專利名稱：低甲基化基因f10的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及低甲基化基因FlO在制備腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后預(yù)測試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
表觀遺傳機制如啟動子高/低甲基化、組蛋白修飾或非編碼RNA的表達(dá)在腫瘤的形成過程中發(fā)揮著非常重要的功能。DNA甲基化狀態(tài)的改變時腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要標(biāo)志。具有促瘤功能的基因甲基化水平降低而高表達(dá)，從而促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生，其中包括膠質(zhì)瘤。腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，雖然采取了綜合治療及一些新的治療手段，其預(yù)后仍不理想。一項2010年的統(tǒng)計顯示，在美國75%的膠質(zhì)瘤患者在確診后 5年內(nèi)死亡。而膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤的預(yù)后更差，一項針對320例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人的生存分析顯示總生存時間為12. 3個月，其中91例再次接受手術(shù)的病人總生存時間中位數(shù)為18. 9 個月，而未再次手術(shù)的患者總生存時間中位數(shù)為9. 7個月。因此，迫切需要找尋出診斷膠質(zhì)瘤、判斷預(yù)后的分子標(biāo)志物，為提高膠質(zhì)瘤患者生存率的研究提供依據(jù)。FlO 基因(coagulation factor X)定位于染色體 13q34，GeneBank 登錄號 NM_000504。FlO基因編碼凝血級聯(lián)中維生素K依賴的凝血因子X(FX)。FX蛋白的雙鏈通過二硫鍵結(jié)合，輕鏈攜帶2個EGF樣結(jié)構(gòu)域，重鏈含具有催化功能的結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域與一些有止血功能的絲氨酸蛋白酶在結(jié)構(gòu)上具有同源性。成熟的FX受FDCa剪切而活化(內(nèi)源性凝血通路)，或者通過FVIIa激活(外源性凝血級聯(lián))而成為FXa，繼而激活下游通路參與調(diào)節(jié)凝血功能。目前，有研究者觀察了 Ffe在腫瘤細(xì)胞遷移中的功能。但是對于FlO基因在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及功能尚未見報道。申請人用免疫組織化學(xué)法檢測FlO基因編碼的蛋白 FX在正常腦組織及腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示FX在膠質(zhì)瘤中表達(dá)增加(ρ <0. 05, 圖1)，而各級別膠質(zhì)瘤組織中FX的表達(dá)無差異(ρ > 0. 05)。亞硫酸氫鹽測序PCR(BSP)證實，F(xiàn)lO基因在膠質(zhì)瘤中發(fā)生低甲基化(ρ <0.01)。然后用SPSS 13.0軟件對FX蛋白表達(dá)與FlO基因低甲基化進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明兩者間存在相關(guān)性(ρ <0. 05)，說明表觀遺傳學(xué)可能參與了 FlO基因的表達(dá)調(diào)控。目前用于檢測甲基化狀態(tài)的方法有亞硫酸氫鹽測序PCR法(BSP)、焦磷酸測序、甲基化特異性PCR等，但是利用亞硫酸氫鹽測序PCR法分析所獲得的腫瘤特異性甲基化狀態(tài)， 是甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)，它能明確所測區(qū)域每一個CG位點的甲基化狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種低甲基化基因FlO的應(yīng)用方法，對于腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后預(yù)測具有重要意義。低甲基化基因FlO用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測、檢測或篩查制劑；特別是用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測、檢測或篩查的試劑盒。如用于制備亞硫酸氫鹽直接測序法預(yù)測腦膠質(zhì)瘤的制劑；所述的制劑中包括 根據(jù)FlO基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游CpG島設(shè)計的，采用亞硫酸氫鹽直接測序法的引物序列為F 5' TTTATTTTTATGTATTAGGGGGTGAG 3‘，R 5' TACAAACAATCCTAAATCATCAACC 3‘。一種用于人腦膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測的FlO基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游CpG島甲基化檢測試劑盒，包括以下引物F 5' TTTATTTTTATGTATTAGGGGGTGAG 3‘，R 5' TACAAACAATCCTAAATCATCAACC 3‘。申請人:發(fā)現(xiàn)FlO基因編碼的蛋白FX在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)(圖1)。FlO轉(zhuǎn)錄起始位點上游存在CpG島(圖2)，該CpG島中CG位點在正常的腦組織中均處于高甲基化狀態(tài)，而在FX表達(dá)上調(diào)的腦膠質(zhì)瘤組織中其甲基化程度降低(部分結(jié)果見圖3)。FlO低甲基化的膠質(zhì)瘤病人總生存率明顯低于高甲基化的病人(圖4)，提示FlO基因是膠質(zhì)瘤中的低甲基化基因，是預(yù)測膠質(zhì)瘤預(yù)后的分子標(biāo)志。本發(fā)明為腦膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測提供了強有力的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。


圖IFX蛋白在正常腦組織及不同病理分級膠質(zhì)瘤中的表達(dá)；A 正常腦組織；B 膠質(zhì)瘤WHO I級；C 膠質(zhì)瘤WHO II級；D 膠質(zhì)瘤WHO III級； E 膠質(zhì)瘤WHO IV級；圖2F10基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游_4490bp至_4110bp為一 CpG島；淺藍(lán)色區(qū)域為CpG島，橫坐標(biāo)下紅色豎線表示CG位點；圖!3BSP檢測正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中FlO基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)；圖中所示為部分結(jié)果，N2 第2例正常腦組織；N4 第4例正常腦組織；N6 第6例正常腦組織；Tll 第9例膠質(zhì)瘤組織；T16 第12例膠質(zhì)瘤組織；T23 第23例膠質(zhì)瘤組織。 〇表示非甲基化位點， 表示甲基化位點，每一行表示一個克隆中所有CG位點的甲基化狀態(tài)，計算5個克隆中的非甲基化位點比率進(jìn)行比較。結(jié)果表明，正常腦組織中FlO基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游CpG島為高甲基化狀態(tài)，而膠質(zhì)瘤組織中該區(qū)域發(fā)生低甲基化；圖4F10基因低甲基化與膠質(zhì)瘤病人預(yù)后的關(guān)系。綠色曲線表示FlO基因甲基化的膠質(zhì)瘤病人的生存狀況及時間，藍(lán)色曲線表示 FlO基因低甲基化的膠質(zhì)瘤病人的生存狀況及時間。用SPSS 13.0軟件進(jìn)行Kaplan-Meier 檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P = 0. 00 ，說明FlO基因低甲基化的病人預(yù)后較高甲基化的病人差。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實施例1 Methl primer express軟件和在線軟件Methprimer分析FlO轉(zhuǎn)錄起始位點上游5000bp區(qū)域，結(jié)果顯示在這一區(qū)域存在CpG島，設(shè)計并合成FlO基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游CpG島的甲基化引物，F(xiàn) :5 ‘ TTTATTTTTATGTATTAGGGGGTGAG 3 ‘ , R 5' TACAAACAATCCTAAATCATCAACC 3'。對10例正常腦組織進(jìn)行經(jīng)亞硫酸鹽處理后的基因組測序(BSP)，發(fā)現(xiàn)FlO基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游CpG島在正常的腦組織均處于甲基化狀態(tài)。 同時對不同級別腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本(I級14例，II級48例，III級28例，IV級12例)96 例，進(jìn)行了 FlO基因甲基化狀態(tài)的檢測，發(fā)現(xiàn)82. 3%的腦膠質(zhì)瘤組織中FlO基因發(fā)生低甲基化，與正常腦組織比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)，各級膠質(zhì)瘤的FlO基因甲基化水平?jīng)]有明顯的差異(ρ >0.05)。FlO基因低甲基化的病人預(yù)后較甲基化病人的差，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(？ = 0.00幻。以上研究結(jié)果提示，F(xiàn)lO基因是一個新發(fā)現(xiàn)的腦膠質(zhì)瘤甲基化基因，是一個膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測標(biāo)志。操作步驟(一 )亞硫酸氫鹽修飾樣品gDNA制備選擇已商品化的亞硫酸氫鹽修飾試劑盒。( 二)亞硫酸氫鹽直接測序PCR (BSP)試劑盒的使用內(nèi)容該試劑盒包括用于檢測FlO基因甲基化的PCR引物F 5' TTTATTTTTATGTATTAGGGGGTGAG 3‘，R 5' TACAAACAATCCTAAATCATCAACC 3‘。PCR擴增體系(_20°C保存)。原理利用甲基化引物進(jìn)行PCR擴增FlO基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游CpG島。步驟1取經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后的樣品gDNA 4μ 1(總量約lOOng)，加入含甲基化引物 2 μ 1 的 PCR 擴增體系(5O μ 1)，使用 Takara 公司的 EmeraldAmpTM PCR Master Mix (含 DNA 聚合酶、緩沖液及dNTP混合物)進(jìn)行擴增。PCR擴增體系為
權(quán)利要求
1.低甲基化基因FlO的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因FlO用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測、檢測或篩查制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因FlO用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測、檢測或篩查的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因FlO用于制備亞硫酸氫鹽直接測序法預(yù)測腦膠質(zhì)瘤的制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的制劑中包括根據(jù)FlO基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游CpG島設(shè)計的，采用亞硫酸氫鹽直接測序法的引物序列為F 5' TTTATTTTTATGTATTAGGGGGTGAG 3‘， R 5' TACAAACAATCCTAAATCATCAACC 3‘。
5.一種用于人腦膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測的FlO基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游甲基化檢測試劑盒，其特征在于，包括以下引物F 5' TTTATTTTTATGTATTAGGGGGTGAG 3‘， R 5' TACAAACAATCCTAAATCATCAACC 3‘。
全文摘要
本發(fā)明涉及低甲基化基因F10的應(yīng)用，即用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測、檢測或篩查制劑。特別是用于制備亞硫酸氫鹽直接測序法預(yù)測腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的制劑。通過研究證實F10在膠質(zhì)瘤組織中因發(fā)生低甲基化而高表達(dá)，將檢測F10基因低甲基化應(yīng)用于膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測，為預(yù)測膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后提供強有力的分子生物學(xué)依據(jù)，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。
文檔編號C12Q1/68GK102337346SQ20111034654
公開日2012年2月1日 申請日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月4日
發(fā)明者余志斌, 劉曉萍, 卞艷慧, 唐海林, 李桂源, 武明花, 王澤友 申請人:中南大學(xué)