專利名稱：一種檢測(cè)魚類致病菌的試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)魚類致病菌的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鮰愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)于1979年首次作為斑點(diǎn)叉尾鮰 (Ictalurus punctatus)養(yǎng)殖的一種新的致病菌被報(bào)道，近年從斑點(diǎn)叉尾鮰病魚診斷分離得到的細(xì)菌85%是鮰愛德華氏菌。檢測(cè)鮰愛德華氏菌的傳統(tǒng)方法是細(xì)菌的常規(guī)分離鑒定，但所需時(shí)間長(zhǎng)，程序繁瑣，準(zhǔn)確度較低。近年來，用PCR檢測(cè)診斷的疾病的方法正在興起。梁萬(wàn)文，“斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥PCR診斷方法的建立”，大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007年8月第22卷第4期公開了一種用PCR方法檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥的方法，但該方法的檢測(cè)靶標(biāo)是一種有待驗(yàn)證的基因 (Edwardsiella ictaluri putative protein, eip)，其是否為致病性基因也有待進(jìn)一步探討，不具有代表性，且該文獻(xiàn)檢測(cè)對(duì)象為廣西研究所魚病研究室從叉尾鮰上分離鑒定并保存的，不是標(biāo)準(zhǔn)菌株，不能說明該文獻(xiàn)的方法能準(zhǔn)確檢測(cè)鮰愛德華氏菌。亟需尋找一種能準(zhǔn)確檢測(cè)鮰愛德華氏菌的方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的試劑盒。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)魚類致病菌的試劑盒，所述的試劑盒包含核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 2所示的引物，用以擴(kuò)增鮰愛德華氏菌的基因。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)魚類致病菌的方法，它包括如下步驟(1)提取待檢樣本的基因組DNA ；(2)以前述基因組DNA為模板，用SEQ ID NO. 1 2所示的引物擴(kuò)增；(3)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。所述步驟(1)中待檢樣本為魚體或者養(yǎng)殖水體。所述魚體為肌肉、肝臟、鰓或者脾臟。本發(fā)明最后提供了 SEQ ID NO. 1 2所示的核苷酸序列在擴(kuò)增或者檢測(cè)來自鮰愛德華氏菌的基因的用途。本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，可以快速準(zhǔn)確地判斷魚體或者水體是否被鮰愛德華氏菌污染，為斑點(diǎn)叉尾鮰的養(yǎng)殖提供保障。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1鮰愛德華氏菌常規(guī)PCR引物驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1 :DNA ；2 單菌落；3 空白對(duì)照； M =DNA maker I，該maker有6條條帶，從上至下分子量依次為600bp、500bp、400bp、300bp、 200bp 和 IOObp。圖2鮰愛德華氏菌PCR檢測(cè)體系的特異性檢測(cè)結(jié)果。1 空白對(duì)照；2:熒光假單胞菌；3 河水弧菌；4 嗜水氣單胞菌；5 豚鼠氣單胞菌；6 溫和氣單胞菌；7 柱狀黃桿菌；8 鮰愛德華氏菌；M =DNA marker I。圖3鮰愛德華氏菌PCR檢測(cè)體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果。1-8 梯度稀釋的DNA模板， 濃度依次為 25ng/ μ L-2. 5fg/ μ L ；9 空白對(duì)照；M =DNA maker I。圖4鮰愛德華氏菌PCR檢測(cè)體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果。1-8:梯度稀釋的菌液，濃度依次為 0. 28X 108cfu/mL-0. 28X IO1CfuAiL ；9 空白對(duì)照；M =DNAmaker I。圖5斑點(diǎn)叉尾鮰病原檢測(cè)結(jié)果。M =DNA maker I ；1 肌肉組織；2 肌肉組織；3 肝組織；4 肌肉組織；5 肌肉組織；6 肌肉組織；7 肌肉組織；8 肌肉組織；9 肌肉組織；10 空白對(duì)照；11 魚鰓；12 魚鰓；13 脾；14 血液；15 陽(yáng)性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)菌株柱狀黃桿菌、溫和氣單胞菌、河弧菌、熒光假單胞菌、豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，鮰愛德華氏菌ATCC33202，購(gòu)自ATCC。試齊[J:5U/yL Taq DNA polymerase (Promega，含 IOXreaction buffer 禾口 25mM Mg2+) UOmM dNTPs (Promega) > DNA marker I (Tiangen) ；Sterile Millipore H20(自 ； 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen)。實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)1、引物設(shè)計(jì)從GenBank上查找愛德華氏菌phosphoserine transaminase的保守基因序列， 根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)引物。其中，根據(jù)鮰愛德華氏菌serC的編碼基因序列(基因序列號(hào)為 AFl 10153. 1，為致病基因)，設(shè)計(jì)的一對(duì)引物為Ei IF(5-CATGATAATACCCGGTGTTGG-3)EilR(5-GTATTGCTGGGGAACAACTC-3)，如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示，其預(yù)期擴(kuò)增片段的大小為124bp。引物由上海生工生物服務(wù)有限公司合成。2、引物驗(yàn)證(1)模板制備活化和制備鮰愛德華氏菌ATCC 33202的菌懸液，并提取基因組 DNA。DNA采用Tiangen的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取。(2)擴(kuò)增用上述設(shè)計(jì)的引物對(duì)在Bio-Rad Mycycler梯度擴(kuò)增儀上擴(kuò)增；20 μ L的PCR反應(yīng)體系(終濃度)
4反應(yīng)緩沖液Ix
上游引物及下游引物0.3μΜ
Mg2+2mM
TaqDNA 聚合酶1.25U
dNTP0.2 mM 模板PCR程序?yàn)?5°C預(yù)變性 ^iin ；94°C變性 15s，56°C退火 10s，72°C延伸 15s，38 個(gè)循環(huán)；72°C保溫5min后在4°C條件下終止反應(yīng)。(3)檢測(cè)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。3、結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，泳道1和2擴(kuò)增得到了預(yù)期的基因片段，而空白對(duì)照僅有模糊且分子量較小的條帶，其為引物二聚體條帶，無預(yù)期的基因片段，說明將本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物用于擴(kuò)增鮰愛德華氏菌基因組中的基因片段是有效的。實(shí)施例2PCR檢測(cè)體系的特異性和靈敏度檢測(cè)1、實(shí)驗(yàn)方法(1)模板制備以柱狀黃桿菌、溫和氣單胞菌、河弧菌、熒光假單胞菌、豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌，鮰愛德華氏菌的基因組DNA為模板測(cè)定方法的特異性；用梯度稀釋的鮰愛德華氏菌的菌液(濃度范圍為0. 28X 108cfu/mL-0. 28 X lO^fu/mL)及梯度濃度的基因組 DNA (濃度范圍從25ng/ μ L 2. 5fg/ μ L)為模板測(cè)定方法的靈敏度。DNA采用Tiangen提供的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取。(2)擴(kuò)增用實(shí)施例1設(shè)計(jì)的引物對(duì)在Bio-Rad Mycycler梯度擴(kuò)增儀上擴(kuò)增；20 μ L的PCR反應(yīng)體系(終濃度)
反應(yīng)緩沖液Ix
上游引物及下游引物 0.3μΜ
Mg2+2mM
TaqDNA 聚合酶1.25U
dNTP0.2 mM
模板PCR程序?yàn)?5°C預(yù)變性 ^iin ；94°C變性 15s，56°C退火 10s，72°C延伸 15s，38 個(gè)循環(huán)；72°C保溫5min后在4°C條件下終止反應(yīng)。(3)檢測(cè)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，柱狀黃桿菌、溫和氣單胞菌、河弧菌、熒光假單胞菌、豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等幾種常見的非靶標(biāo)魚類致病菌均無靶標(biāo)擴(kuò)增條帶，僅有模糊且分子量較小的條帶，其為引物二聚體條帶，檢測(cè)結(jié)果呈陰性，鮰愛德華氏菌有靶標(biāo)擴(kuò)增條帶，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，說明本發(fā)明提供的引物具有良好的特異性。敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 4所示，所建立的PCR體系對(duì)于鮰愛德華氏菌基因組DNA的檢測(cè)下限為25pg/y L，即對(duì)于鮰愛德華氏菌菌液的檢測(cè)下限為0. ^X 105cfu/mL，靈敏度極好。實(shí)驗(yàn)說明，根據(jù)鮰愛德華氏菌serC的編碼基因序列設(shè)計(jì)的如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的引物特異性和靈敏度均較好，可用于鮰愛德華氏菌的檢測(cè)。實(shí)施例3試劑盒的組成及使用方法1、試劑盒的組成(1)、PCR反應(yīng)液(10 μ L/次)緩沖液，核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示的引物，Mg2+，dNTPs ；(2)、Taq 酶(0. 25 μ L/ 次)；(3)、6%吐6161_100(0嫩提取液，20(^17次)；0)、滅菌超純水。2、使用方法(1)提取待檢樣本的基因組DNA ；(2)以提取待檢樣本的基因組DNA為模板，用前述試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增20 μ L的PCR反應(yīng)體系(終濃度)
反應(yīng)緩沖液Ix
上游引物及下游引物 0.3μΜ Mg2+2mM
Taq DNA polymerase 1.25U dNTP0.2mM
模板2汕PCR程序?yàn)?5°C預(yù)變性 ^iin ；94°C變性 15s，56°C退火 10s，72°C延伸 15s，38 個(gè)循環(huán)；72°C保溫5min后在4°C條件下終止反應(yīng)。(3) 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例4斑點(diǎn)叉尾鮰病魚的檢測(cè)1、提取患病魚體組織的DNA從養(yǎng)殖魚池現(xiàn)場(chǎng)采集患病的斑點(diǎn)叉尾鮰(Ietalurus Punetaus)病魚樣品，病魚的頭部、鰭的基部及尾部出現(xiàn)開口小潰蕩，眼睛突出，鰓片鮮紅，腹部腫脹，體腔內(nèi)有淡黃色的液體，肝臟灰白。各取一小塊組織塊，分別加入200μ1 Millipore H2O,搗爛，取出殘留的組織塊，剩余渾濁液于12，000r/min離心lmin，棄上清，加入200μ 1 Millipore H2O重懸。充分混勻后取50 μ 1加入到200 μ 1 6%的chelex-100中，混勻，56°C保溫20min，劇烈震蕩后于100°C保溫8min，劇烈震蕩，并于12，000r/min離心3min，取上清作為PCR擴(kuò)增的模板。2、檢測(cè)以提取的樣本基因組DNA作為模板，用實(shí)施例3提供的試劑盒和檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。
3、結(jié)果樣品2和樣品8為非潰瘍肌肉組織，樣品1、4_7和9均為潰瘍肌肉組織，肝、腮、脾均出現(xiàn)病變。檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，病魚的潰瘍處肌肉組織(樣品1、4-7和9)、肝(樣品 3)、鰓(樣品11-12)、脾(樣品13)檢測(cè)結(jié)果與陽(yáng)性對(duì)照(樣品15)的結(jié)果一致，均檢測(cè)出鮰愛德華氏菌，非潰瘍肌肉組織(樣品2和樣品8)與空白對(duì)照(樣品10)結(jié)果一致，均沒有檢測(cè)出鮰愛德華氏菌，這與臨床癥狀及解剖檢查結(jié)果相吻合。血液(樣品14)中沒有檢測(cè)到鮰愛德華氏菌，可能與該病魚的病變程度不高有關(guān)。上述實(shí)驗(yàn)表明鮰愛德華氏菌是斑點(diǎn)叉尾鮰的致病菌之一，且本發(fā)明提供的試劑盒可以準(zhǔn)確檢測(cè)出患病魚體中的鮰愛德華氏菌。綜上，實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明提供的試劑盒能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)鮰愛德華氏菌，為有針對(duì)性治療和有效預(yù)防魚病提供了可靠的診斷結(jié)果，為供應(yīng)安全的水產(chǎn)品提供了保證。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)魚類致病菌的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 2所示的引物，用以擴(kuò)增鮰愛德華氏菌的基因。
2.一種檢測(cè)魚類致病菌的方法，其特征在于包括如下步驟(1)提取待檢樣本的基因組DNA；(2)以步驟(1)中的基因組DNA為模板，用SEQID NO. 1 2所示的引物進(jìn)行擴(kuò)增；(3)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中待檢樣本為魚體或者養(yǎng)殖水體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述魚體為肌肉、肝臟、鰓或者脾臟。
5.SEQ ID NO. 1 2所示的核苷酸序列在擴(kuò)增或者檢測(cè)來自鮰愛德華氏菌的基因中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)魚類致病菌的試劑盒，所述的試劑盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物，用以擴(kuò)增鮰愛德華氏菌的基因。還提供了一種魚類致病菌的檢測(cè)方法和SEQ ID NO.1～2所示的引物的用途。本發(fā)明提供的試劑盒可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰致病菌——鮰愛德華氏菌，從而實(shí)現(xiàn)有針對(duì)性地防治檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰腸敗血癥，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102382881SQ20111034382
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者劉天強(qiáng), 劉衍鵬, 李茂 , 黃冠軍 申請(qǐng)人:通威股份有限公司