專利名稱：黃粉蟲抗菌肽TmAMP3m在大腸桿菌中的高效表達及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物次生物質(zhì)代謝技術(shù)領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種黃粉蟲抗菌肽在大腸桿菌中的高效表達及其高效表達的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗菌肽廣泛存在于各種生物體內(nèi)，如細菌、真菌、昆蟲、植物和脊椎動物等，它們具有廣譜抗菌活性，對細菌，真菌，病毒，原生動物都有抑殺活性，能保護機體抵御外源微生物的侵略，是宿主體內(nèi)先天性免疫系統(tǒng)中的重要組成成分，因此，抗菌肽也被稱作宿主防御肽。此外，抗菌肽在免疫反應(yīng)(炎癥反應(yīng)、傷口愈合、獲得性免疫系統(tǒng)調(diào)控)和維持穩(wěn)態(tài)中也發(fā)揮多種功能。目前，已經(jīng)從多種生物體內(nèi)分離鑒定出1200多種抗菌肽，它們通常作用于細胞膜帶正電荷的抗菌肽通過靜電作用與磷脂雙分子膜結(jié)合，同時折疊形成α螺旋或β折疊構(gòu)象，然后兩親性的抗菌肽插入細胞膜，形成不同孔洞，比如“桶板”模型、“環(huán)形孔”模型、 “氈毯”模型、“凝聚”模型等，導致內(nèi)容物外泄，從而抑殺微生物。最近也有研究表明，抗菌肽還可以作用于胞內(nèi)靶物質(zhì)，如與DNA、RNA和一些蛋白相互作用，或抑制細胞壁形成，或影響細菌和真菌的細胞周期，或直接抑制一些依賴ATP酶的活性，從而發(fā)揮抗菌活性?？咕膽{借其分子量小、具有廣譜抗菌活性、能迅速抑殺外源微生物、不易使細菌產(chǎn)生抗性等眾多優(yōu)勢受到廣泛關(guān)注，抗菌肽已被應(yīng)用于飼料添加劑、轉(zhuǎn)基因動植物的培育、 醫(yī)藥研發(fā)等各個領(lǐng)域。研究表明在肉雞日糧中添加抗菌肽，可以增強肉雞特異性免疫應(yīng)答； 將抗菌肽thanatin基因轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出明顯的抗稻瘟病表型，提高了水稻抗病性；此外，抗菌肽ranalexin和溶葡萄球菌酶組合使用，能顯著抑殺耐甲氧西林抗生素的葡萄球菌。雖然對抗菌肽的研究顯示出其巨大的應(yīng)用前景，但是它的推廣應(yīng)用也面臨眾多困難。生物體內(nèi)天然抗菌肽含量相對很少，直接提取純化過程繁瑣，成本昂貴，得率不高；人工合成的抗菌肽很難保證其生物活性；基因工程手段表達抗菌肽，又面臨表達的抗菌肽很可能對宿主菌產(chǎn)生毒害作用，或形成包涵體蛋白，或抗菌肽在純化過程中喪失活性等問題。 此外，小分子量的抗菌肽很容易在純化過程中被蛋白酶降解，細胞毒性機制和藥力學動力都不太清楚成為限制抗菌肽大規(guī)模應(yīng)用的障礙。尋找一種簡便高效經(jīng)濟的途徑，生產(chǎn)高活性、無細胞毒害作用的抗菌肽成為研究熱點。因此，尋求一種大規(guī)模制備高活性抗菌肽的途徑成為亟待解決的問題。近年來，對昆蟲抗菌肽的研究已成為一個迅速發(fā)展的新領(lǐng)域，越來越引起人們的關(guān)注和重視。黃粉蟲(Tenebrio molitor)又稱面包蟲，屬鞘翅目擬步甲科粉蟲族。雖然早在1995年就公布了黃粉蟲抗菌肽基因tenecin3，但至今為止，有關(guān)黃粉蟲抗菌肽的報道并不多，國內(nèi)主要集中于飼養(yǎng)方法、誘導條件、初步分離進行了研究報道。雖然黃粉蟲分布廣， 資源豐富，但是，由于天然抗菌肽含量少，提取得率低(0.005% )，成本高，未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，獲得黃粉蟲抗菌肽基因的高效表達，為黃粉蟲抗菌肽的研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)，而開發(fā)一種經(jīng)濟、簡便、高效地表達高活性黃粉蟲抗菌肽的途徑，對于大規(guī)模生產(chǎn)高活性重組抗菌肽具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)天然抗菌肽含量少，提取得率低，重組抗菌肽的表達量不高的現(xiàn)狀， 本發(fā)明旨在實現(xiàn)突變的黃粉蟲抗菌肽基因TmAMPaii在大腸桿菌中的高效表達，通過實現(xiàn)高抗菌活性、穩(wěn)定性強使得抗菌肽在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中不易失活，為大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵提供了保障。本發(fā)明的技術(shù)方案利用GenBank公布的黃粉蟲(Tenebrio moIitor)抗菌肽基因 tenecin3序列設(shè)計特異引物，以RT-PCR法從黃粉蟲體內(nèi)克隆到抗菌肽的cDNA分子，序列分析表明在219位的堿基由G變?yōu)锳，所編碼的蛋白質(zhì)富含甘氨酸、谷氨酰胺和組氨酸。為了獲得黃粉蟲抗菌肽的原核高效表達，本發(fā)明設(shè)計了特異性突變引物用于擴增其成熟肽部分核酸序列，以利其高抗菌活性的發(fā)揮，將成熟肽部分N端的一個脯氨酸、一個組氨酸和兩個天冬氨酸突變成三個甘氨酸和一個谷氨酰胺；從而獲得本發(fā)明用于原核細胞高效表達并具有高活性的抗菌肽基因237bp，命名為TmAMP;3m。將TmAMP;3m亞克隆至pET_30a表達載體中，轉(zhuǎn)化到E. coli BL21中表達融合蛋白，SDS-PAGE檢測證明黃粉蟲抗菌肽基因TmAMP;3m 得到了可溶性高效表達，經(jīng)Ni2+柱親和層析純化融合蛋白，獲得的TmAMP;3m。進一步通過對 TmAMPaii進行抑菌活性、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、抗菌活性進行測定，證明加入IPTG后，BL21 轉(zhuǎn)化菌生長受到一定程度抑制；TmAMPai^S 10(TC煮沸IOh和強酸強堿處理后，抗菌活性幾乎不變；TmAMPaii對耐藥菌具有一定抑殺作用。具體的，本發(fā)明提供了一種黃粉蟲抗菌肽具有如序列表SEQ ID NO. 1所示的堿基序列，全長為237bp，其編碼由序列表SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中79個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，獲得的重組黃粉蟲抗菌肽富含甘氨酸、谷氨酰胺和組氨酸。具體的，本發(fā)明提供了突變的黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii基因在大腸桿菌中高效表達的方法，具體步驟如下(1)利用GenBank公布的黃粉蟲(Tenebrio moIitor)抗菌肽tenecin3基因序列 (登錄號為TMU21482)設(shè)計特異引物上游引物TF1:5' -ATGAAAACATTCGTGATTTGCTTGATTCTGG-3'，下游引物TR1:5' -TTAATGA CCATGTGTCTTGTACCCTCCTTGG-3‘；(2)以RT-PCR法從黃粉蟲體內(nèi)克隆了抗菌肽的cDNA分子，序列分析表明，與 tenecin3相比在219位的堿基由G變?yōu)锳。(3)設(shè)計特異性突變引物用于擴增其成熟肽部分核酸序列，以利其高抗菌活性的發(fā)揮，將成熟肽部分N端的一個脯氨酸、一個組氨酸和兩個天冬氨酸突變成三個甘氨酸和一個谷氨酰胺；從而獲得本發(fā)明用于原核細胞高效表達的抗菌肽基因237bp，命名為 TmAMP3m。(4)將TmAMP3m亞克隆至pET-30a表達載體中，得到重組質(zhì)粒pET30a-TmAMP3m ；轉(zhuǎn)化到E. coli BL21中表達融合蛋白；通過SDS-PAGE檢測證明黃粉蟲抗菌肽基因TmAMPaii得到了可溶性高效表達。(5)超聲波破碎細胞后，經(jīng)Ni2+親和層析柱純化，獲得TmAMP3m，進行功能活性檢測。
進一步，本發(fā)明詳細提供了突變黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii在大腸桿菌中的高效表達的方法，具體步驟如下(I)PCR引物的設(shè)計及基因的擴增根據(jù)GenBank中發(fā)表的黃粉蟲抗菌肽基因tenecin 3序列(登錄號為TMU21482)， 設(shè)計特異引物上游引物TF1:5' -ATGAAAACATTCGTGATTTGCTTGATTCTGG-3'，下游引物TR1:5' -TTAATGA CCATGTGTCTTGTACCCTCCTTGG-3‘。向4齡黃粉蟲腹部注射5 μ 1金黃色葡萄球菌，注射后正常飼養(yǎng)16h，取一條黃粉蟲幼蟲，放入無RNA酶的研缽中液氮研磨，粉末移入裝有ImL Trizol試劑的Eppendorf管中， 蓋緊蓋激烈震蕩20s，20 25°C室溫放置3 5min，4°C、12000rpm,離心lOmin，小心的將上清移入干凈Eppendorf管中，加入氯仿0. 22mL抽提蛋白質(zhì)，震蕩20s，20 25°C室溫放置 3 5min，4°C、12000rpm離心15min，溶液分成上、中、下三層，其中無色上層即為含RNA層。 將此層移入潔凈的1. 5mL的Eppendorf管中，加入異丙醇0. 5mL，20 25°C室溫放置15min， 4°C、12000rpm離心lOmin。棄上清，沉淀部分加入75%乙醇溶液(無RNA酶水配置)lmL， 洗滌，4V，7500rpm,離心5min。棄上清，待沉淀干燥后，加入無RNA酶水，輕輕混勻，使其充分溶解，A260/A280鑒定RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余_70°C保存。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。EP管中配制下列模板RNA/弓丨物混合液10yL總RNA，IOyL Oligo dT-Adaptor引物，31. 5 μ L無RNase的水，70°C保溫IOmin后迅速在冰上急冷^iiin以上。離心數(shù)秒使模板RNA/引物的變性液聚集于管底。再加入51. 5 μ L上述RNA/引物變性溶液，20 μ L 5 XM-MLV 緩沖液，20 μ L dNTP, 2. 5 μ L RNase 抑制劑，6 μ L RNase M-MLV (RNase H-)。42°C保溫lh，70°C保溫IOmin后，迅速在冰上急冷^iin以上。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，最后以合成的cDNA為模板進行PCR擴增抗菌肽基因。反應(yīng)條件為94°C預變性lmin， 94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸40s, 35個循環(huán)，最后72°C延伸10min，4°C保存。 PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。回收PCR產(chǎn)物，與克隆載體pBS-T過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞。挑取單克隆提取質(zhì)粒，選用PBS-T載體上的酶切位點(BamH I和Hind III)進行酶切鑒定并進行序列測定。(2)突變黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii成熟肽基因的PCR擴增克隆TmAMPan基因序列引物上游引物71F1-1:5 ‘ -CGCGGATCCGGAGGCCATCAGGGCGGACATCTGGGTGGTCACC-3‘下游引物TR1:5' -TTAATGACCATGTGTCTTGTACCCTCCTTGG-3'。PCR 反應(yīng)體系13. 9μ L dd H2O, 2 μ LlO X Taq 緩沖液，1. 5 μ L dNTPs, 0. 5 μ LMg2+, 0. 5 μ L Primer(71F1-1)，0. 5 μ LPrimer(TRl)，1 μ LcDNAPCR 反應(yīng)條件94°C預變性 lmin，94°C變性 lmin，57°C退火 lmin，72°C延伸 40s，；35 個循環(huán)。最后72°C溫育lOmin。M為DNA標準分子量DL2000) ；C為對照Control ;1、2為引物 TFl，TRl 擴增 TmAMP3m。(3)原核表達載體的構(gòu)建及鑒定設(shè)計帶有酶切位點的特異引物擴增突變黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因。
上游引物71F1:5' -CGCGGATCCGCTCCTGA CCATCACGACGGACATC-3 ‘，下劃線部分為BamH I酶切位點；下游引物71R1:5' -CCGCTCGAGTTAATGACCATGTGTCTTGTACCC-3 ‘，下劃線部分為 Xho I酶切位點，PCR 反應(yīng)體系14. 9μ L dd H20，2 μ LlO X iTaq 緩沖液，1. 5 μ LdNTPs，0. 5 μ LMg2+， 0· 5 μ LPrimer (71F1)，0· 5 μ L Primer (71R1)，0. 1 μ L 質(zhì)粒 pBS-T-tenecin 3 模板。PCR 反應(yīng)條件94°C預變性 lmin，94°C變性 lmin，56°C退火 lmin，72°C延伸 40s，30 個循環(huán)。最后72°C溫育lOmin。M是標準核酸分子量Marker DL2000 ；泳道1是大約237bp 大小的突變的黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因TmAMP;3m。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行PCR產(chǎn)物膠回收，按預先設(shè)計好的酶切位點，用Bam H I和Β ο I雙酶切回收的PCR產(chǎn)物TmAMPan和表達載體pET30a，在一微量離心管中分別
依次加入下列試劑
IOxKBuffer
TmAMP 3m55pL
BamHl Xho I
雙蒸水70|aL
總體系150μ 輕彈管壁，混勻并離心，37°C酶切6小時。采用TIANGEN生物公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒，對雙酶切的TmAMPlm，pET30a進行
回收，然后進行連接反應(yīng)；在一個微量離心管中依次加入下列試劑
IOx連接緩沖液TmAMP 3mpET30aT4DNA連接酶lμL雙蒸水總體積IOpL16°C，過夜連接。次日，取出連接產(chǎn)物，與35 μ L感受態(tài)細胞E. coli DH5 α混勻，冰浴30min，然后42°C水浴熱休克45s，迅速取出冰浴;3min (不要搖動EP管)。在每管中加入800 μ L不含抗生素的新鮮LB培養(yǎng)液，混勻，37°C溫和振蕩培養(yǎng)lh。4°C，4000rpm,離心lmin，吸棄600 μ L 上清，輕輕吹打混勻剩余菌液，在準備好的固體LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)上均勻的涂布， 37 °C過夜培養(yǎng)。將過夜長出的陽性克隆挑取到5mLLB培養(yǎng)基(含卡那霉素)中培養(yǎng)12_1他。菌液 PCR方法鑒定重組質(zhì)粒正確。按照堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。將提取的質(zhì)粒pET30a-TmAMP;3m與35yL感受態(tài)細胞E. coli BL21混勻，冰浴 30min,然后42°C水浴熱休克45s，迅速取出冰浴3min。在每管中加入800 μ L不含抗生素的新鮮LB培養(yǎng)液，混勻，37°C溫和振蕩培養(yǎng)lh。4°C，4000rpm，離心lmin，吸棄600 μ L上清， 輕輕吹打混勻剩余菌液，在準備好的固體LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)上均勻的涂布，37°C過夜培養(yǎng)。次日，挑取單克隆至5mLLB培養(yǎng)基(含卡那霉素)中培養(yǎng)12-1 ，再按 2% 的體積比轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基(含Kana)中，37°C，220rpm震蕩培養(yǎng)菌液至0D600為0. 4 0. 6，吸取ImL菌液于干凈EP管中，作為誘導前對照樣品。然后，往剩余菌液中加入IPTG至終濃度0. 8M，于37°C誘導4h。4°C，IOOOOrpm,離心2min，收集菌體。冰浴進行超聲波破碎細胞(工作5s,間歇5s, 300w)，4°C，12000rpm,離心IOmin,取上清和沉淀作SDS-PAGE (12% 的分離膠)檢測。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果見圖4。M是標準蛋白質(zhì)分子量marker ；泳道1 是沒有誘導的大腸桿菌(含有質(zhì)粒pET30a-TmAMP3m)；泳道2是0. 5mM IPTG誘導的大腸桿菌(含有質(zhì)粒pET30a-TmAMP3m)表達產(chǎn)物；泳道3是誘導后的上清；泳道4是誘導后的沉淀，表明黃粉蟲抗菌肽已高效表達，且大部分是可溶的。(4)融合蛋白的親和純化將含重組突變的黃粉蟲抗菌肽基因載體的陽性克隆在37°C培養(yǎng)過夜，再以比例接種，37°C培養(yǎng)2 3h，當菌液的吸光度(A_)值達到0. 5-0. 7時，加入IPTG至終濃度 0. 5 1M,于37°C誘導4h。IOOOOrpm離心5min,收集沉淀。將所收集的沉淀溶于5OmM NaH2PO4, 3OOmM NaCl, 5mM imidazole，pH8· 0 緩沖液后，4°C下進行超聲破菌，超聲波超聲破菌條件400W，每kec間隔kec共50次。4°C， 12000rpm, 20min,離心后收集上清，0. 45 μ m濾膜過濾備用。親和層析將超聲破菌后獲得的上清，在4°C下通過裝有預處理的Ni-NTA瓊脂糖介質(zhì)柱中，使其自然通過層析柱。用洗雜液洗滌雜蛋白，洗雜液成分50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,20mM imidazole,pH 8· 0。使用含有 500mM 的咪唑緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 500mM imidazole, pH 8. 0)洗脫抗菌肽。凝膠過濾層析將親和層析所獲得的抗菌肽上樣于Superdex 75凝膠過濾柱，凝膠過濾柱長300mm，直徑10mm，用IO-IOOmM Na2HPO4-NaH2PO4, pH6. 0-9. 0緩沖液進行洗脫， 收集活性峰。將凝膠過濾層析所獲得的樣品上樣于IOkD濃縮超濾管中，4°C，3200rpm離心 30min,獲得重組突變的黃粉蟲抗菌肽。本發(fā)明也提供了上述純化工藝所獲得的重組突變黃粉蟲抗菌肽相關(guān)的生物學特性。具體為，抗菌肽是一小分子肽，具有熱穩(wěn)定性，耐酸、堿特性，耐高鹽特性、能殺耐藥菌、 抗菌譜廣。本發(fā)明提供的重組突變的黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii可在制備治療病原微生物感染的抗菌藥物中具有廣泛的應(yīng)用。由于本發(fā)明提供的重組突變的黃粉蟲抗菌肽具有廣譜抗菌的功能，對所有微生物包括大腸桿菌、氨芐青霉素抗性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、谷氨酸棒桿菌、蘇云金桿菌、葡萄球菌、桿狀菌、棒狀桿菌等微生物具有顯著的抑制作用。通過實施本發(fā)明具體的發(fā)明內(nèi)容，可以達到以下技術(shù)效果1.本發(fā)明提供了一種突變黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii在大腸桿菌中高效表達，并且在 PH 2-12的環(huán)境中，在沸水中煮沸10h，重組黃粉蟲抗菌肽的抗菌活力保持不變，說明其具有很強的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性，驗證了重組黃粉蟲抗菌肽能夠在大腸桿菌中高效表達，而且強穩(wěn)定性使得黃粉蟲抗菌肽在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中不易失活，為大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵提供了保障。2.本發(fā)明采用基因工程手段，直接擴增不含信號肽的成熟肽序列構(gòu)建至表達載體，高效表達抗菌肽，并獲得了可溶性的抗菌肽，表達的融合蛋白存在于上清中，這就避免了處理包涵體蛋白的復雜步驟，降低了成本，更重要的是消除了在處理包涵體過程中抗菌肽生物活性喪失的危險。3.現(xiàn)有技術(shù)表明，抗菌肽通常有選擇性抑殺活性，產(chǎn)生的抗菌肽可以使原核表達菌株產(chǎn)生“自殺現(xiàn)象”，用原核表達系統(tǒng)誘導表達抗菌肽，測定的生長曲線顯示誘導表達的抗菌肽對宿主菌產(chǎn)生一定的毒害作用。因此，抗菌肽的抑菌活性也成為采用原核表達系統(tǒng)表達抗菌肽所面臨的瓶頸。但是，本發(fā)明對抗菌肽進行抑菌活性檢測發(fā)現(xiàn)，含有抗菌肽基因的宿主菌經(jīng)誘導后只是菌體生長受到抑制，但是誘導表達的抗菌肽并沒有對宿主菌產(chǎn)生毒害作用，這就為抗菌肽的大規(guī)模發(fā)酵奠定了良好基礎(chǔ)。4.利用突變黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii的熱穩(wěn)定性，本發(fā)明將表達的蛋白煮沸l(wèi)Omin， 離心除去很多不耐熱的雜蛋白，然后再上親和柱純化，提高了純化效率，步驟簡單，獲得的目的蛋白比較純，大大降低了純化成本。5.本發(fā)明提供的一種重組突變的黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii具有廣譜抗菌的功能，對微生物具有顯著的抑制作用，所有微生物包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、谷氨酸棒桿菌、 蘇云金桿菌、葡萄球菌、桿狀菌、棒狀桿菌等。重組突變的黃粉蟲抗菌肽在制備治療病原微生物感染(包括耐藥菌)的抗菌藥物、飼料添加劑、保鮮劑等方面中具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖1所示為RT-PCR擴增TmAMP3m圖，圖中，M為DNA標準分子量DL2000) ；C為對照 Control ；1,2 為引物 TF1，TRl 擴增 TmAMP3m。圖2所示為pBS-T-TmAMP;3m的雙酶切鑒定圖，圖中，M為DNA標準分子量DL2000 ； 1為BamH I和Hind III雙酶切鑒定。圖3所示為菌液PCR鑒定重組質(zhì)粒圖，圖中，M為DNA標準分子量DL2000 ；C為對照Control ；1為菌液為模板擴增TmAMP;3m。圖4所示為融合蛋白的SDS-PAGE檢測圖，圖中，M為蛋白分子量標準；1為未誘導含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；2為誘導含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；3為超聲破碎細胞后的上清；4為超聲破碎細胞后的沉淀；5為純化后的融合蛋白。圖5所示為抑菌活性檢測圖。圖6所示為酸堿穩(wěn)定性檢測圖。圖7所示為熱穩(wěn)定性檢測圖，圖中，C為對照PBS Control ;1_13為融合蛋白在Oh、10min、30min、lh、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h 不同時間中煮沸。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料和設(shè)備有主要原輔材料黃粉蟲購自于花卉市場，金黃色葡萄球菌(Maphylococcus aureus)為實驗室保存。4齡黃粉蟲注射5 μ 1金黃色葡萄球菌誘導IMi后用于總RNA提取。主要試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自TaKaRa公司；TRIzol 試劑購自lrwitrogen公司；Taq酶，pBS-T克隆載體，質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；感受態(tài)細胞DH5ci和BL21為北京全式金產(chǎn)品；His標簽純化樹脂(Ni-NTA Resin)購自QIAGEN公司。其余常用試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。主要儀器PCR儀、高壓滅菌鍋、氣浴恒溫振蕩器、電子天平、微波爐、超純水儀、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、熱空氣消毒柜、臺式冷凍離心機、電泳儀、凝膠成像儀等。本發(fā)明中選用的所有原輔材料、試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知的，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。實施例一重組突變的黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii在大腸桿菌中的高效表達參見附圖1-4 (1)利用GenBank公布的黃粉蟲(Tenebrio moIitor)抗菌肽序列(登錄號為 TMU21482)設(shè)計特異引物上游引物TF1:5' -ATGAAAACATTCGTGATTTGCTTGATTCTGG-3'，下游引物TR1:5' -TTAATGA CCATGTGTCTTGTACCCTCCTTGG-3‘；(2)以RT-PCR法從黃粉蟲體內(nèi)克隆了抗菌肽基因teneCin3操作前實驗臺用紫外燈照射30min后，取一條大約5齡的黃粉蟲幼蟲，放入無RNA 酶的研缽中液氮研磨，粉末移入裝有ImLTrizol試劑的Eppendorf管中，蓋緊蓋激烈震蕩 15s，15 30°C室溫放置3 5min，4°C、12000r/min離心15min，小心的將上清移入干凈 Eppendorf管中，加入氯仿0. 22mL抽提蛋白質(zhì)，震蕩15s，15 30°C室溫放置3 5min， 4°C、12000rpm離心lOmin，溶液分成上、中、下三層，其中無色上層即為含RNA層。將此層移入潔凈的1. 5mL的Eppendorf管中，加入異丙醇0. 5mL, 15 30°C室溫放置10min，4°C、 12000rpm離心lOmin。棄上清，沉淀部分加入75%乙醇溶液(無RNA酶水配置)lmL，洗滌， 4°C,7500r/min離心5min。棄上清，待沉淀干燥后，加入無RNA酶水，輕輕混勻，使其充分溶解，A260/A280鑒定RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余_70°C保存。 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。EP管中配制下列模板RNA/弓丨物混合液10yL總RNA，IOyL Oligo dT-Adaptor引物，31. 5 μ L無RNase的水，70°C保溫IOmin后迅速在冰上急冷^iiin 以上。離心數(shù)秒使模板RNA/引物的變性液聚集于管底。再加入51. 5μ L上述RNA/引物變性溶液，20μ L5XM-MLV 緩沖液，20μ LdNTP，2. 5μ L RNase 抑制劑，6 μ LRNase M-MLV (RNase H-)。42°C保溫lh，70°C保溫IOmin后，迅速在冰上急冷^iin以上。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，最后以合成的cDNA為模板進行PCR擴增抗菌肽基因。反應(yīng)條件為95°C預變性lmin， 95°C變性Imin，55°C退火Imin，72°C延伸40s，30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin，4°C保存。取 5 μ LPCR擴增產(chǎn)物加6 X Loading Buffer,在1 %瓊脂糖凝膠進行電泳。采用TIANGEN生物公司的回收試劑盒，回收PCR產(chǎn)物，連接T載體，測序分析結(jié)果證明我們獲得了與teneCin3 相比，在219位的堿基由G變?yōu)锳、約237bp大小的基因片段序列。(3)突變的黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因的PCR擴增上游引物71F1:5' -CGCGGATCCGCTCCTGA CCATCACGACGGACATC-3 ‘，下劃線部分為BamH I酶切位點；下游引物71R1:5' -CCG CTCGAGTTAATGACCATGTGTCTTGTACCC-3 ‘，下劃線部分為 Xho I酶切位點，PCR 反應(yīng)體系14. 9μ L dd H2O, 2 μ LlO X iTaq 緩沖液，1. 5 μ LdNTPs，0. 5 μ LMg2+， 0· 5 μ L Primer (71F1)，0· 5 μ LPrimer (71R1)，0. 1 μ L 質(zhì)粒 pBS-T_TmAMP3 模板。PCR 反應(yīng)條件95°C預變性 lmin，95°C變性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 40s，30 個循環(huán)。最后72°C溫育lOmin。(4)原核表達載體的構(gòu)建用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自TIANGEN生物公司)進行PCR產(chǎn)物膠回收，按預先設(shè)計好的酶切位點，用Bam H I和Bio I雙酶切回收的PCR產(chǎn)物TmAMP;3m和表達載體 pET30a，在一微量離心管中分別依次加入下列試劑
IOxKBuffer TmAMP3m BamHi Xhol
雙蒸水總體系輕彈管壁，混勻并離心，37°C酶切6小時。采用TIANGEN生物公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒，對雙酶切的TmAMPlm，pET30a進行
回收，然后進行連接反應(yīng)；在一個微量離心管中依次加入下列試劑
IOx連接緩沖液lμLTmAMP 3mpET30a0.5μΕT4DNA連接酶雙蒸水總體積IOpL
10
55μ
16°C，過夜連接。次日，取出連接產(chǎn)物，與35yL感受態(tài)細胞E. coliDH5a混勻，冰浴30min，然后 42°C水浴熱休克45s，迅速取出冰浴;3min (不要搖動EP管)。在每管中加入800 μ L不含抗生素的新鮮LB培養(yǎng)液，混勻，37°C溫和振蕩培養(yǎng)lh。4°C，3000rpm,離心lmin，吸棄600 μ L 上清，輕輕吹打混勻剩余菌液，在準備好的固體LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)上均勻的涂布， 37 °C過夜培養(yǎng)。將過夜長出的陽性克隆挑取到6mLLB培養(yǎng)基(含卡那霉素)中培養(yǎng)12_1他。菌液 PCR方法鑒定重組質(zhì)粒正確。按照堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。獲得的重組突變黃粉蟲抗菌肽編碼79個氨基酸，富含甘氨酸、谷氨酰胺和組氨酸。其DNA堿基序列GGAGGCCATCAGGGCGGACATCTGGGTGGTCACCAAACCGGT
CACCAAGGCGGCCAACAGGGTGGTCATCTGGGGGGTCAACAG
GGTGGACACCTAGGGGGTCACCAGGGCGGCCAACCAGGCGGA
CATTTAGGAGGCCATCAGGGCGGAATCGGAGGCACCGGAGGA
CAGCAACACGGGCAGCATGGACCTGGGACCGGTGCAGGACAC
CAAGGAGGGTACAAGACACATGGTCAT其氨基酸序列GGHQGGHLGG HQTGHQGGQQ GGHLGGQQGG HLGGHQGGQPGGHLGGHQGG IGGTGGQQHG QHGPGTGAGH QGGYKTHGH實施例二 重組質(zhì)粒pET30a-TmAMP;3m的原核表達將提取的質(zhì)粒DNA DH5 α /pET30a-TmAMP3m 與 35 μ L 感受態(tài)細胞 E. coliBL21 混勻，冰浴30min，然后42°C水浴熱休克45s，迅速取出冰浴3min(不要搖動EP管)。在每管中加入800 μ L不含抗生素的新鮮LB培養(yǎng)液，混勻，37°C溫和振蕩培養(yǎng)lh。4°C，3000rpm,離心lmin，吸棄600 μ L上清，輕輕吹打混勻剩余菌液，在準備好的固體LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)上均勻的涂布，37°C過夜培養(yǎng)。次日，挑取單克隆至6mLLB培養(yǎng)基(含卡那霉素)中培養(yǎng)12-1^1，再按1 % 2 %的體積比轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基(含Kana)中，37°C，220r/min震蕩培養(yǎng)菌液至0D600為0. 4 0. 6，吸取ImL菌液于干凈EP管中，作為誘導前對照樣品。然后， 往剩余菌液中加入IPTG至終濃度0. 8M，于37°C誘導4h。4°C，10000r/min,離心2min，收集菌體。冰浴進行超聲波破碎細胞(工作k，間歇k，300w)，4°C，12000r/min,離心lOmin，取上清和沉淀作SDS-PAGE (12%的分離膠)檢測。實施例三重組突變的黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii的抗菌活性檢測方法首先取出通過表達獲得的抗菌肽3 μ 1。以金黃色葡萄球菌為實驗菌種，在LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D600 = 0. 5，參照瓊脂孔穴擴散法，取10μ 1菌懸液與3ml固體培養(yǎng)基 (含0.8%瓊脂)在45°C混勻，并鋪在直徑6cm無菌培養(yǎng)皿中，待凝固后于4°C保存?zhèn)溆?；使用時，在平皿中打直徑為2mm的若干小孔，并在孔中分別滴入3 μ 1待測產(chǎn)物，37°C條件下培養(yǎng)12-1他。測量抑菌圈大小。根據(jù)抑菌圈的大小判定抗菌肽的活性，參見附圖7。實施例四重組突變的黃粉蟲抗菌肽TmAMPaiI的高效表達及純化將含重組突變的黃粉蟲抗菌肽基因載體的陽性克隆在37°C培養(yǎng)過夜，再以比例接種，37°c培養(yǎng)2 3h，當菌液的吸光度(A_)值達到0. 5-0. 7時，加入IPTG至終濃度 0. 5 1M,于37°C誘導4h。IOOOOrpm離心5min,收集沉淀。將所收集的沉淀溶于50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,5mM imidazole，pH8. 0 緩沖液后，4°C下進行超聲破菌，超聲波超聲破菌條件400W，每kec間隔kec共50次。4°C， 12000rpm, 20min,離心后收集上清，0. 45 μ m濾膜過濾備用。親和層析將超聲破菌后獲得的上清，在4°C下通過裝有預處理的Ni-NTA瓊脂糖介質(zhì)柱中，使其自然通過層析柱。用洗雜液洗滌雜蛋白，洗雜液成分50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,20mM imidazole,pH 8· 0。使用含有 500mM 的咪唑緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 500mM imidazole, pH 8. 0)洗脫抗菌肽。凝膠過濾層析將親和層析所獲得的抗菌肽上樣于Superdex 75凝膠過濾柱，凝膠過濾柱長300mm，直徑10mm，用IO-IOOmM Na2HPO4-NaH2PO4, pH6. 0-9. 0緩沖液進行洗脫， 收集活性峰。將凝膠過濾層析所獲得的樣品上樣于IOkD濃縮超濾管中，4°C，3300rpm離心 30min，獲得重組突變的黃粉蟲抗菌肽，參見附圖4。實施例五重組突變的黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii的抑菌作用抗菌肽通常有選擇性抑殺活性，產(chǎn)生的抗菌肽可以使原核表達菌株產(chǎn)生“自殺現(xiàn)象”，用原核表達系統(tǒng)誘導表達抗菌肽，測定的生長曲線顯示誘導表達的抗菌肽對宿主菌產(chǎn)生一定的毒害作用。因此，抗菌肽的抑菌活性也成為采用原核表達系統(tǒng)表達抗菌肽所面臨的瓶頸。本發(fā)明將含有pET30a-TmAMPaii質(zhì)粒的大腸桿菌BL21及BL21空白菌接種LB， 37°C震蕩培養(yǎng)2h，加IPTG誘導，每隔0. 5h取菌液測其OD值并記錄數(shù)據(jù)，并設(shè)未誘導的含 pET-30a-TmAMP;3m質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌為對照。對抗菌肽進行抑菌活性檢測發(fā)現(xiàn)含有抗菌肽基因的宿主菌經(jīng)誘導后只是菌體生長受到抑制，但是誘導表達的抗菌肽并沒有對宿主菌產(chǎn)生毒害作用，這就為抗菌肽的大規(guī)模發(fā)酵奠定了良好基礎(chǔ)，參見附圖5。實施例六重組突變的黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii的抗菌活性檢測參照實施例三的抗菌活性檢測方法檢測重組突變的黃粉蟲抗菌肽的抗菌活性，本發(fā)明提供的一種重組突變的黃粉蟲抗菌肽具有廣譜抗菌的功能，對微生物具有顯著的抑制作用，所有微生物包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、谷氨酸棒桿菌、蘇云金桿菌、葡萄球菌、 桿狀菌、棒狀桿菌等。重組突變的黃粉蟲抗菌肽在制備治療病原微生物感染(包括耐藥菌) 的抗菌藥物、飼料添加劑、保鮮劑等方面中具有廣泛的應(yīng)用前景。實施例七重組突變的黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii的酸堿穩(wěn)定性將融合蛋白與？!1分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12緩沖液混合，靜置101^11后， 40C，12000r/min,離心lOmin，收集上清，進行抗菌活性檢測。參照實施例三的抗菌活性檢測方法進行抗菌活性檢測。本發(fā)明實現(xiàn)了突變黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii在大腸桿菌中高效表達，并且在pH 2-12的環(huán)境中，重組黃粉蟲抗菌肽的抗菌活力保持不變，說明其具有很強的酸堿穩(wěn)定性，驗證了重組黃粉蟲抗菌肽能夠在大腸桿菌中高效表達，而且強穩(wěn)定性使得黃粉蟲抗菌肽在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中不易失活，為大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵提供了保障，參見附圖6。實施例八重組突變的黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii的熱穩(wěn)定性將重組突變的黃粉蟲抗菌肽置于100°C沸水浴中，分別于lhdhdhdhjhjh， 7h，8h，9h，IOh取樣15 μ L，4°C，12000r/min,離心IOmin,收集上清，參照實施例三的抗菌活性檢測方法進行抗菌活性檢測。 本發(fā)明實現(xiàn)了突變黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii在大腸桿菌中高效表達，并且在沸水中煮沸10h，重組黃粉蟲抗菌肽的抗菌活力保持不變，說明其具有很強的熱穩(wěn)定性，驗證了重組黃粉蟲抗菌肽能夠在大腸桿菌中高效表達，而且強穩(wěn)定性使得黃粉蟲抗菌肽在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中不易失活，為大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵提供了保障，參見附圖7。
權(quán)利要求
1.一種突變的黃粉蟲抗菌肽TmAMP3m，其特征在于，所述的突變的黃粉蟲抗菌肽具有如序列表SEQ ID NO. 1所示的堿基序列，全長為237bp，其編碼由序列表中序列表SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中79個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，所述的重組黃粉蟲抗菌肽富含甘氨酸、谷氨酰胺和組氨酸。
2.一種如權(quán)利要求1所述的突變的黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii的獲得方法，其特征在于，具體包括如下步驟(1)利用GenBank公布的黃粉蟲(TenebriomoIitor)抗菌肽tenecin3序列設(shè)計特異引物；以RT-PCR法從黃粉蟲體內(nèi)克隆了抗菌肽的cDNA分子，序列分析表明，與tenecin3相比在219位的堿基由G變?yōu)锳 ；(2)設(shè)計特異性突變引物用于擴增其成熟肽部分核酸序列，以利其高抗菌活性的發(fā)揮， 將成熟肽部分N端的一個脯氨酸、一個組氨酸和兩個天冬氨酸突變成三個甘氨酸和一個谷氨酰胺；從而獲得本發(fā)明用于原核細胞高效表達的抗菌肽基因237bp，命名為TmAMPaii ；(3)將TmAMPan亞克隆至pET_30a表達載體中，得到重組質(zhì)粒pET30a_TmAMP;3m；轉(zhuǎn)化到 E. coli BL21中表達融合蛋白；通過SDS-PAGE檢測證明黃粉蟲抗菌肽基因TmAMPaii得到了可溶性高效表達；(4)超聲波破碎細胞后，經(jīng)Ni2+親和層析純化，獲得TmAMP;3m。
3.如權(quán)利要求1所述的重組突變的黃粉蟲抗菌肽TmAMPaii在制備治療病原微生物感染的抗菌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開黃粉蟲抗菌肽TmAMP3m及其在大腸桿菌中高效表達的方法。利用GenBank公布的黃粉蟲抗菌肽序列設(shè)計特異引物，以RT-PCR法從黃粉蟲體內(nèi)克隆了抗菌肽基因，并將其突變成TmAMP3m，將基因TmAMP3m亞克隆至pET-30a表達載體中，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中表達融合蛋白，經(jīng)Ni2+柱親和層析純化融合蛋白，獲得TmAMP3m。TmAMP3m具有廣譜抑菌活性、能殺耐藥菌、熱穩(wěn)定性強、耐強酸強堿。本發(fā)明為實現(xiàn)抗菌活性高、穩(wěn)定性強，使得抗菌肽在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中不易失活，為大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵提供了保障，具有廣泛的應(yīng)用價值。
文檔編號C12R1/19GK102241756SQ201110100200
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月21日
發(fā)明者劉忠淵, 唐馨, 張富春 申請人:新疆大學