征、甲狀腺癌、腦癌、骨肉瘤、皮膚癌(基底細(xì)胞癌、鱗狀上皮細(xì) 胞癌)等在人及哺乳類的臟器發(fā)生的實體癌和在人及哺乳類的血液發(fā)病的非實體癌的任意癌。實施例以下通過實施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實施例。實施例1使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，根據(jù) 商品目錄中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物 素標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖 液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液而冷藏保存。制備合成而得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的0. 5μ g/mLO. 1 % BSA含有磷酸緩 沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液，將其以各 IOOyL 的比例添 加到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條(Perkin Elmer公司制)，在室溫下放置約1小時，將 其固定化至孔中。之后，用移液去除溶液，添加200μ L的清洗緩沖液[含0.05%Tween20 磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20U54mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析去除該緩沖 液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法中使用的固定化甲基化DNA抗體的制對購自克隆技術(shù)(Clontech)公司的人血液來源基因組DNA，使用以下的序列編號 17及序列編號18所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物(PFl及冊1)和反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR， 從而將作為供試樣品使用的DNA片斷(X、序列編號19、相當(dāng)于基因庫檢索號No.NT_029419 等所示的堿基編號25687390-25687775的區(qū)域)擴(kuò)增。<為PCR而設(shè)計寡核苷酸引物>PFl :5，-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3，(序列編號 17)PRl :5，-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3，(序列編號 18)<DNA 片斷〉X5 ’-CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGA GCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACC TGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAG CACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCG GCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCT CCAGTTTGGCCAG-3，(序列編號 19)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，即，混合成為模板的基因組DNA10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliiTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下30秒鐘接著在61°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下45秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。之后，利用2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit(PR0MEGA公司)，精制DNA片斷X。關(guān)于DNA片段X，以下的溶液分別制備了雙份。溶液A =DNA 片斷 X 10ng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 X lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =DNA 片斷 X 0. lng/10 μ L TE 緩沖液溶液D =TE緩沖液(陰性對照液)將所得的各溶液10 μ LJssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ IUOx NEBuf fer2 (NEB 公司制)5 μ 1和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1混合，向其中添加滅菌超純 水使液量為50 μ 1而制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第一工序)。合成含有可以與含有序列編號20所示目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸X’互補(bǔ)性結(jié)合的 序列編號21所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F1，制備0. 02 μ M的Tris-HCl 緩沖液(IOmM)溶液?！春心繕?biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸>X’ 5’ -CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTG AGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACAC CTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCA GCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGC GGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGMAGTCACCGCCAGCACGGCGATC TCCAGTTTGGCCAG-3，(序列編號 20)<5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>Fl :5，-CTGGCCAAACTGGAGAT-3，(序列編號 21)對所得到的各反應(yīng)液，進(jìn)行以下的處理。向PCR管中添加上述制備的反應(yīng)液40 μ L、上述的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸溶 液 10μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖 醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L和lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超 純水，使液量為100 μ L，進(jìn)行混合。之后，將該PCR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C 并在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返 回至室溫，促進(jìn)了 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸與DNA片斷的結(jié)合體的形成(以上，相當(dāng)于本 發(fā)明方法的第二工序)。向固定化有上述生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條 中，添加上述制備的DNA片斷的反應(yīng)液IOOyL,在室溫下放置1小時。之后，通過移液除去 溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過移液除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)兩次(以上，相當(dāng) 于本發(fā)明方法的第三工序)。之后，以100 μ L的比例向各孔中添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jacks on ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005μ g/ΙΟΟμ L 0. 1 % BSA含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，向各 孔中添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP07H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室 溫放置約15分鐘，向各孔中以50 μ L的比例添加停止溶液ON H2SO4水溶液)，停止反應(yīng)。 在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法的第四工序)。 將其結(jié)果示于圖1。溶液A、溶液B及溶液C中，與溶液D相比，可見吸光度的增加。另外， 其強(qiáng)度依賴于DNA片斷的濃度而增加。在本實驗中可知，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被 甲基化了的DNA片斷與固定化了的5’末端生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù) 合體中的FITC進(jìn)行定量·檢測，可以進(jìn)行DNA片斷的檢測·定量。實施例2使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，按照 商品目錄中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物 素標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖 液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液而冷藏保存。制備合成而得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的0. 5μ g/mLO. 1 % BSA含有磷酸緩 沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液，將其以各 IOOyL 的比例添 加到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條(Perkin Elmer公司制)，在室溫下放置約1小時，將 其固定化至孔中。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20 磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20U54mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖 液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法中使用的固定化甲基化DNA抗體的制對購自克隆技術(shù)(Clontech)公司的人血液來源基因組DNA，使用以下的序列編號 17及序列編號18所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物(PFl及冊1)和反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR， 從而將作為供試樣品使用的DNA片斷(X、序列編號19、相當(dāng)于基因庫檢索號No.NT_029419 等所示的堿基編號25687390-25687775的區(qū)域)擴(kuò)增。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PFl :5，-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3，(序列編號 17)PRl :5，-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3，(序列編號 18)<DNA 片斷〉X5，-CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGA GCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACC TGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAG CACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCG GCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCT CCAGTTTGGCCAG-3，(序列編號 19)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&吐 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliiTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下30秒鐘接著在61°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下45秒鐘為1個循環(huán)的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR之后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)，精制DNA片斷X。關(guān)于DNA片斷X，制備以下的溶液。溶液A DNA 片斷 X IOng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 X lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =DNA 片斷 X 0. lng/10 μ L TE 緩沖液溶液D =TE緩沖液(陰性對照液)另外，對購自克隆技術(shù)(Clontech)公司的人血液來源基因組DNA，使用以下的 序列編號22及序列編號23所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物(PF2及冊2)和反應(yīng) 條件，進(jìn)行PCR，從而將作為供試樣品使用的DNA片斷(Y、序列編號24、與基因庫檢索號 No. AC009800等所示的堿基編號76606-767 相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)擴(kuò)增。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PF2 5' -TGAGCTCCGTAGGGCGTCC-3‘(序列編號 2 PR2 :5，-GCGCCGGGTCCGGGCCC-3，(序列編號 23)<DNA 片斷〉Y5，-GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTC AACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3，(序列編號 24)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&吐 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliiTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下30秒鐘接著在60°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下45秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行50個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR之后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)，精制DNA片斷Y。關(guān)于DNA片斷Y，制備以下的溶液。溶液A DNA 片斷 Y IOng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 Y lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =DNA 片斷 Y 0. lng/10 μ L TE 緩沖液溶液D =TE緩沖液(陰性對照液)分別將上述制備的DNA片斷X的溶液A與DNA片斷Y的溶液A，DNA片斷X的溶液 B與DNA片斷Y的溶液B，DNA片斷X的溶液C與DNA片斷Y的溶液C，DNA片斷X的溶液D 與DNA片斷Y的溶液D混合，制備以下所示的DNA片斷混合溶液MA MD各兩份。溶液MA 10ng/20 μ L TE 緩沖液溶液MB lng/20 μ L TE 緩沖液溶液MC 0. lng/20 μ L TE 緩沖液溶液MD =TE緩沖液(陰性對照液)將所得的各溶液20 μ LJssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ IUOx NEBuf fer2 (NEB公司制)5 μ 1和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1混合，向其中添加滅菌超純 水使液量為50 μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第一工序)。合成含有可以與含有序列編號20所示目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸X’互補(bǔ)性結(jié)合的 序列編號21所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F1，制備0. 02 μ M的Tris-HCl 緩沖液(IOmM)溶液?！春心繕?biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸>X ’ 5 ’ -CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTG AGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACAC CTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCA GCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGC GGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATC TCCAGTTTGGCCAG-3，(序列編號 20)<5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>Fl :5，-CTGGCCAAACTGGAGAT-3，(序列編號 21)對所得到的各反應(yīng)液，進(jìn)行以下的處理。向PCR管中添加上述制備的反應(yīng)液40 μ L、上述的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸溶 液 10μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖 醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L和lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超 純水，使液量為100 μ L，進(jìn)行混合。之后，將該PCR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C 并在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返 回至室溫，促進(jìn)了 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸與DNA片斷的結(jié)合體的形成(以上，相當(dāng)于本 發(fā)明方法的第二工序)。向固定化有上述生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條 中，添加上述制備的DNA片斷的反應(yīng)液IOOyL,在室溫下放置1小時。之后，通過移液除去 溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過移液除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng) 于本發(fā)明方法的第三工序)。之后，向各孔中以100 μ L的比例，添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005μ g/ΙΟΟμ L 0. 1 % BSA含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，向 各孔添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫放置約30分鐘，向各孔中以50 μ L的比例添加停止溶液QN H2SO4水溶 液)，停止反應(yīng)。在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度。(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第四工序)將其結(jié)果示于圖2。溶液MA、溶液MB及溶液MC中，與溶液MD相比，可見吸光度的 增加。另外其強(qiáng)度依賴于DNA片斷的濃度而增加。
本實驗中可知，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被甲基化了的DNA片斷和固定化的 5’末端生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù)合體中的FITC進(jìn)行定量、檢測，可 以進(jìn)行DNA片斷的檢測·定量。實施例3使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，按照 商品目錄中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物 素標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖 液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液而冷藏保存。制備合成而得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的0. 5μ g/mLO. 1 % BSA含有磷酸緩 沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液，將其以各 IOOyL 的比例添 加到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條(Perkin Elmer公司制)，在室溫下放置約1小時，將 其固定化至孔中。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20 磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20U54mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖 液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法中使用的固定化甲基化DNA抗體的制對購自克隆技術(shù)(Clontech)公司的人血液來源基因組DNA，使用以下的序列編號 17及序列編號18所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物(PFl及冊1)和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR， 從而將作為供試樣品使用的DNA片斷(X、序列編號19、相當(dāng)于基因庫檢索號No.NT_029419 等所示的堿基編號25687390-25687775的區(qū)域)擴(kuò)增。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PFl :5，-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3，(序列編號 17)PRl 5' -CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3'(序列編號 I8)<DNA 片斷〉X5，-CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGA GCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACC TGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAG CACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCG GCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAMGTCACCGCCAGCACGGCGATCT CCAGTTTGGCCAG-3，(序列編號 19)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&吐 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliiTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下30秒鐘接著在61°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下45秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR之后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷X。關(guān)于DNA片斷X，制備以下的溶液。溶液A DNA 片斷 X IOng/10 μ L TE 緩沖液
溶液B =DNA 片斷 X lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =DNA 片斷 X 0. lng/10 μ L TE 緩沖液溶液D =TE緩沖液(陰性對照液)另外，對購自克隆技術(shù)(Clontech)公司的人血液來源基因組DNA，使用以下的序 列編號22及序列編號23所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物(PF2及冊2)及反應(yīng)條件進(jìn) 行PCR，從而將作為供試樣品的DNA片斷(Y、序列編號24、與基因庫檢索號No. AC009800等 所示的堿基編號76606-767 相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)擴(kuò)增。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PF2 5' -TGAGCTCCGTAGGGCGTCC-3‘(序列編號 2 PR2 :5，-GCGCCGGGTCCGGGCCC-3，(序列編號 23)<DNA 片斷〉Y5，-GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTC AACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3，(序列編號 24)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&吐 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliiTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下30秒鐘接著在60°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下45秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行50個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷Y。關(guān)于DNA片斷Y，制備以下的溶液。溶液A DNA 片斷 Y IOng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 Y lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =DNA 片斷 Y 0. lng/10 μ L TE 緩沖液溶液D =TE緩沖液(陰性對照液) 分別將上述制備的DNA片斷X的溶液A與DNA片斷Y的溶液A，DNA片斷X的溶液 B與DNA片斷Y的溶液B，DNA片斷X的溶液C與DNA片斷Y的溶液C，DNA片斷X的溶液D 與DNA片斷Y的溶液D混合，制備以下所示的DNA片斷混合溶液MA MD各2份。溶液MA 10ng/20 μ L TE 緩沖液溶液MB lng/20 μ L TE 緩沖液溶液MC 0. lng/20 μ L TE 緩沖液溶液MD =TE緩沖液(陰性對照液)將所得的各溶液20 μ LJssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ IUOx NEBuf fer2 (NEB 公司制)5 μ 1與3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1混合，向其中添加滅菌超純 水使液量為50 μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第一工序)。合成含有可以與含有序列編號25所示目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸Y’互補(bǔ)性結(jié)合的 序列編號沈所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F2，制備0. 02 μ M的Tris-HCl緩沖液(IOmM)溶液?！春心繕?biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸>Y ’ 5 ’ -GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCT CAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3，(序列編號 25)<5，末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>F2 :5，-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3，(序列編號 26)對所得到的各反應(yīng)液，進(jìn)行以下的處理。向PCR管中添加上述制備的反應(yīng)液40 μ L、上述的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸溶 液 10μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖 醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L和lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超 純水，使液量為100 μ L，進(jìn)行混合。之后，將該PCR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C 并在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返 回至室溫，促進(jìn)了 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸與DNA片斷的結(jié)合體的形成(以上，相當(dāng)于本 發(fā)明方法的第二工序)。向固定化有上述生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條 中，添加上述制備的DNA片斷的反應(yīng)液IOOyL,在室溫下放置1小時。之后，通過移液除去 溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過移液除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng) 于本發(fā)明方法的第三工序)。之后，向各孔中以100 μ L的比例添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jacks on ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005μ g/ΙΟΟμ L 0. 1 % BSA含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，向各 孔中添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫下放置約30分鐘，向各孔中以50 μ L的比例添加停止溶液QN H2SO4水溶 液)，將反應(yīng)停止。在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度。(以上，相當(dāng)于本發(fā)明 方法的第四工序)將結(jié)果示于圖3。溶液MA及溶液MB中與溶液MD相比較，可見吸光度的增加。另 外，其強(qiáng)度依賴于DNA片斷的濃度而增加。本實驗中可知，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被甲基化了的DNA片斷和固定化的 5’末端生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù)合體中的FITC進(jìn)行定量·檢測，可 以進(jìn)行DNA片斷的檢測·定量。實施例4使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，按照 商品目錄中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物 素標(biāo)記。將所得生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體作為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖液 (ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液而冷藏保存。制備合成而得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的0. 5μ g/mL0. 1 % BSA含有磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液，將其以各 IOOyL 的比例添 加到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條(Perkin Elmer公司制)，在室溫下放置約1小時，將 其固定化至孔中。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20 磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20U54mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖 液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法中使用的固定化甲基化DNA抗體的制對購自克隆技術(shù)(Clontech)公司的人血液來源基因組DNA，使用以下的序列編號 17及序列編號18所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物(PFl及冊1)和反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR， 從而將作為供試樣品使用的DNA片斷(X、序列編號19、相當(dāng)于基因庫檢索號No.NT_029419 等所示的堿基編號25687390-25687775的區(qū)域)擴(kuò)增。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PFl :5，-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3，(序列編號 17)PRl 5' -CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3'(序列編號 I8)<DNA 片斷〉X5，-CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGA GCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACC TGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAG CACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCG GCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCT CCAGTTTGGCCAG-3，(序列編號 19)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&吐 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliiTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下30秒鐘接著在61°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下45秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷X。關(guān)于DNA片斷X，制備以下的溶液。溶液A DNA 片斷 X IOng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 X lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =DNA 片斷 X 0. lng/10 μ L TE 緩沖液溶液D =TE緩沖液(陰性對照液)另外，對購自克隆技術(shù)(Clontech)公司的人血液來源基因組DNA，使用以下的 序列編號22及序列編號23所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物(PF2及冊2)和反應(yīng) 條件進(jìn)行PCR，從而將作為供試樣品使用的DNA片斷(Y、序列編號M、與基因庫檢索號 No. AC009800等所示的堿基編號76606-767 相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)擴(kuò)增。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PF2 5' -TGAGCTCCGTAGGGCGTCC-3，(序列編號 2
PR2 :5，-GCGCCGGGTCCGGGCCC-3，(序列編號 23)<DNA 片斷〉 Y5，-GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTC AACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3，(序列編號 24)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&吐 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliiTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而成的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下30秒鐘接著在60°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下45秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行50個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR之后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷Y。關(guān)于DNA片斷Y，制備以下的溶液。溶液A DNA 片斷 Y IOng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 Y lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =DNA 片斷 Y 0. lng/10 μ L TE 緩沖液溶液D =TE緩沖液(陰性對照液)分別將上述制備的DNA片斷X的溶液A與DNA片斷Y的溶液A，DNA片斷X的溶液 B與DNA片斷Y的溶液B，DNA片斷X的溶液C與DNA片斷Y的溶液C、DNA片斷X的溶液D 與DNA片斷Y的溶液D混合，制備以下所示的DNA片斷混合溶液MA MD各兩份。溶液MA 10ng/20 μ L TE 緩沖液
溶液 MB lng/20 μ L TE 緩沖液溶液MC 0. lng/20 μ L TE 緩沖液溶液MD =TE緩沖液(陰性對照液)將所得的各溶液10 μ LJssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ IUOx NEBuf fer2 (NEB 公司制)5 μ 1和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1混合，向其中添加滅菌超純 水使液量為50 μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第一工序)。合成含有可以與含有序列編號20所示的目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸X’互補(bǔ)性結(jié)合 的序列編號21所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F1，另外，合成含有可以與含 有序列編號25所示的目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸Y’互補(bǔ)性結(jié)合的序列編號沈所示的堿基 序列的5，末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F2，制備各濃度為0.02 μ M的Tris-HCl緩沖液(IOmM) 溶液。〈含有目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸〉X’ 5’ -CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTG AGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACAC CTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCA GCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGC GGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3，(序列編號 20)Y’ 5’ -GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCT CAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3，(序列編號 25)<5，末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>Fl :5，-CTGGCCAAACTGGAGAT-3，(序列編號 21)F2 :5，-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3，(序列編號 26)對所得到的各反應(yīng)液，進(jìn)行以下的處理。向PCR管中，添加上述制備的反應(yīng)液40 μ L、上述的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸溶 液 10μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖 醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L和lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超 純水，使液量為100 μ L，進(jìn)行混合。之后，將該PCR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C 并在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返 回至室溫，促進(jìn)了 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸與DNA片斷的結(jié)合體的形成(以上，相當(dāng)于本 發(fā)明方法的第二工序)。向固定化有上述生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條 中，添加上述制備的DNA片斷的反應(yīng)液IOOyL,在室溫下放置1小時。之后，通過移液除去 溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過移液除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng) 于本發(fā)明方法的第三工序)。之后，向各孔以100 μ L的比例添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005μ g/ΙΟΟμ L 0. 1 % BSA含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，向 各孔添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫下放置約30分鐘，向各孔中以50 μ L的比例添加停止溶液QN H2SO4水溶 液)，停止反應(yīng)。在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度。(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第四工序)將其結(jié)果示于圖4。在溶液MA、溶液MB及溶液MC中，與溶液MD相比，可見吸光度 的增加。另外，其強(qiáng)度依賴于DNA片斷的濃度而增加。本實驗中可知，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被甲基化了的DNA片斷和固定化的 5’末端生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù)合體中的FITC進(jìn)行定量·檢測，可 以進(jìn)行DNA片斷的檢測·定量。實施例5使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，按照 商品目錄中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物 素標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖 液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液而冷藏保存。制備合成而得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的0. 5μ g/mL0. 1 % BSA含有磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液，將其以各 IOOyL 的比例添 加到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條(Perkin Elmer公司制)，在室溫下放置約1小時，將 其固定化至孔中。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20 磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20U54mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖 液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法中使用的固定化甲基化DNA抗體的制用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母酵 母株X2180-1A,直到濁度為OD600 0. 6-1. 0，以10000 X g離心10分鐘，制備Ix IO7的酵母細(xì) 胞。使用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學(xué)方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī) 的酵母基因組的制備法，從所制備的酵母細(xì)胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細(xì)胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 0. 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直 至溶液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B (50mM Tris-HCl.pH 7.4、20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育 30分鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進(jìn)行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離 心30分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙 醇，充分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并 進(jìn)行回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCl.pH 8. OUmM EDTA)， 添加RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添 加蛋白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)后， 在55°C下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進(jìn)行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8. 0)飽和]/氯仿提取處理?；厥账畬?，向其中添加NaCl并使其為0. 5N，然后對其進(jìn)行乙 醇沉淀處理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用以下的序列編號27及序列編號28所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物(PF3 及冊；3)和反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR，由此從得到的酵母基因組DNA擴(kuò)增作為供試樣品使用的DNA 片斷(S、序列編號四、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示酵母染色體VII的堿基編號 271743-272083相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PF3 5' -AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3‘(序列編號 2了)PR3 :5，-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3，(序列編號 28)<DNA 片斷〉S:5，-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTT GTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTG TGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCA TAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTG GCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 29)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&吐 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliiTaqGold) 5U/μ 10. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下20秒鐘接著在58°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷S。關(guān)于DNA片斷S，分別制備以下溶液各兩份。溶液A DNA 片斷 S 10ng/20 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 S lng/20 μ L TE 緩沖液溶液C =DNA 片斷 S 0. lng/20 μ L TE 緩沖液溶液D =TE緩沖液(陰性對照液)將所得的各溶液20 μ LJssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ IUOx NEBuf fer2 (NEB 公司制)5 μ 1和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1混合，向其中添加滅菌超純 水使液量為50 μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第一工序)。合成含有可以與含有序列編號30所示的目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸S’互補(bǔ)性結(jié)合 的序列編號31所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F3，制備0. 02 μ M的Tris-HCl 緩沖液(IOmM)?！春心繕?biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸>S’ 5’ -AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCT TGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCT GTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGC ATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGT GGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 30)<5，末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>F3 :5，-CTGGCCAAACTGGAGAT-3，(序列編號 31)對所得到的各反應(yīng)液，進(jìn)行以下的處理。向PCR管中，添加上述制備的反應(yīng)液40 μ L、上述的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸溶 液 10μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖 醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L和lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超 純水，使液量為100 μ L，進(jìn)行混合。之后，將該PCR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C 并在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返 回至室溫，促進(jìn)了 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸與DNA片斷的結(jié)合體的形成(以上，相當(dāng)于本 發(fā)明方法的第二工序)。向固定化有上述生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條 中，添加上述制備的DNA片斷的反應(yīng)液IOOyL,在室溫下放置1小時。之后，通過移液除去 溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過移液除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng) 于本發(fā)明方法的第三工序)。之后，向各孔中以100 μ L的比例添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[JacksonImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005μ g/ΙΟΟμ L 0. 1 % BSA含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，向 各孔添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫下放置約30分鐘，向各孔中以50 μ L的比例添加停止溶液QN H2SO4水溶 液)，停止反應(yīng)。在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度。(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第四工序)將其結(jié)果示于圖5。溶液A、溶液B及溶液C中，與溶液D相比，可見吸光度的增加。 另外，其強(qiáng)度依賴于DNA片斷的濃度而增加。本實驗中可知，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被甲基化了的DNA片斷和固定化的 5’末端生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù)合體中的FITC進(jìn)行定量·檢測，可 以進(jìn)行DNA片斷的檢測·定量。實施例6使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，按照 商品目錄中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物 素標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖 液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液而冷藏保存。制備合成而得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的0. 5μ g/mLO. 1 % BSA含有磷酸緩 沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液，將其以各 IOOyL 的比例添 加到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條(Perkin Elmer公司制)，在室溫下放置約1小時，將 其固定化至孔中。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20 磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20U54mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖 液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法中使用的固定化甲基化DNA抗體的制用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母株 X2180-1A，直到濁度為OD600 0. 6-1. 0，以10000 Xg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細(xì)胞。使 用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學(xué)方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵母 基因組的制備法，從所制備的酵母細(xì)胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細(xì)胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7.4)中懸浮，添加 0. 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直 至溶液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B (50mM Tris-HCl.pH 7.4、20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育 30分鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進(jìn)行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離 心30分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙 醇，充分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并 進(jìn)行回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCl,pH8. OUmM EDTA)， 添加RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添 加蛋白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)后，在55°C下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進(jìn)行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8. 0)飽和]/氯仿提取處理。回收水層，向其中添加NaCl并使其為0. 5N，然后對其進(jìn)行乙 醇沉淀處理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用以下的序列編號27及序列編號觀所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物(PF3 及冊；3)和反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR，由此從得到的酵母基因組DNA擴(kuò)增作為供試樣品使用的DNA 片斷(S、序列編號四、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示酵母染色體VII的堿基編號 271743-272083相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PF3 :5，-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3，(序列編號 27)PR3 :5，-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3，(序列編號 28)<DNA 片斷〉S:5，-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTT GTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTG TGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCA TAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTG GCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 29)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&吐 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliiTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下20秒鐘接著在58°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷S。關(guān)于DNA片斷S，制備以下的溶液。溶液A DNA 片斷 S IOng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 S lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =TE緩沖液(陰性對照液)另外，使用以下的序列編號32及序列編號33所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引 物(PF4及PR4)和反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR，由此從得到的酵母基因組DNA擴(kuò)增作為供試樣品使 用的DNA片斷(Τ、序列編號34、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示的酵母染色體VII的 堿基編號384569-384685相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PF4 :5，-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3，(序列編號 32)PR4 :5，-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3，(序列編號 33)<DNA 片斷〉T:5，-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGG ACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3，(序列編號 34)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng,5口] 的上述引物溶液各3“1、6&(^ 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. Ol % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliiTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下20秒鐘接著在58°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷Τ。關(guān)于DNA片斷Τ，制備以下的溶液。溶液A DNA 片斷 T IOng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 T lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =TE緩沖液(陰性對照液) 分別將上述制備的DNA片斷S的溶液A與DNA片斷T的溶液A，DNA片斷S的溶液 B與DNA片斷T的溶液B、DNA片斷S的溶液C與DNA片斷T的溶液C混合，制備以下所示 的DNA片斷混合溶液MA MC各兩份。溶液MA 10ng/20 μ L TE 緩沖液溶液MB lng/20 μ L TE 緩沖液溶液MC =TE緩沖液(陰性對照液)將所得的各溶液20 μ LJssI甲基化酶(NEB公司制)0· 5μ IUOx NEBuf fer2 (NEB 公司制)5 μ 1和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1混合，向其中添加滅菌超純 水使液量為50 μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第一工序)。合成含有可以與含有序列編號30所示的目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸S’互補(bǔ)性結(jié)合 的序列編號31所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F3，制備0. 02 μ M的Tris-HCl 緩沖液(IOmM)溶液。〈含有目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸〉S’ 5’ -AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCT TGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCT GTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGC ATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGT GGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 30)<5，末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>F3 :5，-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3，(序列編號 31)對所得到的各反應(yīng)液，進(jìn)行以下的處理。向PCR管中，添加上述制備的反應(yīng)液40 μ L、上述的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸溶 液 10μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖 醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L和lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超 純水，使液量為100 μ L，進(jìn)行混合。之后，將該PCR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C 并在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返 回至室溫，促進(jìn)了 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸與DNA片斷的結(jié)合體的形成(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法的第二工序)。向固定化有上述生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條 中，添加上述制備的DNA片斷的反應(yīng)液IOOyL,在室溫下放置1小時。之后，通過移液除去 溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過移液除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng) 于本發(fā)明方法的第三工序)。之后，向各孔中以100 μ L的比例添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005 μ g/100 μ L 0. 1 % BSA 含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，向 各孔添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫下放置約60分鐘，向各孔中以50 μ L的比例，添加停止溶液QN H2SO4水溶 液)，停止反應(yīng)。在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度。(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第四工序)將結(jié)果示于圖6。溶液MA及溶液MB中，與溶液MC相比，可見吸光度的增加。另 外，其強(qiáng)度依賴于DNA片斷的濃度而增加。本實驗中可知，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被甲基化了的DNA片斷和固定化的 5’末端生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù)合體中的FITC進(jìn)行定量·檢測，可 以進(jìn)行DNA片斷的檢測·定量。實施例7使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，按照 商品目錄中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物 素標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖 液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液而冷藏保存。制備合成而得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的0. 5μ g/mL0. 1 % BSA含有磷酸緩 沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液，將其以各 IOOyL 的比例添 加到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條(Perkin Elmer公司制)，在室溫下放置約1小時，將 其固定化至孔中。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20 磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20U54mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖 液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法中使用的固定化甲基化DNA抗體的制用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母株 X2180-1A，直到濁度為OD600 0. 6-1. 0，以10000 Xg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細(xì)胞。使 用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學(xué)方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵母 基因組的制備法，從所制備的酵母細(xì)胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細(xì)胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 0. 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直 至溶液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B (50mM Tris-HCl.pH7.4、20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育 30分鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進(jìn)行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離 心30分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙 醇，充分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并 進(jìn)行回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCl,pH8. OUmM EDTA)， 添加RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添 加蛋白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)后， 在55°C下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進(jìn)行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8. 0)飽和]/氯仿提取處理?；厥账畬?，向其中添加NaCl并使其為0. 5N，然后對其進(jìn)行乙 醇沉淀處理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用以下的序列編號27及序列編號28所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物(PF3 及冊；3)和反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR，由此從所得的酵母基因組DNA擴(kuò)增作為供試樣品使用的DNA 片斷(S、序列編號四、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示酵母染色體VII的堿基編號 271743-272083相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PF3 5' -AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3‘(序列編號 2了)PR3 :5，-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3，(序列編號 28)<DNA 片斷〉S:5，-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTT GTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTG TGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCA TAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTG GCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 29)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&(^ 2mM dNTP 5 μ 1、IOX 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliiTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下20秒鐘接著在58°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。 進(jìn)行PCR后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷S。關(guān)于DNA片斷S，制備以下的溶液。溶液A DNA 片斷 S IOng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 S lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =TE緩沖液(陰性對照液)另外，使用以下的序列編號32及序列編號33所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引 物(PF4及PR4)和反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR，由此從所得的酵母基因組DNA擴(kuò)增作為供試樣品使 用的DNA片斷(Τ、序列編號34、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示的酵母染色體VII的 堿基編號384569-384685相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)。
<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PF4 5' -GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3‘(序列編號 3 PR4 :5，-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3，(序列編號 33)<DNA 片斷〉 T5，-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGG ACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3，(序列編號 34)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&吐 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliiTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下20秒鐘接著在58°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷Τ。關(guān)于DNA片斷Τ，制備以下的溶液。溶液A DNA 片斷 T IOng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 T lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =TE緩沖液(陰性對照液)分別將上述制備的DNA片斷S的溶液A與DNA片斷T的溶液A，DNA片斷S的溶液 B和DNA片斷T的溶液B，DNA片斷S的溶液C和DNA片斷T的溶液C混合，制備以下所示 DNA片斷混合溶液MA MC各兩份。溶液MA 10ng/20 μ L TE 緩沖液溶液MB lng/20 μ L TE 緩沖液溶液MC =TE緩沖液(陰性對照液)將所得的各溶液20 μ LJssI甲基化酶(NEB公司制)0· 5μ IUOx NEBuf fer2 (NEB 公司制)5 μ 1和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1混合，向其中添加滅菌超純 水使液量為50 μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第一工序)。合成含有可以與含有序列編號30所示的目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸S’互補(bǔ)性結(jié)合 的序列編號31所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F3，另外，合成含有可以與含 有序列編號35所示的目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸T’互補(bǔ)性結(jié)合的序列編號36所示的堿基 序列的5，末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F4，制備各濃度為0.02 μ M的Tris-HCl緩沖液(IOmM) 溶液?！春心繕?biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸〉S’ 5’ -AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCT TGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCT GTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGC ATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGT GGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 30)GACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3，(序列編號 35)<5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>F3 :5，-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3，(序列編號 31)F4 :5，-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3，(序列編號 36)對所得到的各反應(yīng)液，進(jìn)行以下的處理。向PCR管中，添加上述制備的反應(yīng)液40 μ L、上述的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸溶 液 10μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖 醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L和lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超 純水，使液量為100 μ L，進(jìn)行混合。之后，將該PCR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C 并在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返 回至室溫，促進(jìn)了 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸與DNA片斷的結(jié)合體的形成(以上，相當(dāng)于本 發(fā)明方法的第二工序)。向固定化有上述生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條 中，添加上述制備的DNA片斷的反應(yīng)液IOOyL,在室溫下放置1小時。之后，通過移液除去 溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過移液除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng) 于本發(fā)明方法的第三工序)。之后，向各孔中，以100 μ L的比例添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005μ g/ΙΟΟμ L 0. 1 % BSA含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，向各 孔中添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫下放置約60分鐘，向各孔中以50 μ L的比例，添加停止溶液QN H2SO4水溶 液)，停止反應(yīng)。在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度。(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第四工序)將其結(jié)果示于圖7。溶液MA及溶液MB中，與溶液MC相比，可見吸光度的增加。另 外，其強(qiáng)度依賴于DNA片斷的濃度而增加。本實驗中可知，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被甲基化了的DNA片斷和固定化的 5’末端生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù)合體中的FITC進(jìn)行定量·檢測，可 以進(jìn)行DNA片斷的檢測·定量。實施例8使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，按照 商品目錄中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物 素標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖 液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液而冷藏保存。制備合成而得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的0. 5μ g/mL0. 1 % BSA含有磷酸緩 沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液，將其以各 IOOyL 的比例添加到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條(Perkin Elmer公司制)，在室溫下放置約1小時，將 其固定化至孔中。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20 磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20U54mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖 液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法中使用的固定化甲基化DNA抗體的制對購自克隆技術(shù)(Clontech)公司的人血液來源基因組DNA，制備如下的溶液各兩 份。溶液A 人血液來源基因組DNA 100ng/5 μ L TE緩沖液溶液B 人血液來源基因組DNA 10ng/5 μ L TE緩沖液溶液C 人血液來源基因組DNA lng/5 μ L TE緩沖液溶液D =TE緩沖液(陰性對照液)將上述制備的各溶液5yL、限制性酶X sp I IOUJiX spl最適的IOx緩沖液 (200mM Tris-HCl pH 8. 5、IOOmM MgCl2、IOmM 二硫蘇糖醇、IOOOmM KCl) 2 μ 1 混合，向其中 添加滅菌超純水使液量為20 μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育1小時。將得到的各反應(yīng)液20 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0· 5 μ 1、10χ NEBuffer2 (NEB公司制)5 μ 1和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1混合，向其中 添加滅菌超純水使液量為50μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘(以上，相 當(dāng)于本發(fā)明方法的第一工序)。合成含有可以與含有在作為人轉(zhuǎn)座子而周知的LINEl區(qū)域設(shè)計的序列編號37所 示的目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸Z(與基因庫檢索號No. M80340等所示的堿基編號115-386 相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)互補(bǔ)性結(jié)合的序列編號38所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F5， 制備0. 02 μ M的Tris-HCl緩沖液(IOmM)溶液。〈含有目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸>Z:5’-TAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGG GCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCTGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGTCG CACCTGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTTAAGAAACGGCGCACCACGAGACT ATATCCCACACCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC-3，(序列編號 37)<5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>F5 :5，-CTGGCCAAACTGGAGAT-3，(序列編號 38)對所得到的各反應(yīng)液，進(jìn)行以下的處理。向PCR管中，添加上述制備的反應(yīng)液40 μ L、上述的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸溶 液 10μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖 醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L和lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超 純水，使液量為100 μ L，進(jìn)行混合。之后，將該PCR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C 并在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返 回至室溫，促進(jìn)了 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸與DNA片斷的結(jié)合體的形成(以上，相當(dāng)于本 發(fā)明方法的第二工序)。向固定化有上述生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條 中，添加上述制備的DNA片斷的反應(yīng)液IOOyL,在室溫下放置1小時。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過移液除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng) 于本發(fā)明方法的第三工序)。之后，向各孔中以100 μ L的比例，添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005μ g/ΙΟΟμ L 0. 1 % BSA含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，向各 孔中添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫下放置約10分鐘，向各孔中，以50 μ L的比例添加停止溶液QN H2SO4水溶 液)，停止反應(yīng)。在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法 的第四工序)。將其結(jié)果示于圖8。溶液A、溶液B及溶液C中，與溶液D相比，可見吸光度的增加。 另外，其強(qiáng)度依賴基因組DNA的濃度而增加。本實驗中可見，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被甲基化了的DNA片斷和固定化的 5’末端生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù)合體中的FITC進(jìn)行定量·檢測，可 以進(jìn)行DNA片斷的檢測·定量，可以進(jìn)行基因組DNA的檢測·定量。實施例9使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，按照 商品目錄中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物 素標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖 液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液而冷藏保存。制備合成而得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的0. 5μ g/mL0. 1 % BSA含有磷酸緩 沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液，將其以各 IOOyL 的比例添 加到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條(Perkin Elmer公司制)，在室溫下放置約1小時，將 其固定化至孔中。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20 磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20U54mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖 液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法中使用的固定化甲基化DNA抗體的制對購自克隆技術(shù)(Clontech)公司的人血液來源基因組DNA，制備以下的溶液各兩 份。溶液A 人血液來源基因組DNA 100ng/5 μ L TE緩沖液溶液B 人血液來源基因組DNA 10ng/5 μ L TE緩沖液溶液C 人血液來源基因組DNA lng/5 μ L TE緩沖液溶液D =TE緩沖液(陰性對照液)將上述制備的各溶液5 μ L、限制性酶MspI 4U、對MspI最適的IOx緩沖液(IOOmM Tris-HCl ρΗ 7. 5、IOOmM MgCl2、IOmM 二硫蘇糖醇、500mM NaCl) 2 μ 1 混合，向其中添加滅菌 超純水使液量為20 μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育1小時。將所得的各反應(yīng)液20 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1、10χNEBuffer2 (NEB公司制)5 μ 1和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1混合，向其中 添加滅菌超純水使液量為50μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘(以上，相 當(dāng)于本發(fā)明方法的第一工序)。合成含有可以與含有在作為人轉(zhuǎn)座子周知的Alu區(qū)域設(shè)計的序列編號39所示目 標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸W(與基因庫檢索號No. AF458110等所示的堿基編號178-262相當(dāng) 的區(qū)域)互補(bǔ)性結(jié)合的序列編號40所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F6，制備 0. 02 μ M 的 iTris-HCl 緩沖液(IOmM)溶液?！春心繕?biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸>W5，-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAG GTCAGGAGATCGAGACCATCC-3‘(序列編號 3Θ)<5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>F6 :5，-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3，(序列編號 40)對所得到的各反應(yīng)液，進(jìn)行以下的處理。向PCR管，添加上述制備的反應(yīng)液40 μ L、上述的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸溶 液 10μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖 醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L和lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超 純水，使液量為100 μ L，進(jìn)行混合。之后，將該PCR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C 并在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返 回至室溫，促進(jìn)了 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸與DNA片斷的結(jié)合體的形成(以上，相當(dāng)于本 發(fā)明方法的第二工序)。向固定化有上述生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條 中，添加上述制備的DNA片斷的反應(yīng)液IOOyL,在室溫下放置1小時。之后，通過移液除去 溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過移液除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng) 于本發(fā)明方法的第三工序)。之后，向各孔中以100 μ L的比例，添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005μ g/ΙΟΟμ L 0. 1 % BSA含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，向 各孔添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫下放置約8分鐘，向各孔中以50 μ L的比例添加停止溶液QN H2SO4水溶 液)，停止反應(yīng)。在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度。(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第四工序)將其結(jié)果示于圖9。溶液A、溶液B及溶液C中，與溶液D相比，可見吸光度的增加。 另外，其強(qiáng)度依賴基因組DNA的濃度而增加。本實驗中可知，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被甲基化了的DNA片斷和固定化的 5’末端生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù)合體中的FITC進(jìn)行定量·檢測，可 以進(jìn)行DNA片斷的檢測·定量，可以進(jìn)行基因組DNA的檢測·定量。
實施例10使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，按照 商品目錄中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物 素標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖 液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液而冷藏保存。制備合成而得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的0. 5μ g/mLO. 1 % BSA含有磷酸緩 沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液，將其以各 IOOyL 的比例添 加到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條(Perkin Elmer公司制)，在室溫下放置約1小時，將 其固定化至孔中。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20 磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20U54mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖 液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法中使用的固定化甲基化DNA抗體的制用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母酵 母株X2180-1A，直到濁度為OD600 0. 6-1. 0，以IOOOOXg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細(xì) 胞。使用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學(xué)方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī) 的酵母基因組的制備法，從所制備的酵母細(xì)胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細(xì)胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 0. 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直 至溶液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B (50mM Tris-HCl.pH 7.4、20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育 30分鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進(jìn)行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離 心30分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙 醇，充分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并 進(jìn)行回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCl,pH8. OUmM EDTA)， 添加RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添 加蛋白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)后， 在55°C下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進(jìn)行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8. 0)飽和]/氯仿提取處理。回收水層，向其中添加NaCl并使其為0. 5N，然后對其進(jìn)行乙 醇沉淀處理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用以下的序列編號27及序列編號28所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物(PF3 及冊；3)和反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR，由此從得到的酵母基因組DNA擴(kuò)增作為供試樣品使用的DNA 片斷(S、序列編號四、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示酵母染色體VII的堿基編號 271743-272083相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PF3 :5，-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3，(序列編號 27)PR3 :5，-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3，(序列編號 28)<DNA 片斷〉S:5，-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTT GTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCA TAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTG GCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 29)作為PCR的反應(yīng)液，使用以下的反應(yīng)液，即，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&吐 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliiTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下20秒鐘接著在58°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷S。關(guān)于DNA片斷S，分別制備以下溶液各兩份。溶液A DNA 片斷 S 10ng/20 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 S lng/20 μ L TE 緩沖液溶液C =DNA 片斷 S 0. lng/20 μ L TE 緩沖液溶液D =TE緩沖液(陰性對照液)將所得的各溶液20 μ LJssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ IUOx NEBuf fer2 (NEB 公司制)5 μ 1、3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1混合，向其中添加滅菌超純水 使液量為50 μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法 的第一工序)。合成含有可以與含有序列編號30所示目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸S’互補(bǔ)性結(jié)合的 序列編號31所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F3，制備0. 02 μ M的Tris-HCl 緩沖液(IOmM)。〈含有目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸>S’ 5’ -AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCT TGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCT GTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGC ATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGT GGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 30)<5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>F3 :5，-CTGGCCAAACTGGAGAT-3，(序列編號 31)另外，合成含有可以與含有序列編號30所示目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸S’的負(fù)鏈 互補(bǔ)性結(jié)合的、序列編號41、序列編號42、序列編號43、序列編號44、序列編號45、序列編號 46、序列編號47、序列編號48、序列編號49及序列編號50所示的堿基序列的反向寡核苷酸 Cl、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9 及 ClO，制備各濃度為 0. 01 μ M 的 TE 緩沖液?！捶聪蚬押塑账帷礐l :5，-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3，(序列編號 41)C2 :5，-GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA-3，(序列編號 42)C3 :5，-CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC-3，(序列編號 43)
C4 :5，-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3’(序列編號44)
C5 :5，-GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT-3，(序列編號45)
C6 :5，-TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC-3’(序列編號46)
C7 :5，-ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT-3，(序列編號 47)
C8 :5，-TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG-3’(序列編號48)
C9 :5，-ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG-3，(序列編號49)
ClO5'-CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC-3’(序列編號50)
對所得到的各反應(yīng)液，進(jìn)行以下的處理。
向PCR管中，添加上述制備的反應(yīng)液40 μ L、上述的5’末端FITC標(biāo)記3 核苷酸
溶液10 μ L、上述的反向寡核苷酸溶液10 μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 10 μ L 禾口 lmg/mL BSA 溶液 10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為IOOyL,進(jìn)行混合。之后，將該PCR管在 95°C加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C并在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫 10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返回至室溫，促進(jìn)了 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸與DNA片 斷的結(jié)合體的形成(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法的第二工序)。向固定化有上述生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條 中，添加上述制備的DNA片斷的反應(yīng)液100 μ L，在室溫下放置1小時。之后，通過移液除去 溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過移液除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng) 于本發(fā)明方法的第三工序)。之后，向各孔中以100 μ L的比例，添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005μ g/ΙΟΟμ L 0. 1 % BSA含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，向 各孔添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫下放置約30分鐘，向各孔中以50 μ L的比例添加停止溶液QN H2SO4水溶 液)，停止反應(yīng)。在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度。(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第四工序)將其結(jié)果示于圖10。溶液A、溶液B及溶液C中，與溶液D相比，可見吸光度的增 加。另外，其強(qiáng)度依賴于DNA片斷的濃度而增加。本實驗中可知，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被甲基化了的DNA片斷和固定化的 5’末端生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù)合體中的FITC進(jìn)行定量·檢測，可 以進(jìn)行DNA片斷的檢測·定量。實施例11使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，按照 商品目錄中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物 素標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖 液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液而冷藏保存。
制備合成而得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的0. 5μ g/mLO. 1 % BSA含有磷酸緩 沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液，將其以各 IOOyL 的比例添 加到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條(Perkin Elmer公司制)，在室溫下放置約1小時，將 其固定化至孔中。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20 磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20U54mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖 液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法中使用的固定化甲基化DNA抗體的制用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母株 X2180-1A，直到濁度為OD600 0. 6-1. 0，以10000 Xg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細(xì)胞。使 用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學(xué)方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵母 基因組的制備法，從所制備的酵母細(xì)胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細(xì)胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 0. 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直 至溶液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B (50mM Tris-HCl.pH 7.4、20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育 30分鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進(jìn)行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離 心30分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙 醇，充分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并 進(jìn)行回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCl,pH8. OUmM EDTA)， 添加RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添 加蛋白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)后， 在55°C下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進(jìn)行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8. 0)飽和]/氯仿提取處理?；厥账畬?，向其中添加NaCl并使其為0. 5N，然后對其進(jìn)行乙 醇沉淀處理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用以下的序列編號27及序列編號28所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物(PF3 及冊；3)和反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR，由此從得到的酵母基因組DNA擴(kuò)增作為供試樣品使用的DNA 片斷(S、序列編號四、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示酵母染色體VII的堿基編號 271743-272083相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PF3 5' -AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3‘(序列編號 2了)PR3 :5，-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3，(序列編號 28)<DNA 片斷〉S:5，-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTT GTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTG TGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCA TAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTG GCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 29)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&吐 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(Ampl iTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下20秒鐘接著在58°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷S。關(guān)于DNA片斷S，制備以下的溶液。溶液A =DNA 片斷 S 10ng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 S lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =TE緩沖液(陰性對照液)另外，使用以下的序列編號32及序列編號33所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引 物(PF4及PR4)和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR，由此從所得的酵母基因組DNA擴(kuò)增作為供試樣品使用 的DNA片斷(Τ、序列編號34、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿 基編號384569-384685相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PF4 5' -GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3‘(序列編號 3 PR4 :5，-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3，(序列編號 33)<DNA 片斷〉T:5，-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGG ACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3，(序列編號 34)作為PCR的反應(yīng)液，使用以下的反應(yīng)液，即，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&吐 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、耐熱性 DNA 聚合酶(Ampl iTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下20秒鐘接著在58°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷Τ。關(guān)于DNA片斷Τ，制備以下的溶液。溶液A DNA 片斷 T IOng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 T lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =TE緩沖液(陰性對照液)分別將上述制備的DNA片斷S的溶液A與DNA片斷T的溶液A，DNA片斷S的溶液 B與DNA片斷T的溶液B，DNA片斷S的溶液C與DNA片斷T的溶液C混合，制備以下所示 的DNA片斷混合溶液MA MC各兩份。溶液MA 10ng/20 μ L TE 緩沖液溶液MB lng/20 μ L TE 緩沖液溶液MC =TE緩沖液(陰性對照液)將所得的各溶液20 μ LJssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ IUOx NEBuf fer2 (NEB公司制)5 μ 1和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1混合，向其中添加滅菌超純 水使液量為50 μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第一工序)。合成含有可以與含有序列編號30所示目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸S’互補(bǔ)性結(jié)合的 序列編號31所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F3，制備0. 02 μ M的Tris-HCl 緩沖液(IOmM)溶液?！春心繕?biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸>S’ 5’ -AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCT TGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCT GTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGC ATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGT GGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 30)<5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>F3 :5，-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3，(序列編號 31)另外，合成含有可以與含有序列編號30所示目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸S’的負(fù)鏈 互補(bǔ)性結(jié)合的、序列編號41、序列編號42、序列編號43、序列編號44、序列編號45、序列編號 46、序列編號47、序列編號48、序列編號49及序列編號50所示的堿基序列的反向寡核苷酸 Cl、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9 及 ClO，制備各濃度為 0. 01 μ M 的 TE 緩沖液?！捶聪?寡核苷酸>
Cl 5'-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3 ‘(序列編號 41)
C2 5'-GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA-3，(序列編號42)
C3 5'-CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC-3’(序列編號43)
C4 5'-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3’(序列編號44)
C5 5'-GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT-3，(序列編號45)
C6 5'-TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC-3’(序列編號46)
C7 5'-ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT-3，(序列編號 47)
C8 5'-TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG-3’(序列編號48)
C9 5'-ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG-3，(序列編號49)
ClO 5'1 -CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC-3’(序列編號50)
對所得到的各反應(yīng)液，進(jìn)行以下的處理。
向PCR管中，添加上述制備的反應(yīng)液40 μ L、上述的5’末端FITC標(biāo)記
溶液10 μ L、上述的反向寡核苷酸溶液10 μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 10 μ L 禾口 lmg/mL BSA 溶液 10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為IOOyL,進(jìn)行混合。之后，將該PCR管在 95°C加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C并在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫 10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返回至室溫，促進(jìn)了 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸與DNA片 斷的結(jié)合體的形成(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法的第二工序)。 向固定化有上述生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條 中，添加上述制備的DNA片斷的反應(yīng)液IOOyL,在室溫下放置1小時。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過移液除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng) 于本發(fā)明方法的第三工序)。之后，向各孔中以100 μ L的比例添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005 μ g/100 μ L 0. 1 % BSA 含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，向 各孔添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫下放置約60分鐘，向各孔中以50 μ L的比例添加停止溶液QN H2SO4水溶 液)，停止反應(yīng)。反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度。(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法 的第四工序)將其結(jié)果示于圖11。溶液MA及溶液MB中，與溶液MC相比，可見吸光度的增力口。 另外，其強(qiáng)度依賴于DNA片斷的濃度而增加。本實驗中可知，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被甲基化了的DNA片斷和固定化的 5’末端生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù)合體中的FITC進(jìn)行定量·檢測，可 以進(jìn)行DNA片斷的檢測·定量。實施例12使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，按照 商品目錄中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物 素標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖 液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液而冷藏保存。制備合成而得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的0. 5μ g/mL0. 1 % BSA含有磷酸緩 沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液，將其以各 IOOyL 的比例添 加到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條(Perkin Elmer公司制)，在室溫下放置約1小時，將 其固定化至孔中。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20 磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20U54mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖 液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法中使用的固定化甲基化DNA抗體的制用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母酵 母株X2180-1A，直到濁度為OD600 0. 6-1. 0，以IOOOOXg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細(xì) 胞。使用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學(xué)方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī) 的酵母基因組的制備法，從所制備的酵母細(xì)胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細(xì)胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7.4)中懸浮，添加 0. 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直 至溶液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B (50mM Tris-HCl.pH 7.4、20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育 30分鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進(jìn)行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離 心30分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙醇，充分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并 進(jìn)行回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCl,pH8. OUmM EDTA)， 添加RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添 加蛋白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)后， 在55°C下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進(jìn)行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8. 0)飽和]/氯仿提取處理?；厥账畬樱蚱渲刑砑覰aCl并使其為0. 5N，然后對其進(jìn)行乙 醇沉淀處理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用以下的序列編號27及序列編號28所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物(PF3 及冊；3)和反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR，由此從所得的酵母基因組DNA擴(kuò)增作為供試樣品使用的DNA 片斷(S、序列編號四、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示酵母染色體VII的堿基編號 271743-272083相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PF3 5' -AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3‘(序列編號 2了)PR3 :5，-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3，(序列編號 28)<DNA 片斷〉S:5，-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTT GTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTG TGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCA TAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTG GCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 29)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&吐 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(Ampl iTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下20秒鐘接著在58°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷S。關(guān)于DNA片斷S，制備以下的溶液。溶液A =DNA 片斷 S 10ng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 S lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =DNA片斷S TE緩沖液(陰性對照液)另外，使用以下的序列編號32及序列編號33所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引 物(PF4及PR4)和反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR，由此從所得的酵母基因組DNA擴(kuò)增作為供試樣品使 用的DNA片斷(Τ、序列編號34、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示的酵母染色體VII的 堿基編號384569-384685相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PF4 :5，-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3，(序列編號 32)PR4 :5，-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3，(序列編號 33)
<DNA 片斷〉T:5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGG ACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3，(序列編號 34)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&吐 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(Ampl iTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下20秒鐘接著在58°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。 進(jìn)行PCR后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷Τ。關(guān)于DNA片斷Τ，制備以下的溶液。溶液A DNA 片斷 T IOng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 T lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =TE緩沖液(陰性對照液)分別將上述制備的DNA片斷S的溶液A與DNA片斷T的溶液A，DNA片斷S的溶液 B與DNA片斷T的溶液B，DNA片斷S的溶液C與DNA片斷T的溶液C混合，制備以下所示 的DNA片斷混合溶液MA MC各兩份。溶液MA 10ng/20 μ L TE 緩沖液溶液MB lng/20 μ L TE 緩沖液溶液MC =TE緩沖液(陰性對照液)將所得的各溶液20 μ LJssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ IUOx NEBuf fer2 (NEB 公司制)5 μ 1、3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1混合，向其中添加滅菌超純水 使液量為50 μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法 的第一工序)。合成含有可以與含有序列編號35所示的目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸T’互補(bǔ)性結(jié)合 的序列編號36所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F4，制備0. 02 μ M的Tris-HCl 緩沖液(IOmM)溶液?！春心繕?biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸〉Τ’ 5’ -GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCG GACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3，(序列編號 35)<5，末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>F4 :5，-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3，(序列編號 36)另外，合成含有可以與含有序列編號35所示的目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸Τ’的負(fù) 鏈互補(bǔ)性結(jié)合的、序列編號51、序列編號52、序列編號53、及序列編號M所示的堿基序列的 反向寡核苷酸Cll、C12、C13及C14，制備各濃度為0. 01 μ M的TE緩沖液?！捶聪蚬押塑账帷礐ll :5，-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3，(序列編號 51)C12 :5，-AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT-3，(序列編號 52)
C13 :5，-ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT-3，(序列編號 53)C14 :5，-CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3，(序列編號 54)對所得到的各反應(yīng)液，進(jìn)行以下的處理。向PCR管中，添加上述制備的反應(yīng)液40 μ L、上述的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸 溶液10 μ L、上述的反向寡核苷酸溶液10 μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 10 μ L 禾口 lmg/mL BSA 溶液 10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為IOOyL,進(jìn)行混合。之后，將該PCR管在 95°C加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C并在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫 10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返回至室溫，促進(jìn)了 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸與DNA片 斷的結(jié)合體的形成(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法的第二工序)。向固定化有上述生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條 中，添加上述制備的DNA片斷的反應(yīng)液IOOyL,在室溫下放置1小時。之后，通過移液除去 溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過移液除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng) 于本發(fā)明方法的第三工序)。之后，在各孔中以100 μ L的比例添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005 μ g/100 μ L 0. 1 % BSA 含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，向各 孔中添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫下放置約60分鐘，向各孔中以50 μ L的比例，添加停止溶液QN H2SO4水溶 液)，停止反應(yīng)。反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度。(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法 的第四工序)將結(jié)果示于圖12。溶液MA及溶液MB中，與溶液MC相比，可見吸光度的增加。另 外，其強(qiáng)度依賴于DNA片斷的濃度而增加。本實驗中可知，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被甲基化了的DNA片斷和固定化的 5’末端生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù)合體中的FITC進(jìn)行定量·檢測，可 以進(jìn)行DNA片斷的檢測·定量。實施例13使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，按照 商品目錄中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物 素標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖 液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液而冷藏保存。制備合成而得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的0. 5μ g/mL0. 1 % BSA含有磷酸緩 沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液，將其以各 IOOyL 的比例添 加到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條(Perkin Elmer公司制)，在室溫下放置約1小時，將 其固定化至孔中。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20 磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20U54mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法中使用的固定化甲基化DNA抗體的制用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母株 X2180-1A，直到濁度為OD600 0. 6-1. 0，以10000 Xg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細(xì)胞。使 用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學(xué)方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵母 基因組的制備法，從所制備的酵母細(xì)胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細(xì)胞在緩沖液A(1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7.4)中懸浮，添加 0. 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直 至溶液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B (50mM Tris-HCl.pH 7.4、20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育 30分鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進(jìn)行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離 心30分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙 醇，充分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并 進(jìn)行回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCl,pH8. OUmM EDTA)， 添加RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添 加蛋白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)后， 在55°C下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進(jìn)行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8. 0)飽和]/氯仿提取處理?；厥账畬樱蚱渲刑砑覰aCl并使其為0. 5N，然后對其進(jìn)行乙 醇沉淀處理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用以下的序列編號27及序列編號觀所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物(PF3 及冊；3)和反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR，由此從所得的酵母基因組DNA擴(kuò)增作為供試樣品使用的DNA 片斷(S、序列編號四、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示酵母染色體VII的堿基編號 271743-272083相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PF3 5' -AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3‘(序列編號 2了)PR3 :5，-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3，(序列編號 28)<DNA 片斷〉S:5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTT GTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTG TGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCA TAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTG GCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 29)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5μΜ 的上述引物溶液各 3μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliiTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下20秒鐘接著在58°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCRKit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷S。關(guān)于DNA片斷S，制備以下的溶液。溶液A DNA 片斷 S IOng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 S lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =TE緩沖液(陰性對照液)另外，使用能夠以下的序列編號32及序列編號33所示的為PCR而設(shè)計的寡核苷 酸引物(PF4及PR4)和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR，由此從所得的酵母基因組DNA擴(kuò)增作為供試樣品 使用的DNA片斷(Τ、序列編號34、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示的酵母染色體VII 的堿基編號384569-384685相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)。<為PCR而設(shè)計的寡核苷酸引物>PF4 :5，-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3，(序列編號 32)PR4 :5，-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3，(序列編號 33)<DNA 片斷〉T:5，-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGG ACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3，(序列編號 34)作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，S卩，混合成為模板的基因組DNA IOng, 5口] 的上述引物溶液各3口1、6&吐 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1 和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliiTaqGold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水使液量為50 μ 1而得的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在95°C保溫 10分鐘后，再以將95°C下20秒鐘接著在58°C下30秒鐘進(jìn)而在72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進(jìn)行40個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR后，利用2 %瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)精制DNA片斷Τ。關(guān)于DNA片斷Τ，制備以下的溶液。溶液A DNA 片斷 T IOng/10 μ L TE 緩沖液溶液B =DNA 片斷 T lng/10 μ L TE 緩沖液溶液C =TE緩沖液(陰性對照液)分別將上述制備的DNA片斷S的溶液A與DNA片斷T的溶液A，DNA片斷S的溶液 B與DNA片斷T的溶液B，DNA片斷S的溶液C與DNA片斷T的溶液C分別混合，制備以下 所示的DNA片斷混合溶液MA MC各兩份。溶液MA 10ng/20 μ L TE 緩沖液
溶液 MB lng/20 μ L TE 緩沖液溶液MC =TE緩沖液(陰性對照液)將所得的各溶液20 μ LJssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ IUOx NEBuf fer2 (NEB 公司制)5 μ 1和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1混合，向其中添加滅菌超純 水使液量為50 μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第一工序)。合成含有可以與含有序列編號30所示目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸S’互補(bǔ)性結(jié)合的 序列編號31所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F3，另外，合成含有可以與含有序列編號35所示目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸T’互補(bǔ)性結(jié)合的序列編號36所示的堿基序列 的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F4，制備各濃度為0. 02 μ M的Tris-HCl緩沖液(IOmM)溶液?！春心繕?biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸>S’ 5’ -AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCT TGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCT GTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGC ATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGT GGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 30)Τ’ 5’ -GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCG GACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3，(序列編號 35)<5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>F3 :5，-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3，(序列編號 31)F4 :5，-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3，(序列編號 36)另外，合成含有可以與含有序列編號30所示目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸S’的負(fù)鏈 互補(bǔ)性結(jié)合的、序列編號41、序列編號42、序列編號43、序列編號44、序列編號45、序列編號 46、序列編號47、序列編號48、序列編號49及序列編號50所示的堿基序列的反向寡核苷酸 Cl、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9及C10,另外，合成含有可以與含有序列編號35所示目標(biāo) DNA區(qū)域的寡核苷酸Τ’的負(fù)鏈互補(bǔ)性結(jié)合的、序列編號51、序列編號52、序列編號53及序 列編號討所示的堿基序列的反向寡核苷酸C11、C12、C13及C14，制備各濃度為0. 01 μ M的 TE緩沖液?！春心繕?biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸>S’ 5’ -AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCT TGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCT GTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGC ATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGT GGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 30)Τ’ 5’ -GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCG GACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3，(序列編號 35)〈反向寡核苷酸>
Cl :5，-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3，(序列編號 41)
C2 :5，-GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA-3，(序列編號42)
C3 :5，-CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC-3’(序列編號43)
C4 :5，-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3，(序列編號44)
C5 :5，-GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT-3，(序列編號45)
C6 :5，-TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC-3’(序列編號46)
C7 :5，-ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT-3，(序列編號 47)
C8 :5，-TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG-3’(序列編號48)
C9 :5，-ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG-3，(序列編號49)
ClO5’ -CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC-3’(序列編號50)
Cll :5，-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3，(序列編號 51)C12 :5，-AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT-3，(序列編號 52)C13 :5，-ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT-3，(序列編號 53)C14 :5，-CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3，(序列編號 54)對所得到的各反應(yīng)液，進(jìn)行以下的處理。向PCR管中，添加上述制備的反應(yīng)液40 μ L、上述的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸 溶液10 μ L、上述的反向寡核苷酸溶液10 μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 10 μ L 禾口 lmg/mL BSA 溶液 10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為IOOyL,進(jìn)行混合。之后，將該PCR管在 95°C加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C并在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫 10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返回至室溫，促進(jìn)了 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸與DNA片 斷的結(jié)合體的形成(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法的第二工序)。向固定化有上述生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條 中，添加上述制備的DNA片斷的反應(yīng)液IOOyL,在室溫下放置1小時。之后，通過移液除去 溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過移液除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng) 于本發(fā)明方法的第三工序)。之后，向各孔中以100 μ L的比例添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005μ g/ΙΟΟμ L 0. 1 % BSA含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，將 各孔添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫下放置約60分鐘，向各孔中以50 μ L的比例添加停止溶液QN H2SO4水溶 液)，停止反應(yīng)。在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度。(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第四工序)將其結(jié)果示于圖13。溶液MA及溶液MB中，與溶液MC相比，可見吸光度的增力口。 另外，其強(qiáng)度依賴于DNA片斷的濃度而增加。本實驗中可知，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被甲基化了的DNA片斷和固定化的 5’末端生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù)合體中的FITC進(jìn)行定量·檢測，可 以進(jìn)行DNA片斷的檢測·定量。實施例14使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，按照 商品目錄中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物 素標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖 液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液而冷藏保存。制備合成而得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的0. 5μ g/mL0. 1 % BSA含有磷酸緩 沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液，將其以各 IOOyL 的比例添 加到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條(Perkin Elmer公司制)，在室溫下放置約1小時，將其固定化至孔中。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20 磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20U54mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖 液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法中使用的固定化甲基化DNA抗體的制對購自克隆技術(shù)(Clontech)公司的人血液來源基因組DNA，制備以下的溶液各兩 份。溶液A 人血液來源基因組DNA 100ng/5 μ L TE緩沖液溶液B 人血液來源基因組DNA 10ng/5 μ L TE緩沖液溶液C 人血液來源基因組DNA lng/5 μ L TE緩沖液溶液D =TE緩沖液(陰性對照液)將上述制備的各溶液5yL、限制性酶X sp I IOUJfX spl最適的IOx緩沖液 (200mM Tris-HCl pH 8. 5、IOOmM MgCl2、IOmM 二硫蘇糖醇、IOOOmM KCl) 2 μ 1 混合，向其中 添加滅菌超純水使液量為20 μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育1小時。將所得的各反應(yīng)液20 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0· 5 μ 1、10χ NEBuffer2 (NEB公司制)5 μ 1和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1混合，向其中 添加滅菌超純水使液量為50μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘(以上，相 當(dāng)于本發(fā)明方法的第一工序)。合成含有可以與含有在作為人轉(zhuǎn)座子周知的LINEl區(qū)域設(shè)計的序列編號37所示 的目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸Z (與基因庫檢索號No. M80340等所示的堿基編號115-386相 當(dāng)?shù)膮^(qū)域)互補(bǔ)性結(jié)合的序列編號38所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F5，制 備 0. 02 μ M 的 iTris-HCl 緩沖液(IOmM)溶液?！春心繕?biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸〉Z:5，-TAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGG GCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCTGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGTCG CACCTGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTTAAGAAACGGCGCACCACGAGACT ATATCCCACACCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC-3，(序列編號 37)<5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>F5 :5，-ATAGTCTCGTGGTGCGCCGT-3，(序列編號 38)另外，合成含有可以與含有序列編號39所示目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸W的負(fù)鏈互 補(bǔ)性結(jié)合的序列編號陽、序列編號56、序列編號57、序列編號58及序列編號59所示的堿基 序列的反向寡核苷酸C15、C16、C17、C18及C19，制備各濃度為0.01 μ M的TE緩沖液。〈含有目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸〉Z :5，-TAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGG GCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCTGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGTCG CACCTGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTTAAGAAACGGCGCACCACGAGACT ATATCCCACACCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC-3，(序列編號 37)〈反向寡核苷酸〉C15 :5，-CAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGA-3，(序列編號 55)C16 :5，-GGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCA-3，(序列編號 56)
C17 :5，-GGTGACGGTCGCACCTGGAAAATCGGGTCA-3，(序列編號 57)C18 :5，-ACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTT-3，(序列編號 58)C19 :5，-TCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGC-3，(序列編號 59)對所得到的各反應(yīng)液，進(jìn)行以下的處理。向PCR管中，添加上述制備的反應(yīng)液40 μ L、上述的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸 溶液10 μ L、上述的反向寡核苷酸溶液10 μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 10 μ L 禾口 lmg/mL BSA 溶液 10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為IOOyL,進(jìn)行混合。之后，將該PCR管在 95°C加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C并在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫 10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返回至室溫，促進(jìn)了 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸與DNA片 斷的結(jié)合體的形成(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法的第二工序)。向固定化有上述生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條 中，添加上述制備的DNA片斷的反應(yīng)液IOOyL,在室溫下放置1小時。之后，通過移液除去 溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過移液除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng) 于本發(fā)明方法的第三工序)。之后，向各孔中以100 μ L的比例，添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005μ g/ΙΟΟμ L 0. 1 % BSA含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，向 各孔添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫下放置約9分鐘，向各孔中以50 μ L的比例，添加停止溶液ON H2SO4水溶 液)，停止反應(yīng)。在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度。(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第四工序)將其結(jié)果示于圖14。溶液A、溶液B及溶液C中，與溶液D相比，可見吸光度的增 加。另外，其強(qiáng)度依賴基因組DNA的濃度而增加。本實驗中可知，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被甲基化了的DNA片斷和固定化的 5’末端生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù)合體中的FITC進(jìn)行定量·檢測，可 以進(jìn)行DNA片斷的檢測·定量，可以進(jìn)行基因組DNA的檢測·定量。實施例15使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，按照 商品目錄中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物 素標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖 液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液而冷藏保存。制備合成而得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的0. 5μ g/mL0. 1 % BSA含有磷酸緩 沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液，將其以各 IOOyL 的比例添 加到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條(Perkin Elmer公司制)，在室溫下放置約1小時，將 其固定化至孔中。之后，通過移液除去溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20U54mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖 液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法中使用的固定化甲基化DNA抗體的制對購自克隆技術(shù)(Clontech)公司的人血液來源基因組DNA，制備以下的溶液各兩 份。溶液A 人血液來源基因組DNA 100ng/5 μ L TE緩沖液溶液B 人血液來源基因組DNA 10ng/5 μ L TE緩沖液溶液C 人血液來源基因組DNA lng/5 μ L TE緩沖液溶液D =TE緩沖液(陰性對照液)將上述制備的各溶液5 μ L、限制性酶MspI 4U JfMspI最適的IOx緩沖液(IOOmM Tris-HCl ρΗ 7. 5、IOOmM MgCl2、IOmM 二硫蘇糖醇、500mM NaCl) 2 μ 1 混合，向其中添加滅菌 超純水使液量為20 μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育1小時。將所得的各反應(yīng)液20 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0· 5 μ 1、10χ NEBuffer2 (NEB公司制)5 μ 1和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加 滅菌超純水使液量為50 μ 1，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘(以上，相當(dāng)于 本發(fā)明方法的第一工序)。合成含有可以與含有在作為人轉(zhuǎn)座子周知的Alu區(qū)域設(shè)計的序列編號39所示的 目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸W(與基因庫檢索號No. AF458110等所示的堿基編號178-262相 當(dāng)?shù)膮^(qū)域)互補(bǔ)性結(jié)合的序列編號40所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F6，制 備 0. 02 μ M 的 iTris-HCl 緩沖液(IOmM)溶液?！春心繕?biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸>W5，-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAG GTCAGGAGATCGAGACCATCC-3‘(序列編號 3Θ)<5，末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>F6 :5，-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3，(序列編號 40)另外，合成含有可以與含有序列編號39所示目標(biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸W的負(fù)鏈互 補(bǔ)性結(jié)合的序列編號60及序列編號61所示的堿基序列的反向寡核苷酸C20及C21，制備各 濃度為0. 01 μ M的TE緩沖液?！春心繕?biāo)DNA區(qū)域的寡核苷酸〉W-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGT CAGGAGATCGAGACCATCC-3‘(序列編號 3Θ)〈反向寡核苷酸〉C20 :5，-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCA-3，(序列編號 60)C21 :5，-TTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAG-3，(序列編號 61)對所得到的各反應(yīng)液，進(jìn)行以下的處理。向PCR管中，添加上述制備的反應(yīng)液40 μ L、上述的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸 溶液10 μ L、上述的反向寡核苷酸溶液10 μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽ρΗ 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 10 μ L 禾口 lmg/mL BSA 溶液 10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為IOOyL,進(jìn)行混合。之后，將該PCR管在95°C加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C并在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫 10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后返回至室溫，促進(jìn)了 5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸與DNA片 斷的結(jié)合體的形成(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方法的第二工序)。向固定化有上述生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條 中，添加上述制備的DNA片斷的反應(yīng)液IOOyL,在室溫下放置1小時。之后，通過移液除去 溶液，添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過移液除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次(以上，相當(dāng) 于本發(fā)明方法的第三工序)。之后，向各孔中以100 μ L的比例，添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005μ g/ΙΟΟμ L 0. 1 % BSA含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，向各 孔中添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫下放置約8分鐘，向各孔中以50 μ L的比例，添加停止溶液QN H2SO4水溶 液)，停止反應(yīng)。在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度。(以上，相當(dāng)于本發(fā)明方 法的第四工序)將結(jié)果示于圖15。溶液A、溶液B及溶液C中，與溶液D相比，可見吸光度的增力口。 另外，其強(qiáng)度依賴基因組DNA的濃度而增加。本實驗中可知，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被甲基化了的DNA片斷和固定化的 5’末端生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù)合體中的FITC進(jìn)行定量·檢測，可 以進(jìn)行DNA片斷的檢測·定量，可以進(jìn)行基因組DNA的檢測·定量。實施例16作為血清樣品，如下所示分別制備人血液來源基因組DNA(Human Genomic DNA, #636401、克隆技術(shù)(Clontech)公司)的TE緩沖液和從大鼠(Wistar Hannover)收集的血 清的混合液各4份。血清樣品A 人血液來源基因組DNA 10ng/10 μ L TE緩沖溶液+大鼠血清10 μ L血清樣品B 人血液來源基因組DNA lng/10 μ L TE緩沖溶液+大鼠血清10 μ L血清樣品C 人血液來源基因組DNA 0. lng/10 μ L TE緩沖溶液+大鼠血清10 μ L血清樣品D 人血液來源基因組DNA 0ng/10yL TE緩沖溶液+大鼠血清10 μ L (陰 性對照液)關(guān)于上述制備的血清樣品A D，分別進(jìn)行以下的處理1或處理2各2份。處理1 混合血清樣品20 μ L 和緩沖液(500mM Tris-HCl (pH 7. 5)，IOOmM MgCl2, IOmM DTT, IOOOmM NaCl) 4 μ L，進(jìn)而向該混合物中添加滅菌超純水，使其液量40 μ L，進(jìn)行了混合。 隨后，將該PCR管在95°C下保溫10分鐘，在4°C下保溫10分鐘之后，恢復(fù)至室溫。以9100Xg 離心10分鐘，然后回收上清。處理2 混合血清樣品20 μ L 和緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽(pH 7. 9)，IOOmM Mg(OAc)2,5mM DTT, 660mM KOAc) 4 μ L，進(jìn)而向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為40 μ L，進(jìn)行了混 合。隨后，將該PCR管在95°C下保溫10分鐘，在4°C下保溫10分鐘之后，恢復(fù)至室溫。以 9100 X g離心10分鐘，然后回收上清?；旌贤ㄟ^上述的處理1或處理2制備的各溶液20yL、限制酶MspI 2U、最適 于 MspI 的 IOx 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 7. 5、100mMMgCl2、IOmM 二硫蘇糖醇、500mM NaCl) 5 μ L，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ L而制備了反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C 下孵育1小時?；旌贤ㄟ^上述的酶處理得到的溶液30 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ L、 10xNEBuffer2(NEB公司制)5μ L、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ L，向其中 添加滅菌超純水，使液量為50 μ L而制備了反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C下孵育30分鐘。作為用于獲得含有在作為人轉(zhuǎn)座子而周知的Alu區(qū)域設(shè)計的、序列編號39所示的 堿基序列的目標(biāo)DNA區(qū)域(W、序列編號39、與基因庫檢索號No. AF458110所示的堿基編號 178-262相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)的特定寡核苷酸，合成含有與目標(biāo)DNA區(qū)域W的正鏈互補(bǔ)性結(jié)合的、 序列編號40所示的堿基序列的5，末端FITC標(biāo)記寡核苷酸Fl，制備了 0. 02 μ M的Tris-HCl 緩沖液(IOmM)溶液?！茨繕?biāo)DNA區(qū)域〉W5，-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAG GTCAGGAGATCGAGACCATCC-3‘(序列編號 3Θ)<5，末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>Fl :5，-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3，(序列編號 40)添加上述得到的反應(yīng)液50 μ L、5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸溶液10 μ L、緩沖液 (330mM Tris-醋酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L和lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為 IOOyL,進(jìn)行混合。之后，為了使目標(biāo)DNA區(qū)域與5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸的雙鏈形成， 將該PCR管在95°C保溫10分鐘，迅速冷卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至 50°C保溫10分鐘，再于37°C保溫10分鐘，之后返回至室溫。使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，根據(jù) 規(guī)程中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物素 標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖液 (ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7.4)溶液而冷藏保存。向經(jīng)上述的熱處理而得的反應(yīng)液100 μ L中，添加將上述的生物素標(biāo)記甲基胞嘧 啶抗體溶液稀釋5倍(0. 05 μ g/ μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖液(ImM KH2P04,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7.4)溶液)后的溶液1 μ L，在室溫下放置1小時，形成含有目標(biāo)DNA 區(qū)域、5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸和生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的檢測復(fù)合體。將上述所得的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條( ! 印taWell、 #11645692001、羅氏公司)，在室溫下放置約60分鐘，通過生物素-抗生物蛋白鏈菌素結(jié)合， 在8孔條固定化含有目標(biāo)DNA區(qū)域、5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸和生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗 體的檢測復(fù)合體。之后，通過傾析去除溶液，用清洗緩沖液
以 200 μ L 清洗各孔 3 次。
之后，向各孔中以100 μ L的比例，添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005μ g/ΙΟΟμ L 0. 1 % BSA含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7.4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，向 各孔添加200 μ L的清洗緩沖液[含0. 05% Tween20磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7.4)]后，通過傾析除去該緩沖液。將該操作再重復(fù)2次。向各孔中以100 μ L的比例，添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫下放置約30分鐘，向各孔中以50 μ L的比例添加停止溶液QN H2SO4水溶 液)，停止反應(yīng)。在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度，對所得的測定值算出雙份 的平均值。將其結(jié)果示于圖16和圖17。處理1中，就人血液來源基因組DNA的溶液A(IOng)、 溶液B(Ing)和溶液C(0. Ing)而言，與溶液D(Ong 對照溶液)相比，吸光度依賴于濃度而 增加(圖16)。另一方面，處理2中，就人血液來源基因組DNA的溶液A(IOng)而言，與溶液 D(0ng:對照溶液)相比，吸光度增加，但溶液B(Ing)和溶液C(0. Ing)中，未見吸光度的增 加(圖17)。本實驗中顯示了，形成、選擇了固定化的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體與被甲基化 了的DNA片斷與5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能對復(fù)合體中的FITC進(jìn)行 定量 檢測，可以靈敏度良好地檢測、定量血清中人基因組DNA。另外，與處理2相比，處理 1中血清中人基因組DNA被靈敏度良好地檢測出。實施例17作為血清樣品，如下所示制備人血液來源基因組DNA (Human Genomic DNA、 #636401、克隆技術(shù)(Clontech)公司)的TE緩沖液和從KOHJIN生物公司購得的人血清(不 同個體的人血清)的混合液各雙份。血清樣品A 人血液來源基因組DNA 4ng/10 μ L TE緩沖溶液+人血清40 μ L血清樣品B 人血液來源基因組DNA 2ng/10 μ L TE緩沖溶液+人血清40 μ L血清樣品C 人血液來源基因組DNA lng/10 μ L TE緩沖溶液+人血清40 μ L血清樣品D 人血液來源基因組DNA 0ng/10yL TE緩沖溶液+人血清40 μ L (陰 性對照液)關(guān)于上述制備的血清樣品A D，進(jìn)行如下的處理各雙份。向 PCR管中添加血清樣品 50 μ L、緩沖液(500mM Tris-HCl (pH 7. 5), IOOmM MgCl2, IOmM DTT, IOOOmM NaCl) 20 μ L，再向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為100 μ L，進(jìn)行混 合。之后，將該PCR管在95°C保溫10分鐘，冷卻至4°C后，返回至室溫。接著以9100Xg離 心10分鐘后，回收上清20 μ L。將經(jīng)上述的處理制備的溶液20 μ L、限制性酶MspI 2U、與MspI最適的IOx緩沖液 (IOOmM Tris-HCl pH 7. 5、100mM MgCl2、IOmM 二硫蘇糖醇、500mM NaCl) 5 μ L 混合，向其中 添加滅菌超純水使液量為50 μ L，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育1小時。將經(jīng)上述的酶處理而得的溶液30 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ L、IOx NEBuffer2 (NEB公司制)5 μ L和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ L混合，向其中 加入滅菌超純水使液量為50 μ L，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘。合成含有可以與含有在作為人轉(zhuǎn)座子周知的Alu區(qū)域設(shè)計的目標(biāo)DNA區(qū)域(W、序列編號39、與基因庫檢索號No. AF458110所示的堿基編號178-262相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)互補(bǔ) 性結(jié)合的序列編號40所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F1，制備0. 02 μ M的 Tris-HCl緩沖液(IOmM)溶液?！茨繕?biāo)DNA區(qū)域〉W5，-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAG GTCAGGAGATCGAGACCATCC-3‘(序列編號 3Θ)<5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>F6 :5，-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3，(序列編號 40)添加上述所得的反應(yīng)液50 μ L、5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸溶液10 μ L、緩沖液 (330mM Tris-醋酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液IOyL和lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向該混合物中添加滅菌超純水使液量為 100 μ L，進(jìn)行混合。之后，為了形成目標(biāo)DNA區(qū)域與5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸的雙鏈，將該 PCR管在95°C保溫10分鐘，迅速冷卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C 保溫10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后，返回至室溫。使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，根據(jù) 規(guī)程中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物素 標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖液 (ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7.4)溶液而冷藏保存。向經(jīng)上述的熱處理所得的反應(yīng)液100 μ L中添加將上述的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶 抗體溶液稀釋 5 倍(0. 05 μ g/ μ L 0. 1%BSA 含有磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl pH 7.4)溶液)后的溶液1 μ L，在室溫下放置1小時，使含有目標(biāo)DNA區(qū)域、5， 末端FITC標(biāo)記寡核苷酸和生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的檢測復(fù)合體形成。將上述所得的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條( ! 印taWell、 #11645692001、羅氏公司)，在室溫下放置1小時，通過生物素-抗生物蛋白鏈菌素結(jié)合，在 8孔條固定化含有目標(biāo)DNA區(qū)域、5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸和生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體 的檢測復(fù)合體。之后，通過移液去除溶液，將各孔以清洗緩沖液
200 μ L 清洗 3 次。之后，向各孔中以100 μ L的比例，添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005μ g/ΙΟΟμ L 0. 1 % BSA含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7· 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，通 過移液去除溶液，將各孔以清洗緩沖液
200 μ L 清洗 3 次。向各孔中以100 μ L的比例，添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。在室溫下放置20分鐘，向各孔中以50 μ L的比例添加停止溶液QNH2SO4水溶液)， 停止反應(yīng)。在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度。將其結(jié)果示于圖18。人血液來源基因組DNA的溶液M4ng)、溶液B (2ng)和溶液 C(Ing)中，與溶液D (Ong 對照溶液)相比較，吸光度依賴于濃度而增加。本實驗中可知，使用本次發(fā)明的方法而提取的DNA樣品，形成含有目標(biāo)DNA區(qū)域、 5 ’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸和生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的檢測復(fù)合體，借助生物素-抗生物蛋白鏈菌素結(jié)合進(jìn)行固定化而進(jìn)行選擇，利用其功能檢測復(fù)合體中的FITC，從而可以進(jìn) 行人血清中人基因組DNA的檢測·定量。 實施例18
作為血清樣品，使用以下所示的人血清。 從KOHJIN生物公司購得的人血清(不同個體的人血清) Lot No. N51438(健康者) N51439(健康者) N51441(健康者)
從ProMedDx公司購得的人血清(不同個體的人血清) Lot No.
11171沈8(健康者、56歲、男性) 11171四2(健康者、62歲、男性) 11171四7(健康者、67歲、男性) 11202510(健康者、67歲、女性) 11202522(健康者、64歲、女性) 11202527(健康者、52歲、女性) 11202615(健康者、75歲、女性) 11202618(健康者、78歲、女性) 10958886(健康者、56歲、男性) 10958979(健康者、39歲、男性) 10958980(健康者、45歲、男性) 1096(^68(健康者、37歲、男性) 10960272(健康者、50歲、男性) 10960276(健康者、30歲、男性) 1096(^85(健康者、39歲、男性) 11003457(健康者、38歲、男性) 11003479(健康者、51歲、男性) 11003480(健康者、48歲、男性) 113M997(健康者、59歲、男性) 11325001 (健康者、61歲、男性) 10325022(健康者、61歲、男性) 10870623(乳腺癌患者、33歲、女性) 10擬9521 (乳腺癌患者、55歲、女性) 10989644(乳腺癌患者、45歲、女性) 11209430(乳腺癌患者、80歲、女性) 10擬9514(乳腺癌患者、57歲、女性) 10843055(乳腺癌患者、59歲、女性) 10984680(乳腺癌患者、64歲、女性)
10840414肺癌患者54歲、女性)
10929506肺癌患者、55歲、男性)
11091955肺癌患者、76歲、女性)
11103346肺癌患者、66歲、女性)
11142322肺癌患者、62歲、女性)
11152564肺癌患者、67歲、男性)
11152571肺癌患者、67歲、男性)
11153198肺癌患者、69歲、女性)
11209435肺癌患者、61歲、男性)
11230621肺癌患者、71歲、女性)
11153192肺癌患者、59歲、男性)
10715942肺癌患者、64歲、男性)
10840422肺癌患者、78歲、女性)
10935547前列腺癌患者、83歲、男性)
11000243前列腺癌患者、78歲、男性)
11071226前列腺癌患者、84歲、男性)關(guān)于上述的血清樣品，進(jìn)行以下的處理各雙份。處理1 向 PCR管中添加血清樣品 40 μ L、緩沖液(500mM Tris-HCl (pH 7. 5)，IOOmM MgCl2, IOmM DTT, IOOOmM NaCl) 20 μ L，再向該混合物中添加滅菌超純水使液量為100 μ L，進(jìn)行混 合。之后，將該PCR管在95°C保溫10分鐘，冷卻到4°C后，返回至室溫。接著，以9100 Xg 離心10分鐘后回收上清20 μ L0將經(jīng)上述的處理制備的溶液20 μ L、限制性酶MspI2U、與MspI最適的IOx緩沖液 (IOOmM Tris-HCl pH 7. 5、100mM MgCl2、IOmM 二硫蘇糖醇、500mM NaCl) 5 μ L 混合，向其中 添加滅菌超純水使液量為50 μ L，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育1小時。將經(jīng)上述的酶處理而得的溶液30 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ L、IOx NEBuffer2 (NEB公司制)5 μ L、3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0· 5 μ L混合，向其中添 加滅菌超純水使液量為50 μ L，制備反應(yīng)液。將該反應(yīng)液在37°C孵育30分鐘。合成含有可以與含有在作為人轉(zhuǎn)座子周知的Alu區(qū)域設(shè)計的目標(biāo)DNA區(qū)域(W、 序列編號39、與基因庫檢索號No. AF458110所示的堿基編號178-262相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)互補(bǔ) 性結(jié)合的序列編號40所示的堿基序列的5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸F6，制備0. 02 μ L的 Tris-HCl緩沖液(IOmM)溶液?！茨繕?biāo)DNA區(qū)域〉W5，-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAG GTCAGGAGATCGAGACCATCC-3‘(序列編號 3Θ)<5，末端FITC標(biāo)記寡核苷酸>F6 :5，-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3，(序列編號 40)添加上述所得的反應(yīng)液50 μ L、5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸溶液10 μ L、緩沖液 (330mM Tris-醋酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmMMgCl2溶液10 μ L和lmg/mL BSA溶液10 μ L，在向該混合物中添加滅菌超純水使液量為 IOOyL,進(jìn)行混合。之后，為了形成目標(biāo)DNA區(qū)域與5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸的雙鏈，在 95°C保溫10分鐘，在迅速冷卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫 10分鐘，再于37°C保溫10分鐘后，返回至室溫。使用市售生物素化試劑盒(Biotin Labeling Kit_NH2、同仁化學(xué)研究所制)，根據(jù) 規(guī)程中記載的方法，將市售的甲基胞嘧啶抗體(Aviva Systems Biology公司制)生物素 標(biāo)記。使所得的生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體成為0. 25μ g/μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖液 (ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7.4)溶液而冷藏保存。向經(jīng)上述的熱處理而得的反應(yīng)液100 μ L中，添加將上述的生物素標(biāo)記甲基胞嘧 啶抗體溶液稀釋5倍(0. 05 μ g/ μ L 0. 1% BSA含有磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7. 4)溶液)后的溶液1 μ L，在室溫下放置1小時，使含有目標(biāo)DNA區(qū) 域與5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸和生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體的檢測復(fù)合體形成。將上述而得的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到被抗生蛋白鏈菌素覆蓋的8孔條( ! 印taWell、 #11645692001、羅氏公司)，在室溫下放置1小時，通過生物素-抗生物蛋白鏈菌素結(jié)合，在 8孔條固定化含有目標(biāo)DNA區(qū)域、5’末端FITC標(biāo)記寡核苷酸和生物素標(biāo)記甲基胞嘧啶抗體 的檢測復(fù)合體。之后，通過移液去除溶液，將各孔以清洗緩沖液
200 μ L 清洗 3 次。之后，向各孔中以100 μ L的比例添加HRP標(biāo)記FITC抗體溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 005 μ g/100 μ L 0. 1 % BSA 含有憐酸緩7中液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7· 4)溶液]后，在室溫放置1小時。放置后，通 過移液去除溶液，將各孔以清洗緩沖液
200 μ L 清洗 3 次。向各孔中以100 μ L的比例，添加、混合基質(zhì)(R&D公司制、#DY999)，開始反應(yīng)。再室溫下放置25分鐘，向各孔中以50 μ L的比例添加停止溶液QNH2SO4水溶液)， 停止反應(yīng)。在反應(yīng)停止后30分鐘以內(nèi)測定450nm的吸光度，對所得的測定值算出雙份的平 均值。另一方面，通過實時PCR對經(jīng)上述的酶處理(MspI處理)所得的溶液中的DNA進(jìn)
行定量。作為濃度測定用標(biāo)準(zhǔn)樣品，如下所示制備了 MspI處理人基因組DNA溶液。制備人 血液來源基因組DNA (Human Genomic DNA、#636401、克隆技術(shù)(Clontech)公司)的TE緩 沖液的5ng/ μ L TE緩沖液，將該溶液20 μ L、限制性酶MspI 2U、與MspI最適的IOx緩沖液 (IOOmM Tris-HCl pH 7. 5、100mM MgCl2、IOmM二硫蘇糖醇、500mM NaCl) 5 μ L混合，向其中添 加滅菌超純水使液量為50 μ L而對各處理制備了反應(yīng)液，將該反應(yīng)液在37°C孵育1小時，對 于得到的反應(yīng)液，通過基于TE緩沖液的稀釋，制備了 ΙΟ"5, ΙΟ"4, ΙΟ"3, IO-2UO-1U, 10ng/5 μ L 的溶液。擴(kuò)增在作為人轉(zhuǎn)座子而周知的Alu區(qū)域設(shè)計的目標(biāo)DNA區(qū)域(W、序列編號39、與 基因庫檢索號No. AF458110所示堿基編號178-262相當(dāng)?shù)膮^(qū)域)，為了通過實時PCR進(jìn)行定 量，設(shè)計含有序列編號62所示的堿基序列的的正向引物(F)和含有序列編號63所示的堿 基序列的反向引物(R)。
〈目標(biāo)DNA區(qū)域〉W5，-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAG GTCAGGAGATCGAGACCATCC-3‘(序列編號 3Θ)〈正向引物〉F :5，-GGTGGCTCACGCCTGTAATC-3，(序列編號 62)〈反向引物〉R 5，-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3，(序列編號 6 作為PCR的反應(yīng)液，使用如下的反應(yīng)液，即，混合成為模板的上述制備的MspI處理 人基因組DNA溶液5 μ L或上述制備的濃度測定用標(biāo)準(zhǔn)樣品、含有序列編號62和序列編號 63所示的堿基序列的引物的5 μ M溶液各1. 5 μ L.SYBR Green I (龍沙公司)0. Ix量、each 2mM dNTP 2· 5 μ L、IOxPCR緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8. 3、500mM KCl、15mM MgCl2^O. 01% 明膠)2. 5μ L和耐熱性DNA聚合酶(AmpliTaq Gold,5U/yL, ABI公司)0. 125 μ L，向其中 添加滅菌超純水使液量為25 μ L而得的反應(yīng)液。實時PCR使用Mx3005P (Stratagene公司) 進(jìn)行實施。將該該反應(yīng)液在95°C保溫10分鐘后，再通過以在95°C下30秒鐘、在61°C下30 秒鐘、在72°C 45秒鐘為1個循環(huán)而進(jìn)行40個循環(huán)，從而將目標(biāo)DNA區(qū)域擴(kuò)增。通過該實時 PCR的結(jié)果，定量血清樣品中的DNA。將其結(jié)果示于圖19和圖20。通將利用本方法而得的測定值與通過實時PCR而定 量了的值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示有相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)R = 0. 62)(圖19)。另外，將對57歲以 下的人血清樣品的定量結(jié)果，在癌癥患者和健康者之間進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，與健康者相比 較，癌癥患者中的血清中DNA濃度上升(圖20)。在本實驗中可知，形成、選擇了甲基胞嘧啶抗體、被甲基化了的DNA片斷和5’末端 生物素標(biāo)記寡核苷酸的復(fù)合體，通過其功能檢測復(fù)合體中的甲基胞嘧啶抗體，從而可以靈 敏度良好地對人血清中游離DNA進(jìn)行檢測·定量。另外顯示，57歲以下的癌癥患者和健康 者中，血清中DNA濃度不同，進(jìn)而通過本方法可以更加簡單地檢測出其差。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性通過本發(fā)明，可以提供能對具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA簡便進(jìn)行定量或檢測的方法。 另外，可以提供使用被檢者來源的標(biāo)本(優(yōu)選血清)，并根據(jù)對該標(biāo)本的結(jié)果和健康者來源 的標(biāo)本的結(jié)果加以比較，來選出癌癥患者來源的標(biāo)本的方法等。序列表文本序列編號17 63設(shè)計的寡核苷酸
權(quán)利要求
1.一種方法，其是對標(biāo)本中所含的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測的方法，其 特征在于，具有以下工序(1)從標(biāo)本制備要檢測目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA的第一工序；(2)用DNA甲基化酶對由第一工序制備的DNA進(jìn)行處理的第二工序；(3)從經(jīng)第二工序處理了的DNA制備單鏈甲基化DNA，使該單鏈甲基化DNA與檢測寡核 苷酸結(jié)合，得到被測DNA復(fù)合體的第三工序；(4)使由第三工序得到的被測DNA復(fù)合體與固定化甲基化DNA抗體相結(jié)合，得到檢測復(fù) 合體的第四工序；以及，(5)對由第四工序得到的檢測復(fù)合體中所含的檢測寡核苷酸，利用其識別功能進(jìn)行定 量或檢測，從而對上述單鏈DNA中的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA進(jìn)行定量或檢測的第五工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在由第三工序得到被測DNA復(fù)合體時，添加反向 寡核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，固定化甲基化DNA抗體為甲基胞嘧啶抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項所述的方法，其中，DNA甲基化酶為胞嘧啶甲基化酶或 SssI甲基化酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項所述的方法，其中，標(biāo)本中所含的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的 DNA為從RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶而生成的DNA中的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項所述的方法，其中，標(biāo)本為下述任一種生物來源的標(biāo)本(a)哺乳動物來源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細(xì)胞溶解液或組織溶解液、(b)從選自哺乳動物來源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細(xì)胞溶解液及組織溶解液的一 種中提取的DNA、(c)將從選自哺乳動物來源的組織、細(xì)胞、組織溶解液及細(xì)胞溶解液的一種中提取的 RNA作為模板而制得的DNA、(e)從細(xì)菌、真菌或病毒提取的DNA、或(f)將從細(xì)菌、真菌或病毒提取的RNA作為模板而制得的DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項所述的方法，其中，由第一工序得到的上述具有目標(biāo) DNA區(qū)域的DNA為事先用不以目標(biāo)DNA區(qū)域為識別剪切位點的限制性酶消化處理而得的 DNA、合成寡核苷酸、或精制而成的DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項所述的方法，檢測寡核苷酸的識別功能是以下任一種 的識別功能(a)FITC的熒光檢測、或(b)利用FITC抗體的檢測。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項所述的方法，其中，檢測寡核苷酸包括人基因組中的重 復(fù)序列、重復(fù)基因或假基因的堿基序列或者能夠與其一部分相互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，人基因組中的重復(fù)序列為LINE或SINE。
11.根據(jù)權(quán)利要求1 10中任一項所述的方法，其中，檢測寡核苷酸包括能夠與以下所 示任一種堿基序列相互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列(1)序列編號37所示的堿基序列或與其有80%以上序列一致性的堿基序列、(2)序列編號37所示堿基序列的互補(bǔ)序列或與其有80%以上序列一致性的堿基序列、(3)序列編號39所示的堿基序列或與其有80%以上序列一致性的堿基序列、或(4)序列編號39所示堿基序列的互補(bǔ)序列或與其有80%以上序列一致性的堿基序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求1 10中任一項所述的方法，其中，檢測寡核苷酸包括以下所示的任 一種的堿基序列(1)序列編號38所示的堿基序列或與其有80%以上序列一致性的堿基序列、(2)序列編號38所示堿基序列的互補(bǔ)序列或與其有80%以上序列一致性的堿基序列、(3)序列編號40所示的堿基序列或與其有80%以上序列一致性的堿基序列、或(4)序列編號40所示堿基序列的互補(bǔ)序列或與其有80%以上序列一致性的堿基序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求1 12中任一項所述的方法，其中，第一工序中，在用于從標(biāo)本制備 DNA的DNA提取操作中所使用的溶液中的鈉鹽的濃度為IOOmM以上IOOOmM以下。
14.根據(jù)權(quán)利要求1 12中任一項所述的方法，其中，第一工序中，在用于從標(biāo)本制備 DNA的DNA提取操作中所使用的溶液中的鈉鹽的濃度為IOOmM以上200mM以下。
15.一種方法，其是篩選癌患者來源標(biāo)本的方法，其中，包括以下工序通過權(quán)利要求1 14中任一項所述的方法使用被檢者來源的標(biāo)本而定量或檢測的DNA 的定量結(jié)果或檢測結(jié)果，與通過相同方法使用健康者來源標(biāo)本而定量或檢測的DNA的定量 結(jié)果或檢測結(jié)果之間的差異如有顯著性意義，則將被檢者來源標(biāo)本評價為癌患者來源標(biāo) 本，根據(jù)該評價結(jié)果來鑒定癌患者來源標(biāo)本。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，標(biāo)本為哺乳動物來源的血清。
17.根據(jù)權(quán)利要求15 16中任一項所述的方法，其中，具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA為哺 乳動物來源血清中的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的游離DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及將標(biāo)本中含有的具有目標(biāo)DNA區(qū)域的DNA定量或檢測的方法等。
文檔編號C12Q1/25GK102105586SQ20098012948
公開日2011年6月22日 申請日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月11日
發(fā)明者佐藤日出夫, 冨原祥隆, 樽井弘和 申請人:住友化學(xué)株式會社