專利名稱：鑒別發(fā)蟲草的特征性核苷酸序列及其探針和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法檢測中藥材真?zhèn)蔚募夹g(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于鑒別發(fā)蟲草(Ophiocordyc印S crinalis)的特征性核苷酸序列以及核酸分子探針和鑒別發(fā)蟲草的方法。
背景技術(shù)：
發(fā)蟲草(Ophiocordyc印s crinalis)是屬于廣義蟲草屬(Cordyceps s. 1.)的一種蟲生真菌，該屬真菌還包括冬蟲夏草(Ophiocordyc印s sinensis)和蛹蟲草(Cordyceps militaris)。野生冬蟲夏草是中國傳統(tǒng)中藥，具有保肺腎、補精髓、化痰止勞咳的作用，能夠調(diào)節(jié)免疫功能，增強人體抵抗力。目前由于大量的采挖已經(jīng)造成野生資源不足，價格大幅上張。目前，仍然無法實現(xiàn)冬蟲夏草子實體的人工栽培，而其菌絲體培養(yǎng)也需要低溫長期發(fā)酵，成本過高。發(fā)蟲草與冬蟲夏草在親緣關(guān)系上極為接近，與其具有相似的功能，具有開發(fā)為蟲草新產(chǎn)品的價值。因此可以快速而準確的鑒別發(fā)蟲草子實體以及相關(guān)制品真?zhèn)蔚姆椒ê图夹g(shù)對于發(fā)蟲草生產(chǎn)相關(guān)企業(yè)以及相關(guān)檢驗機構(gòu)將具有重要的意義。DNA是生物儲存遺傳信息的物質(zhì)，每個生物物種乃至個體均具有獨特的特征性核苷酸序列，可以作為該生物物種或個體區(qū)別于其他物種或個體的標志。DNA是細胞生物的基本組成部分，作為遺傳信息的載體，具有一定的穩(wěn)定性，不會受表型的影響而改變，是用來鑒別物種、個體的可靠依據(jù)。通過生物信息學(xué)的分析可以找到不同物種或個體的特征性核苷酸序列，利用分子生物學(xué)的手段對該序列進行探測即可快速、準確的對物種或個體進行鑒別。發(fā)明人已申請并獲授權(quán)兩項鑒別尖頭蟲草及蜂頭蟲草的核苷酸特征性序列的專利， 目前未見與發(fā)蟲草相關(guān)的核苷酸特征性序列的專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供來源于發(fā)蟲草(Ophiocordyc印s crinalis)核糖體 rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)以及5.8S rRNA基因，用于鑒別發(fā)蟲草的特征性核苷酸序列，其序列如 SEQ ID NO. 1 所示。本發(fā)明提供的利用分子生物學(xué)手段鑒別發(fā)蟲草的特征性核苷酸序列來源于發(fā)蟲草核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)以及5. 8S rRNA基因(核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)以及5. 8S rRNA基因合并簡稱ITS區(qū))，其序列如SEQ ID NO. 1所示，所在位置以及特征見圖1，該序列包含發(fā)蟲草的ITSl、5. 8S rDNA以及ITS2的序列。該序列可通過實施例1所述的方法獲得，亦可通過人工合成的方法在商業(yè)化的DNA合成儀器上按照發(fā)明人提供的核苷酸序列合成。本發(fā)明以上述發(fā)蟲草的特征性核苷酸序列(如SEQ ID NO. 1所示)為模板而設(shè)計得到全長序列或不少于16個核苷酸組成的寡核苷酸序列，以及在上述全長序列或寡核苷酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)修飾、加工、變化而獲得核苷酸序列，也包括在上述全長序列或寡核苷酸序列的基礎(chǔ)上在5’端添加或改變10個核苷酸以下或改變原有核苷酸序列數(shù)量小于10%以及3’端6個核苷酸改變不足1個核苷酸的核苷酸序列作為發(fā)蟲草鑒定的專一性核苷酸分子探針。上述序列可通過DNA自動合成儀等DNA合成裝置按照設(shè)計好的順序合成而獲得， 并可以通過酶、同位素、生物素、化學(xué)熒光素、熒光劑等方式進行標記。因此本發(fā)明的第二個目的是提供一種針對上述ITS區(qū)的如SEQ ID NO. 1所示的序列的發(fā)蟲草專一性核苷酸分子探針，其特征在于，該發(fā)蟲草專一性核苷酸分子探針包括 Probe I :5，-GACCCAGACCCCGCTGTC-3，(序列如 SEQ ID NO. 2 所示)和 Probe II 5‘ -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3‘(序列如SEQ ID NO. 3所示)。進一步優(yōu)選，所述的發(fā)蟲草專一性核苷酸分子探針還包括 Probe III :5’ -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3，(序列如SEQ ID NO. 4所示)。該序列經(jīng)熒光標記后可作為Taqman探針用以鑒定發(fā)蟲草。Probe I> Probe II, Probe III的具體位置見圖2，這些序列樣適用于上述修飾、加工與變化、添加酶切位點、改變部分核苷酸序列以及標記等操作。本發(fā)明提供的上述發(fā)蟲草專一性核苷酸分子探針Probe I和ftx)be II具有極高的專一性，可以與發(fā)蟲草發(fā)生專一性的反應(yīng)而不與其他種類的蟲草或其他真菌發(fā)生反應(yīng)。 利用上述探針通過PCR的方法或核酸雜交的方法可以快速的對發(fā)蟲草及相關(guān)制品進行檢測。本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于鑒別發(fā)蟲草的試劑盒，其特征在于，包括發(fā)蟲草專一性核苷酸分子探針Probe 1:5’ -GACCCAGACCCCGCTGTC-3，和 Probe 11 5，-CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3，和 PCR 常規(guī)反應(yīng)試劑。所述的用于鑒別發(fā)蟲草的試劑盒，優(yōu)選還含有蟲草屬核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物 CorF :5，-CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3，和 CorR 5’ -TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3’。以此引物對的擴增產(chǎn)物作為陽性對照。所述的用于鑒別發(fā)蟲草的試劑盒，優(yōu)選還含有ftx)be III :5’ -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3’。ftx)be III經(jīng)過熒光標記后，可以作為iTaqman探針，利用熒光定量 PCR儀可實時的檢測樣品中是否存在發(fā)蟲草。本發(fā)明的第四個目的是提供一種用于鑒別發(fā)蟲草的方法，其特征在于，是以發(fā)蟲草專一性核苷酸分子探針Probe 1:5’ -GACCCAGACCCCGCTGTC-3，和 Probe 11 5’ -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3’作為引物，利用PCR的方法或者核酸雜交的方法或熒光定量PCR的方法鑒定發(fā)蟲草。所述的用熒光定量PCR的方法鑒定發(fā)蟲草，優(yōu)選以ftObe III :5’ -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3，標記熒光后，作為 Taqman 探針。所述的PCR的方法鑒定發(fā)蟲草，優(yōu)選以蟲草屬核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用弓I 物 CorF 5' -CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3，(如 SEQ ID N0. 5 所示)禾口 CorR 5，-TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3，(如SEQ ID N0. 6所示)的擴增產(chǎn)物作為陽性對照。熒光定量PCR法采用前面所述的發(fā)蟲草專一性的核酸分子探針ftObe I及ftObe II作為擴增引物，Probe III標記熒光后作為Taqman探針，利用熒光定量PCR儀可實時的檢測樣品中是否存在發(fā)蟲草。具體步驟和過程按照常規(guī)分子生物學(xué)方法進行。核酸分子雜交法采用前面所述的發(fā)蟲草專一性的核酸分子探針，通過核酸分子雜交的方式(例如Southern雜交或點雜交)對發(fā)蟲草及相關(guān)制品進行鑒定。具體步驟和過程按照常規(guī)的分子生物學(xué)方法進行。其中，發(fā)蟲草及相關(guān)制品可以直接進行檢測也可以先進行DNA的提取與擴增后再進行檢測。PCR方法采用前面所述的發(fā)蟲草專一性的核酸分子探針ftObe I及ftObe II作為一組PCR引物，以如前所述蟲草菌ITS區(qū)通用引物CorF及CorR作為陽性對照組的PCR引物，分別利用上述兩組引物按照常規(guī)的PCR方法擴增待測樣品，兩者均能擴增到特異性DNA 片段的樣品即為發(fā)蟲草，其中利用I及II獲得的DNA片斷長為109bp，利用 CorF及CorR獲得的DNA片斷長為530bp左右。僅蟲草菌ITS通用引物CorF及CorR能夠得到特異性片段而本發(fā)明提供的發(fā)蟲草專一性的核酸分子探針組成的PCR引物I及 Probe II不能擴增到特異性DNA片段的樣品則不是發(fā)蟲草樣品。其中，PCR反應(yīng)可以利用本發(fā)明所述的試劑盒中的試劑或按照常規(guī)的分子生物學(xué)方法提取的發(fā)蟲草樣品總DNA作為模板，也可以直接挑取少量的發(fā)蟲草樣品加入PCR反應(yīng)體系作為模板。本發(fā)明的發(fā)蟲草專一性核苷酸分子探針Probe I和ftx)be II具有極高的專一性，可以與發(fā)蟲草發(fā)生專一性的反應(yīng)而不與其他種類的蟲草或其他真菌發(fā)生反應(yīng)。利用上述探針通過PCR的方法或核酸雜交或熒光定量PCR的方法可以快速的對發(fā)蟲草及相關(guān)制品進行檢測。本發(fā)明由于有采用DNA序列作為檢測標記，因此可以準確、快速的檢測未知樣品是否為或含有發(fā)蟲草，其中樣品可以為子實體、其粉碎加工產(chǎn)品及包含有發(fā)蟲草的中成藥制劑、保健品。采用PCR方法檢測時，所需樣品量極少，方法簡單，半天內(nèi)可完成檢測。


圖1是核糖體rRNA基因結(jié)構(gòu)示意圖，其中標示為ITS區(qū)的范圍為本發(fā)明涉及的 DNA序列，即核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITSl和ITS2以及5. 8S rRNA基因；圖2是本發(fā)明所述的發(fā)蟲草特征性核苷酸序列全序列以及用于鑒定發(fā)蟲草的兩個發(fā)蟲草專一性核苷酸分子探針ftObe I.Probe II及ftx)be III的位置圖，該圖顯示ITS區(qū)正鏈序列，左側(cè)為5’端，右側(cè)為3’端，其中加粗及下劃線部分分別為ftObe I(77bp-94bp， 位于正鏈上)、ProbeII (163bp_185bp，位于負鏈上)及Probe III (103bp_129bp，位于正鏈上)；圖3是實施例3中的PCR反應(yīng)結(jié)果示意圖，其中1，2為蛹蟲草；3，4為戴氏蟲草； 5，6為冬蟲夏草；7，8為蜂頭蟲草；9，10為球孢白僵菌，11，12為連州蟲草；13，14為發(fā)蟲草， M為DNA分子量標準；圖4是實施例4中的PCR反應(yīng)結(jié)果示意圖，其中1，2為蛹蟲草；3，4為戴氏蟲草； 5，6為冬蟲夏草；7，8為蜂頭蟲草；9，10為球孢白僵菌，11，12為連州蟲草；13，14為發(fā)蟲草， M為DNA分子量標準。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實施例1 發(fā)蟲草rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)以及5. 8S rRNA基因(ITS區(qū)的序列)的制備取發(fā)蟲草樣品0. 1-0. 5g，液氮中研磨成粉，加入300 μ 1尿素提取液(SDS 1.5%, 尿素 7mol/L, Tris-HCl ρΗ8· 00. 05mol/L, NaCl 0. 5mol/L)，移入 1. 5ml 微型離心管中，在液氮中冷卻，迅速移到65°C融化。反復(fù)凍融3 5次后，加入等體積的酚氯仿異戊醇05 24 1)，震蕩，13000r/min離心lOmin，上清移入新管中加入等體積氯仿異戊醇04 1)，震蕩，13000r/min離心lOmin，上清移入新管中加入微量foiase A，37°C保溫30min，加入3倍體積無水乙醇，3M NaAc (pH5. 2)，_20°C放置至少30min后，13000rpm 離心15min，回收DNA沉淀，用70%乙醇和無水乙醇洗滌，抽干或風(fēng)干，每管加入50ul TE (1 OOmmo 1/L Tris-Cl, 10mmol/L EDTA，ρΗ8· 0)回溶，獲得總 DNA。取0.2ml PCR管一支，加入20ul PCR反應(yīng)液(包括IOxPCR緩沖液2ul，引物CorF、 CorR各40ng，2mmol/L dNTP lul，Taq酶1個單位，加超純水至20ul)，加入0. 5ul發(fā)蟲草總 DNA提取液，閉緊管蓋，置于PCR儀上按以下程序進行PCR反應(yīng)94°C預(yù)變性:3min，然后93°C 變性lmin，55°C復(fù)性lmin，72°C延伸2min，共30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。反應(yīng)完成后利用商業(yè)化的純化試劑盒進行產(chǎn)物的純化并直接在DNA測序儀上測序。獲得核苷酸序列除去18S rRNA基因以及觀3 rRNA基因序列后所得到的序列即為發(fā)蟲草rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)以及5. 8S rRNA基因的序列，其序列如SEQ ID NO. 1所示。實施例2 發(fā)蟲草專一性探針(引物):Probe I，Probe II及ProbeIII的制備將發(fā)蟲草的ITS區(qū)序列與其他蟲草菌的同源序列進行比較，獲得最適于鑒別發(fā)蟲草寡核苷酸片段組成與排列順序，即ftObe I, Probe II及ftx)be III，如圖2所示，Probe I位置為77bp-94bp，位于正鏈上；Probe II位置為163bp_185bp，位于負鏈上；Probe III 位置為103bp-129bp，位于正鏈上。根據(jù)ftx)be I,Probe II及ftx)be III的核苷酸排列和組成可以在商業(yè)化的DNA合成儀上通過化學(xué)合成的方法合成ftObe I (如SEQ ID NO. 2所示)，Probe II (如 SEQ ID NO. 3 所示)及 Probe III (如 SEQ ID NO. 4 所示)，即可用作專一性PCR引物。再此基礎(chǔ)上，可以利用常規(guī)的分子生物學(xué)方法利用酶、同位素、生物素、化學(xué)熒光素、熒光劑等對I^robe I及II進行標記，即可用做雜交用探針。將ftx)be III 根據(jù)Taqman探針法進行熒光及淬滅基團的標記即可利用其作為Taqman探針進行熒光定量 PCR。實施例3:鑒定發(fā)蟲草的正對照試驗本試驗用以確定DNA樣品符合PCR要求可獲得特異性PCR產(chǎn)物。方法1 總DNA提取參照實施例1進行，對不同的樣品(蛹蟲草，戴氏蟲草，冬蟲夏草，蜂頭蟲草，球孢白僵菌，連州蟲草，發(fā)蟲草)分別提取DNA，再進行PCR擴增。各個樣品的PCR反應(yīng)體系為:20ul PCR反應(yīng)液(包括IOxPCR緩沖液2ul，引物CorF、CorR各40ng, 2mmol/L dNTP lul, Taq酶1個單位，加超純水至20ul)，加入0. 5ul各個樣品的總DNA提取液，閉緊管蓋，置于PCR儀上按以下程序進行PCR反應(yīng)94°C預(yù)變性3min，然后93°C變性 lmin，55°C復(fù)性lmin，72°C延伸2min，共30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0擴增的產(chǎn)物在 2%的含有DNA染料的瓊脂糖凝膠上進行電泳，在適當(dāng)?shù)淖贤夤庠聪虏榭匆约芭恼?。方? 用牙簽直接挑取適量的各個樣品(粉碎子實體、粉碎的相關(guān)制品)(蛹蟲草，戴氏蟲草，冬蟲夏草，蜂頭蟲草，球孢白僵菌，連州蟲草，發(fā)蟲草)在裝20ul超純水的 0. 2ml PCR管種攪動，并分別稀至0. 1倍以及0.01倍，取2ul上述三個濃度的樣品懸濁液加入含有 20ul PCR 反應(yīng)液(包括 IOxPCR 緩沖液 2ul，引物 CorF、CorR 各 40ng，2mmol/L dNTP lul，Taq酶1個單位，加超純水至20ul)的0. ^il PCR管中，充分混勻閉緊管蓋，全部PCR管置于PCR儀上進行如下PCR反應(yīng)94°C預(yù)變性:3min，然后93°C變性lmin，6(TC復(fù)性lmin， 72°C延伸anin，共30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。擴增的產(chǎn)物在2 %的含有DNA著色劑的瓊脂糖凝膠上進行電泳，在適當(dāng)?shù)淖贤夤庠聪虏榭匆约芭恼?。圖3為按方法1進行的實驗結(jié)果，顯示七種蟲草(1，2為蛹蟲草；3，4為戴氏蟲草； 5，6為冬蟲夏草；7，8為蜂頭蟲草；9，10為球孢白僵菌，11，12為連州蟲草；13，14為發(fā)蟲草) 均可正常的擴增得到ITS區(qū)DNA特異性片段，該結(jié)果表明五種待測蟲草提取的總DNA符合 PCR擴增的要求，可以用作專一性檢測的待測樣品。實施例4 發(fā)蟲草專一性鑒別用以從符合PCR要求的樣品中專一性的擴增發(fā)蟲草，從而鑒別發(fā)蟲草。方法1 使用實施例3中符合PCR反應(yīng)要求的樣品，以這些樣品的總DNA作為模板， 參照實施例1中方法進行PCR擴增，其中引物替換為ftObe I及ftObe II，反應(yīng)條件為94°C 預(yù)變性3min，然后93 °C變性lmin，6(TC復(fù)性lmin，72°C延伸2min，共30個循環(huán)，最后72 °C 延伸lOmin。擴增的產(chǎn)物在2%的含有DNA染料的瓊脂糖凝膠上進行電泳，在適當(dāng)紫外的光源下查看以及拍照。方法2 使用實施例3中符合PCR反應(yīng)要求的樣品懸濁液如實施例3中方法2所述進行PCR反應(yīng)，其中引物替換為ftObe I及ftObe II，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性;3min，然后 93°C變性lmin，60°C復(fù)性lmin，72°C延伸2min，共30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0擴增的產(chǎn)物在2%的含有DNA染料的瓊脂糖凝膠上進行電泳，在適當(dāng)?shù)淖贤夤庠聪虏榭匆约芭恼?。圖4為按方法1進行的實驗結(jié)果，顯示七種蟲草(1，2為蛹蟲草；3，4為戴氏蟲草； 5,6為冬蟲夏草；7，8為蜂頭蟲草；9，10為球孢白僵菌，11，12為連州蟲草；13，14為發(fā)蟲草)，其中只有發(fā)蟲草被專一性的擴增獲得109bp左右的特異性DNA片段，而其他蟲草均無特異性DNA片段被擴增，該結(jié)果表明，發(fā)蟲草專一性探針(引物)Probe I及ftx)be II可以從多種蟲草中準確的鑒別出發(fā)蟲草，同時根據(jù)實施例3排除了假陰性(不符合PCR擴增條件而造成的陰性結(jié)果)的可能。
權(quán)利要求
1.一種用于鑒別發(fā)蟲草(Ophiocordyc印S crinalis)的特征性核苷酸序列，其特征在于，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種用于鑒別發(fā)蟲草的發(fā)蟲草專一性核苷酸分子探針，其特征在于，該發(fā)蟲草專一性核苷酸分子探針包括 Probe 1:5，-GACCCAGACCCCGCTGTC-3，和 Probe II 5’ -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)蟲草專一性核苷酸分子探針，其特征在于，所述的發(fā)蟲草專一性核苷酸分子探針還包括 Probe III :5’ -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3’。
4.一種用于鑒別發(fā)蟲草的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求2所述的發(fā)蟲草專一性核苷酸分子探針Probe I :5，-GACCCAGACCCCGCTGTC-3，和 Probe II 5，-CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3，和 PCR 常規(guī)反應(yīng)試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還含有蟲草屬核糖體 rRNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物 CorF :5，-CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3，和 CorR 5， -TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3，。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還含有III5'-TCAGC GTCCGCAAGCAGAAATGAATCA-3，。
7.一種用于鑒別發(fā)蟲草的方法，其特征在于，是以權(quán)利要求2所述的發(fā)蟲草專一性核苷酸分子探針Probe I :5，-GACCCAGACCCCGCTGTC-3，和 Probe II 5’ -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3’作為引物，利用PCR的方法或者核酸雜交的方法或熒光定量PCR的方法鑒定發(fā)蟲草。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于鑒別發(fā)蟲草的方法，其特征在于，所述的用熒光定量PCR 的方法鑒定發(fā)蟲草，是以Probe III :5，-TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3，標記熒光基團后作為iTaqman探針再進行熒光定量PCR。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于鑒別發(fā)蟲草的方法，其特征在于，所述的用 PCR的方法鑒定發(fā)蟲草，還以蟲草屬核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物CorF 5，-CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3，和 CorR :5，-TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3，的擴增產(chǎn)物作為陽性對照。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別發(fā)蟲草的特征性核苷酸序列及其探針和方法。所述的用于鑒定發(fā)蟲草(Ophiocordyceps crinalis)的特征性核苷酸序列來自發(fā)蟲草核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，其序列如SEQ ID NO.1所示。以此特征性核苷酸序列為基礎(chǔ)上設(shè)計的核酸分子探針Probe I(如SEQ ID NO.2所示)和Probe II(如SEQ ID NO.3所示)，以及包含該核酸分子探針的鑒定試劑盒，以及利用該探針通過PCR、核酸雜交或熒光定量PCR鑒別發(fā)蟲草的方法。利用本發(fā)明，可以方便、快速、準確的進行發(fā)蟲草及相關(guān)的制品的快速鑒定，本發(fā)明使用分子生物學(xué)手段排除了鑒定中的人為影響、鑒定結(jié)果客觀準確，鑒定時間短，半天即可完成。
文檔編號C12Q1/68GK102337347SQ20111034659
公開日2012年2月1日 申請日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月4日
發(fā)明者李浩華, 潘清靈, 王磊, 章衛(wèi)民, 陳玉蟬 申請人:廣東省微生物研究所