專利名稱：利用微生物生產(chǎn)低聚木糖的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物酶工程技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，用于以玉米芯為原料生產(chǎn)低聚木糖，特 別涉及利用微生物生產(chǎn)低聚木糖的新方法。
背景技術(shù)：
低聚木糖，又稱木寡糖，是由2-7個木糖分子以β -1，4糖苷鍵連接而成的低聚糖， 以木二糖和木三糖為主。低聚木糖天然存在于竹根、水果、蔬菜、牛乳和蜂蜜中，但含量都非 常少。用于生產(chǎn)低聚木糖的主要原料有硬木、玉米芯、鋸屑、蔗渣、甜菜渣、谷殼、麩皮等。低 聚木糖的甜度約為蔗糖的40%，甜味純正，干品呈淺褐色或淡黃色粉末狀，在PH 0.8-1.5 時不降解，酸穩(wěn)定性極高，不吸濕返潮，流動性頗佳，并具有優(yōu)良的生理活性和良好的熱穩(wěn) 定性，是目前所有低聚糖中增殖雙歧桿菌效價比最高的益菌因子，被稱為“超強(qiáng)雙歧因子”， 其功效是大豆低聚糖、低聚果糖、低聚異麥芽糖等其他聚合糖類的10-20倍。低聚木糖活化 益生菌的用量最小，被公認(rèn)為是功能性最強(qiáng)、應(yīng)用范圍最廣的功能性低聚糖之一。從20世 紀(jì)60年代起，低聚木糖的制備就成為世界各國研發(fā)的熱點，但在相當(dāng)長一段時間內(nèi)未解決 其生產(chǎn)問題，直到1989年日本三得利(Simtory)公司取得關(guān)鍵性技術(shù)突破，實現(xiàn)了低聚木 糖工業(yè)化生產(chǎn)，并被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥保健品等行業(yè)中。低聚木糖作為飼料添加劑 的研究要晚一些，相關(guān)研究結(jié)果表明，低聚木糖在動物體內(nèi)表現(xiàn)出高選擇性促進(jìn)雙歧桿菌 增殖的顯著功能，可促進(jìn)動物消化道內(nèi)有益菌的繁殖、抑制有害菌生長、改善微生物菌群平 衡、防止病原菌定值腸道以減少其對動物機(jī)體造成的毒害；可激活或促進(jìn)動物機(jī)體細(xì)胞和 體液的免疫功能、減少血氨濃度、提高免疫力和抗體反應(yīng)能力，從而加強(qiáng)疫苗的保護(hù)效能; 同時，低聚木糖對大腸桿菌、沙門氏菌有較好的抑制作用，可預(yù)防和防止腹瀉；雙歧桿菌發(fā) 酵低聚木糖產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸(醋酸、乳酸)，能刺激腸道蠕動，增加糞便濕潤度，并保 持一定的滲透壓，從而防止便秘的發(fā)生；另外，低聚木糖的加入可起到改善飼料利用率、增 進(jìn)礦物質(zhì)吸收、提高動物生產(chǎn)性能以及替代抗生素的多種功效。低聚木糖在飼料中綜合效 能的表現(xiàn)使其成為近幾年飼料添加劑的主要研究方向之一，尤其是隨著對濫用抗生素帶來 越來越大的副作用的研究的深入，許多國家紛紛立法禁止抗生素作為飼料添加劑使用，而 具有抗生素替代作用的微生態(tài)制劑的益生菌和益生元成為各國飼料工業(yè)中的研究熱點。低 聚木糖屬于益生元(Prebiotics)類，它為消化道已有的有益細(xì)菌直接提供可發(fā)酵底物，使 有益菌-雙歧桿菌大量增加，進(jìn)而調(diào)節(jié)消化道的微生態(tài)平衡，對于動物健康和生產(chǎn)性能的 促進(jìn)作用可以部分或全部替代抗生素。我國對低聚木糖的研究及生產(chǎn)起步較晚，在“八五”、“九五”期間立項進(jìn)行研究和 攻關(guān)，到2000年才首次實現(xiàn)低聚木糖工業(yè)化生產(chǎn)，成為世界上第二個可以規(guī)模生產(chǎn)高純度 低聚木糖的國家，此時世界主要發(fā)達(dá)國家的低聚木糖年產(chǎn)量已達(dá)到30多萬噸。2009年我國 飼料的總產(chǎn)量達(dá)到1. 37億噸，其中濃縮飼料達(dá)到2708萬噸，預(yù)混合飼料達(dá)到595萬噸，對 飼料添加劑會有相當(dāng)大的需求，低聚木糖飼料添加劑亦將占據(jù)很大比例，其市場需求量巨 大。
工業(yè)化生產(chǎn)低聚木糖一般以木質(zhì)纖維素類物質(zhì)為原料，如富含木聚糖的玉米芯、 甘蔗渣、棉子殼、燕麥、樺木等農(nóng)作物，它們的組成相似，均由木質(zhì)素、纖維素和半纖維素三 種聚合物組成。根據(jù)對原料或中間產(chǎn)物木聚糖所采用的處理方式不同，低聚木糖的生產(chǎn)方 法分為三類1、化學(xué)法生產(chǎn)低聚木糖。用富含木聚糖的原料經(jīng)化學(xué)溶劑處理制取低聚木糖，最 常見的原料處理是堿法和酸法堿法制取低聚木糖的不足是使用大量的堿造成設(shè)備腐蝕和 環(huán)境污染；酸法制取低聚木糖的提取液中木糖比例很高，不能滿足低聚木糖的生產(chǎn)要求，提 取過程會產(chǎn)生許多副反應(yīng)，生成一些可能致癌物質(zhì)，從而影響到產(chǎn)品的安全性。2、酶法生產(chǎn)低聚木糖。即利用酶發(fā)酵富含木聚糖的木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)低聚木 糖。酶法生產(chǎn)低聚木糖，以棉子殼、甘蔗渣、玉米芯、稻草、燕麥殼和花生殼等天然纖維物質(zhì) 為原料，采用木聚糖酶分解木聚糖，使之產(chǎn)生低聚木糖，再經(jīng)脫色、脫鹽、濃縮精制等處理， 得到低聚木糖糖漿狀產(chǎn)品，若在糖漿中添加糊精等賦形劑，再經(jīng)噴霧干燥，可制成粉狀產(chǎn) 品。本法由于底物不溶于水，因此反應(yīng)在固液相上進(jìn)行，酶促反應(yīng)比較困難，而且木聚糖酶 的基質(zhì)親和性會產(chǎn)生吸附現(xiàn)象，造成酶回收十分困難。3、化學(xué)-酶聯(lián)合法生產(chǎn)低聚木糖。由于水溶性木聚糖比不溶性木聚糖更容易酶 解，先采用蒸煮或熱水抽取、酸抽取、堿抽取、蒸汽噴爆等方法，從植物原料中提取木聚糖， 精制得到水溶性木聚糖，然后經(jīng)木聚糖酶水解得到低聚木糖粗液，再經(jīng)脫色、脫鹽、濃縮后 得到低聚木糖產(chǎn)品。此法目前工業(yè)化生產(chǎn)低聚木糖比較常用。工業(yè)化生產(chǎn)低聚木糖的主要原料是玉米芯、棉子殼、甘蔗渣等，其中玉米芯木糖含 量最高，達(dá)30-40%，從化學(xué)組成上看，玉米芯含有豐富的半纖維素，是世界公認(rèn)的制備低聚 木糖的理想原料。我國年產(chǎn)玉米約1. 2億噸，按3kg玉米產(chǎn)1公斤玉米芯計算，每年可產(chǎn)出 玉米芯0. 4億噸左右，用來做制備低聚木糖的原料其數(shù)量極其可觀。目前國內(nèi)外公開報道 的以玉米芯為原料生產(chǎn)低聚木糖的方法主要是化學(xué)-酶聯(lián)合法，從制造工藝來講，用玉米 芯制備低聚木糖的難點是對酶的要求很高，需要酶的高度專一性，另一方面是分離提純技 術(shù)難度大，現(xiàn)有的技術(shù)與急劇增加的市場需求存在不小的差距。近幾年有報道用黑曲霉固 體發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶，再用木聚糖酶水解木聚糖制備低聚木糖，但是，此方法需要28°C培養(yǎng) 72小時，才能獲得酶活大于2500IU/g (培養(yǎng)基干重)木聚糖酶，不僅時間較長，生產(chǎn)過程中 周期變壓操作的環(huán)節(jié)也增加了生產(chǎn)工藝的難度，且酶活較低無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。 使用微生物發(fā)酵培養(yǎng)物直接與原料液反應(yīng)制備低聚木糖的方法還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種使用黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)物直接與玉米芯原料液反應(yīng)制 備低聚木糖的新方法。本發(fā)明以玉米芯為原料，經(jīng)粉碎、加水后采用稀硫酸液預(yù)處理技術(shù)，進(jìn)行酸化 和高溫裂解處理得到原料混合液，直接接種優(yōu)良菌株-黑曲霉菌株Aspergillus niger U8-7(簡稱為黑曲霉U8-7，下同)的發(fā)酵培養(yǎng)物，進(jìn)行微生物誘導(dǎo)產(chǎn)酶酶解，再經(jīng)分離、除 雜、脫色、脫鹽、過濾、濃縮、噴霧干燥，獲得20% -99%的低聚木糖成品。實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)路線是1.黑曲霉U8-7的分離篩選
(1)菌株的分離純化從野外腐爛的玉米芯中獲取黑曲霉菌株，取其樣品lg，裝入有IOOml無菌水和玻 璃珠的三角瓶中，振蕩打散，制成玉米芯懸液，接入PDA培養(yǎng)基(組成為土豆200g，葡萄糖 20g，瓊脂20g，水1000ml，pH自然)培養(yǎng)，溫度30°C，培養(yǎng)72小時，進(jìn)行分離純化，同時產(chǎn)生 孢子。其中對照菌株采用黑曲霉Aspergillus niger AS3. 4309，購自中科院微生物菌種保 藏中心。(2)菌株增殖培養(yǎng)用接種環(huán)刮取純化的黑曲霉孢子于裝有IOOml無菌水和玻璃珠的三角瓶中，振 蕩，4層紗布過濾并稀釋計數(shù)，制成每毫升含3-5個孢子的孢子懸液，取Iml孢子懸液注入查 氏培養(yǎng)基(組成為硝酸鈉2g，磷酸氫二鉀lg，氯化鉀0. 5g，硫酸鎂0. 5g，硫酸亞鐵0. Olg, 蔗糖30g，瓊脂20g，水1000ml，pH自然)平板中涂布，30°C培養(yǎng)3d后，選取每個平板最大菌 落接種發(fā)酵玉米芯，檢測發(fā)酵玉米芯中木聚糖酶的酶活力高低，篩選出優(yōu)良黑曲霉U8-7。2.黑曲霉U8-7發(fā)酵培養(yǎng)物組成及產(chǎn)酶條件通過對黑曲霉U8-7產(chǎn)酶條件和酶學(xué)特性的研究，使用單因素和中心組合設(shè)計實 驗，確定了黑曲霉U8-7的發(fā)酵培養(yǎng)物的組成為(重量百分比)玉米芯粉30 40%、麩皮 10 20%、玉米5 15%、硝酸銨2%、氯化鈉1%、水35%、黑曲霉邯-7接種量1 2%。 黑曲霉U8-7產(chǎn)木聚糖酶的產(chǎn)酶條件為溫度30°C 38°C，pH值3 6，培養(yǎng)周期48 72h。 黑曲霉U8-7最終達(dá)到產(chǎn)酶穩(wěn)定且酶活力高，在生產(chǎn)過程中產(chǎn)酶活力達(dá)到100，000IU/g。3.玉米芯酸化處理和高溫裂解將玉米芯粉碎與水按重量1 5 1 10混合攪拌均勻，加入玉米芯重量0. 1 %的稀硫酸進(jìn)行酸化處理，控制PH值在3 5之間，酸化處理2 3小時。將經(jīng)過酸化處 理的混合液加熱至120°C 160°C，蒸煮1 2個小時，進(jìn)行裂解，經(jīng)過裂解的混合液，玉米 芯所含的木聚糖得到充分溶出。4.酶解反應(yīng)將裂解后的玉米芯混合液降溫至60°C以下，調(diào)節(jié)pH值為3 6，在30°C 60°C 直接接種黑曲霉U8-7發(fā)酵培養(yǎng)物，進(jìn)行微生物誘導(dǎo)產(chǎn)木聚糖酶酶解5 12小時，然后升 溫到100°C 120°C處理30分鐘，過濾混合液，得到含木聚糖溶液，此液的可溶性總糖達(dá)到 26% 35% (按木聚糖含量為35%的玉米芯計)，木二糖與木三糖含量較高。5.分離、除雜、脫色、脫鹽、過濾、將過濾后的混合液以0 30%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，使木糖、木二糖、木三 糖、木四糖和木五糖得到分離。用活性炭作為吸附劑，進(jìn)行除雜、脫色、脫鹽，純化含低聚木 糖的液體。對低聚木糖溶液進(jìn)行納濾膜過濾，除去不在需要的DP(低聚木糖聚合度)范圍 內(nèi)低聚木糖和非糖組分，得到特定DP范圍(2 7個木糖分子)內(nèi)的低聚木糖。6.產(chǎn)品后處理對分離、除雜、脫色、脫鹽、過濾后的木聚糖溶液進(jìn)行真空濃縮，成為淺黃色粘稠 狀低聚木糖糖漿。真空濃縮后的低聚木糖糖漿的純度為55% 75%，若以麥芽糊精和玉 米淀粉為賦形劑，可以制成20% 50%的低聚木糖的粉劑；若進(jìn)行噴霧干燥，即可生產(chǎn)成 70% 99%的高純度的低聚木糖粉劑。本發(fā)明采用直接接種黑曲霉U8-7發(fā)酵培養(yǎng)物，進(jìn)行微生物誘導(dǎo)產(chǎn)木聚糖酶酶解
5的工藝，省去了生產(chǎn)木聚糖酶所需要的設(shè)備、減少了生產(chǎn)環(huán)節(jié)、縮短了生產(chǎn)周期、降低了生 產(chǎn)成本，黑曲霉U8-7菌株在生產(chǎn)過程中產(chǎn)酶活力達(dá)到100，000IU/g,是現(xiàn)有技術(shù)的40倍，明 顯提高了低聚木糖的產(chǎn)出率。本發(fā)明采用稀硫酸液預(yù)處理技術(shù)，使得預(yù)處理酸液用量比國內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)減少 40 %，大大降低了生產(chǎn)環(huán)節(jié)對環(huán)境的污染。采用納濾膜過濾技術(shù)，可以得到特定DP范圍內(nèi)的低聚木糖，膜的使用效率和低聚 木糖的總回收率均高?；钚蕴烤哂蟹蛛x容量大，適用范圍廣，其分離、除雜、脫色、脫鹽效果 好，成本低，活性炭還可以重復(fù)使用。本發(fā)明所產(chǎn)的低聚木糖作為飼料添加劑可提高養(yǎng)殖綜合效益15% 35%，提高 動物生產(chǎn)性能10%以上，降低抗生素藥物用量80%以上，降低畜禽發(fā)病60% 80%。利用玉米芯為原料生產(chǎn)低聚木糖，是提高農(nóng)副產(chǎn)品開發(fā)利用附加值的一條很好的 出路，其生產(chǎn)和應(yīng)用完全符合綠色飼料添加劑的要求和國家大力發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色食品 的產(chǎn)業(yè)化政策，順應(yīng)了以非藥物添加劑替代抗生素作為畜禽防病、促進(jìn)生長的發(fā)展趨勢，有 著很好的經(jīng)濟(jì)、社會和環(huán)保效益。
具體實施例方式1.黑曲霉U8-7的分離篩選(1)菌株的分離純化從野外腐爛的玉米芯中獲取黑曲霉菌株，取其樣品lg，裝入有IOOml無菌水和玻 璃珠的三角瓶中，振蕩打散，制成玉米芯懸液，接入PDA培養(yǎng)基(土豆200g，葡萄糖20g，瓊 脂20g，水1000ml，pH自然)培養(yǎng)，溫度30°C，培養(yǎng)72小時，進(jìn)行分離純化，同時產(chǎn)生孢子。 其中對照菌株采用黑曲霉Aspergillus niger AS3. 4309，購自中科院微生物菌種保藏中 心。(2)菌株增殖培養(yǎng)用接種環(huán)刮取純化的黑曲霉孢子于裝有IOOml無菌水和玻璃珠的三角瓶中，振 蕩，4層紗布過濾并稀釋計數(shù)，制成每毫升含3-5個孢子的孢子懸液，取Iml孢子懸液注入 查氏培養(yǎng)基(硝酸鈉2g，磷酸氫二鉀lg，氯化鉀0. 5g，硫酸鎂0. 5g，硫酸亞鐵O.Olg，蔗糖 30g，瓊脂20g，水1000ml，pH自然)平板中涂布，30°C培養(yǎng)3d后，選取每個平板最大菌落接 種發(fā)酵玉米芯，檢測其酶活力高低，篩選出優(yōu)良黑曲霉U8-7。2.黑曲霉U8-7發(fā)酵培養(yǎng)物組成及產(chǎn)酶條件通過對黑曲霉U8-7產(chǎn)酶條件和酶學(xué)特性的研究，使用單因素和中心組合設(shè)計實 驗，確定了黑曲霉U8-7的發(fā)酵培養(yǎng)物的組成為(重量百分比)玉米芯粉35%、麩皮15%、 玉米10 %、硝酸銨2 %、氯化鈉1 %、水35 %、黑曲霉U8-7接種量2 %。黑曲霉U8-7產(chǎn)木聚 糖酶的產(chǎn)酶條件為溫度30°C，pH值5，培養(yǎng)周期72h。黑曲霉U8-7最終達(dá)到產(chǎn)酶穩(wěn)定且酶 活力高，在生產(chǎn)過程中產(chǎn)酶活力達(dá)到100，000IU/g。3、玉米芯加水加酸處理將玉米芯粉100公斤與水600公斤進(jìn)行混合，加入1公斤稀硫酸進(jìn)行酸化處理，控 制PH值為4，處理3小時，然后160°C蒸煮2個小時，進(jìn)行玉米芯裂解，促進(jìn)玉米芯所含木聚 糖溶出。
4、酶解反應(yīng)調(diào)節(jié)玉米芯混合液的pH值為5，在35°C直接接種黑曲霉U8-7發(fā)酵培養(yǎng)物，進(jìn)行微 生物誘導(dǎo)產(chǎn)木聚糖酶酶解7小時，然后升溫到120°C處理30分鐘，得到含木聚糖的混合溶 液。5、分離、除雜、脫色、脫鹽、過濾將木聚糖混合液以0 30%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，使木糖、木二糖、木三糖、 木四糖和木五糖得到分離。用活性炭作為吸附劑，進(jìn)行除雜、脫色、脫鹽，純化含低聚木糖的 液體。對低聚木糖溶液進(jìn)行納濾膜過濾，除去不在需要的DP范圍內(nèi)低聚木糖和非糖組分， 得到特定DP范圍(2 7個木糖分子)內(nèi)的低聚木糖。6、產(chǎn)品后處理工藝對納濾膜過濾后的木聚糖溶液進(jìn)行加工，經(jīng)過真空濃縮成為淺黃色粘稠狀低聚木 糖糖漿，純度為50% 75%，以麥芽糊精和玉米淀粉為賦形劑，可以制成20% 50%的低 聚木糖的粉劑；經(jīng)噴霧干燥能生產(chǎn)成70% 99%的高純度的低聚木糖產(chǎn)品。
權(quán)利要求
利用微生物生產(chǎn)低聚木糖的新方法，其特征在于，以玉米芯為原料，經(jīng)粉碎、加水后進(jìn)行酸化和高溫裂解處理得到原料混合液，直接接種黑曲霉菌株Aspergillus niger U8 7的發(fā)酵培養(yǎng)物，進(jìn)行微生物誘導(dǎo)產(chǎn)酶酶解，再經(jīng)分離、除雜、脫色、脫鹽、過濾、濃縮、噴霧干燥，獲得低聚木糖成品。
2.如權(quán)利要求1所述的利用微生物生產(chǎn)低聚木糖的新方法，其特征在于，所述的黑曲 霉菌株Aspergillus niger U8-7的獲得方法如下從野外腐爛的玉米芯中分離得到黑曲霉 菌株，進(jìn)行分離純化，通過增殖培養(yǎng)，篩選出黑曲霉菌株Aspergillus niger U8-7。
3.如權(quán)利要求2所述的利用微生物生產(chǎn)低聚木糖的新方法，其特征在于，黑曲霉菌株 Aspergillus niger U8-7的分離純化步驟如下將從野外腐爛的玉米芯中獲取的黑曲霉菌 株加入無菌水，制成混懸液，接入PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度30°C，培養(yǎng)72小時，進(jìn)行分離純化。
4.如權(quán)利要求2所述的利用微生物生產(chǎn)低聚木糖的新方法，其特征在于，黑曲霉菌株 Aspergillus niger U8-7增殖培養(yǎng)步驟如下取分離純化后的黑曲霉制成每毫升含3_5個 孢子的孢子懸液，取Iml孢子懸液注入查氏培養(yǎng)基平板中涂布，30°C培養(yǎng)3d后，選取每個平 板最大菌落接種發(fā)酵玉米芯，檢測發(fā)酵玉米芯中木聚糖酶的酶活力高低。
5.如權(quán)利要求1 4任一所述的利用微生物生產(chǎn)低聚木糖的新方法，其特征在于，黑曲 霉菌株Aspergillus niger U8-7的發(fā)酵培養(yǎng)物的組成為玉米芯粉30 40%、麩皮10 20%、玉米5 15%、硝酸銨2%、氯化鈉1%、水35%、黑曲霉菌株Aspergillus niger U8-7 接種量1 2%。
6.如權(quán)利要求5所述的利用微生物生產(chǎn)低聚木糖的新方法，其特征在于，黑曲霉菌株 Aspergillus niger U8-7產(chǎn)木聚糖酶的產(chǎn)酶條件為溫度30°C 38°C，pH值3 6，培養(yǎng) 周期48 72h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用微生物生產(chǎn)低聚木糖的新方法，該方法以玉米芯為原料，經(jīng)粉碎、加水后進(jìn)行酸化和高溫裂解處理得到原料混合液，直接接種黑曲霉(Aspergillus niger U8-7)的發(fā)酵培養(yǎng)物，進(jìn)行微生物誘導(dǎo)產(chǎn)酶酶解，再經(jīng)分離、除雜、脫色、脫鹽、過濾、濃縮、噴霧干燥，獲得低聚木糖成品。本發(fā)明省去了生產(chǎn)木聚糖酶的生產(chǎn)環(huán)節(jié)，降低了生產(chǎn)成本，低聚木糖的產(chǎn)出率明顯提高。
文檔編號C12N1/14GK101914589SQ20101024719
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者張秀江, 王秋菊 申請人:河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司