專利名稱：序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及序列。具體而言，本發(fā)明涉及吡喃鄰?fù)┨?pyranosone)脫水酶的氨基酸序列，及編碼它的核酸序列。
背景技術(shù)：
文獻(xiàn)中記載過葡萄糖可被吡喃糖2-氧化酶(EC 1. 1.3. 10，P20)氧化形成葡糖醛酮(D-arabino-hexos-2-ulose)，然后被吡喃鄰?fù)┨敲撍?PD)轉(zhuǎn)化成藍(lán)草菌酮(cortalcerone)[Koths, K. ；Halenbeck, R. ；Moreland, M. (1992), Carbohydr Res. Vol. 232No. 1,59-75 頁；Gabriel, J. ；Vole, J. ；Sedmera, P. ；Daniel, G. ；Kubatova, Ε. (1993)，Arch. Microbi.，160 :27-34]。P20 和 PD 已經(jīng)在真菌中純化，P20 已被克隆。PD 已經(jīng)由Koths等(1992)從卵形多孔菌(Polyporus obtusus)純化，并由Gabriel等(1993) 從黃孢原毛平革菌(黃孢原毛平革菌)純化。然而，迄今為止，還沒有描述過PD的氨基酸或核苷酸序列。
現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開了淀粉可被轉(zhuǎn)化成1，5-脫水-D-果糖(AF) [S. Yu和 J. Marcussen, Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering ；Gilbert, H. J.； Davies, G. J；Henrissat B. ；Svensson, B. , Eds. ；Royal Society of Chemistry(RS. C) Press, 1999. 242-250]。而且進(jìn)一步顯示很多真菌和紅藻提取物都可將AF酶轉(zhuǎn)化成薄閉殼素，但還沒有分離，純化或描述過所涉及的酶[Baute，M-A. ；Deffieux, G. ；Baute, R. (1986)，Phytochemistry (Oxf) vol. 25 1472—1473 ；Broberg, A.，Kenne, L.，禾口 Pedersen， Μ. (1996)，Phytochemistry (oxf). 41 :151-154] 迄今為止，還沒有暗示表明 PD 可在 AF 向薄閉殼素的轉(zhuǎn)化中起作用。
而且還記載了子囊吡喃酮(ascopyrone) P (APP)可從AF產(chǎn)生[Baute, M-A.； Deffieux, G. ；Vercauteren, J. ；Baute, R. ；Badoc, A. (1993), Phytochemistry(oxf) vol. 33no. 1,41-45]。又，沒有證據(jù)表明PD涉及該過程。發(fā)明內(nèi)容
從大方面講，本發(fā)明涉及編碼吡喃鄰?fù)┨敲撍傅陌被嵝蛄屑昂塑账嵝蛄械拿枋觥?br> 本發(fā)明另一方面涉及先前未公開的吡喃鄰?fù)┨敲撍傅膽?yīng)用，包括AF向薄閉殼素和APP的轉(zhuǎn)化，以及葡糖醛酮向藍(lán)草菌酮的轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明各方面是在權(quán)利要求和下列說明中給出的。
簡言之，本發(fā)明的一些方面涉及
1. 一種新的氨基酸序列
2. 一種新的核苷酸序列
3.制備所述氨基酸序列的方法
4.制備所述核苷酸序列的方法
5.含有所述核苷酸序列的表達(dá)系統(tǒng)
6.表達(dá)所述核苷酸序列的方法
7.含有所述核苷酸序列的轉(zhuǎn)化宿主/宿主細(xì)胞
8.所述氨基酸序列的應(yīng)用
9.所述核苷酸序列的應(yīng)用
本發(fā)明所用的術(shù)語“表達(dá)”，“被表達(dá)的”和“可表達(dá)的”分別與術(shù)語“轉(zhuǎn)錄”，“被轉(zhuǎn)錄的”和“可轉(zhuǎn)錄的”同義。
有關(guān)本發(fā)明核苷酸序列的其它方面包括含有本發(fā)明序列的構(gòu)建體；含有本發(fā)明序列的載體；含有本發(fā)明序列的質(zhì)粒；含有本發(fā)明序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；含有本發(fā)明序列的轉(zhuǎn)化組織；含有本發(fā)明序列的轉(zhuǎn)化器官；含有本發(fā)明序列的轉(zhuǎn)化宿主；含有本發(fā)明序列的轉(zhuǎn)化生物。本發(fā)明還包括使用它們表達(dá)核苷酸序列的方法，如在宿主植物細(xì)胞中表達(dá)；包括轉(zhuǎn)化它們的方法。
為了便于參考，現(xiàn)在適當(dāng)?shù)臉?biāo)題下面討論本發(fā)明的這些及其它方面。然而，每個(gè)部分下面的教導(dǎo)并非必需限制為每個(gè)具體的部分。
發(fā)明詳述
一方面，本發(fā)明涉及一種含有選自下列至少一個(gè)氨基酸序列的分離多肽，或其變體，同系物或衍生物
(i)KPHCEPEQPAALPLFQPQLVQGGRPDXYWVEAFPFRSDSSK ；
(ii)SDIQMFVNPYATTNNQSSXWTPVSLAKLDFPVAMHYADITK ；
(iii) VSffLENPGELR ；
(iv) DGVDCLffYDGAR ；
(v)PAGSPTGIVRAEWTRHVLDVFGXLXXK ；
(vi)HTGSIHQWCADID⑶GEDEFLVAMMGADPPDFQRTGVWCYK ；
(vii)TEMEFLDVAGK ；
(viii)KLTLVVLPPFARLDVERNVSGVK ；
(ix)SMDELVAHNLFPAYVPDSVR ；
(x)NDATDGTPVLALLDLDGGPSPQAffNISHVPPGTDMYEIAHAK ；
(xi)TGSLVCARffPPVK ；
(xii)NQRVAGTHSPAAMGLTSRffAVTK ；
(xiii)GQITFRLPEAPDHGPLFLSVSAIRHQ ；
(xiv)KPHXEPEQPAALPLFQPQLVV(Q)GGRPDXY ；
其中X是未知的氨基酸殘基。
另一方面，本發(fā)明涉及一種核苷酸序列，選自
(a)編碼上述氨基酸序列的核苷酸序列；
(b) 一種核苷酸序列，它是(a)核苷酸序列的變體，同系物，衍生物或片段；
(c) 一種核苷酸序列，它是(a)核苷酸序列的互補(bǔ)序列；
(d) 一種核苷酸序列，它是(a)核苷酸序列的變體，同系物，衍生物或片段的互補(bǔ)序列；
(e)能夠與(a)核苷酸序列雜交的核苷酸序列；
(f)能與(a)核苷酸序列的變體，同系物，衍生物或片段雜交的核苷酸序列；
(g) 一種核苷酸序列，它是能與(a)核苷酸序列雜交的核苷酸序列互補(bǔ)序列；
(h) 一種核苷酸序列，它是能夠與(a)核苷酸序列的變體，同系物，衍生物或片段雜交的核苷酸序列的互補(bǔ)序列；
(i) 一種能夠與(a)核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列；
(j) 一種能夠與(a)核苷酸序列的變體，同系物，衍生物或片段的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列；
(k)含有(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)，(h)，⑴，和 / 或(j)任何一個(gè)的核苷酸序列。
本發(fā)明另一方面包括本發(fā)明的分離核苷酸序列。
優(yōu)選方面
在其中一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種含有選自下列(i)-(xiii)中至少一個(gè)氨基酸序列的分離多肽，或其變體，同系物或衍生物
(i)KPHCEPEQPAALP LFQP QLVQGGRPDXYffVEAFPFRSD S SK 或 KPHXEPEQPAALPLFQPQLVV(Q)GGRPDXY ；
(ii)SDIQMFVNPYATTNNQSSXWTPVSLAKLDFPVAMHYADITK ；
(iii) VSffLENPGELR ；
(iv) DGVDCLffYDGAR ；
(v)PAGSPTGIVRAEWTRHVLDVFGXLXXK ；
(vi)HTGSIHQWCADID⑶GEDEFLVAMMGADPPDFQRTGVWCYK ；
(vii)TEMEFLDVAGK ；
(viii)KLTLVVLPPFARLDVERNVSGVK ；
(ix)SMDELVAHNLFPAYVPDSVR ；
(x)NDATDGTPVLALLDLDGGPSPQAffNISHVPPGTDMYEIAHAK ；
(xi)TGSLVCARffPPVK ；
(xii)NQRVAGTHSPAAMGLTSRffAVTK ；
(xii)GQITFRLPEAPDHGPLFLSVSAIRHQ ；
其中X是未知的氨基酸殘基。
在其中一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽含有選自上述序列
在其中一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽含有選自上述序列
在其中一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽含有選自上述序列
在其中一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽含有選自上述序列
在其中一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽含有選自上述序列
在其中一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽含有選自上述序列
在其中一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽含有選自上述序列
在其中一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽含有選自上述序列L)-(xiii)的1個(gè)序列。 L)-(xiii)的2個(gè)序列。 L)-(xiii)的3個(gè)序列。 L)-(xiii)的4個(gè)序列。 L)-(xiii)的5個(gè)序列。 L)-(xiii)的6個(gè)序列。 L)-(xiii)的7個(gè)序列。 L)-(xiii)的8個(gè)序列。
在其中一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽含有選自上述序列(i)-(xiii)的9個(gè)序列。
在其中一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽含選自上述序列(i)-(xiii)的10個(gè)序列。
在其中一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽含選自上述序列(i)-(xiii)的11個(gè)序列。
在其中一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽含選自上述序列(i)-(xiii)的12個(gè)序列。
在其中一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽含選自上述序列(i)-(xiii)的13個(gè)序列。
優(yōu)選，本發(fā)明的多肽具有吡喃鄰?fù)┨敲撍富钚浴?br> 其中一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及一種多肽，其可與相對(duì)于本發(fā)明的純化氨基酸序列培養(yǎng)的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)。
另一方面涉及一種編碼本發(fā)明多肽，或其變體，同系物，片段或衍生物的分離多核苷酸序列。
優(yōu)選，所述分離多核苷酸選自
(i)含有SEQ ID NO. 1的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸；
(ii)含有能夠與SEQ ID NO. 1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，或其片段的多核苷酸；
(iii)含有能夠與SEQ ID NO. 1的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸；和
(iv)含有由于SEQ ID NO. 1多核苷酸的遺傳密碼簡并性而產(chǎn)生的多核苷酸序列的多核苷酸。
優(yōu)選，所述核苷酸序列可從黃孢原毛平革菌，卵形多孔菌或藍(lán)色伏革菌獲得。
在其中一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核苷酸序列可從盤菌目，更優(yōu)選從橙黃網(wǎng)孢盤菌(Aleuria aurantia)，撫抱褐盤菌(Peziza badia)，多汁盤菌(P. succosa)，Sarcophaera eximia，尖頂羊肚菌(Morchella conica)，肋紋羊肚菌(M. costata)，彈絲羊肚菌 (M. elata)，可食羊肚菌(M. esculenta)，圓形可食羊肚菌(M. esculenta var. rotunda)， Μ· Hortensis 或赭鹿花菌(Gyromitra infula)獲得。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核苷酸序列可從木耳目(Auriculariales)，更優(yōu)選從腸膜狀木耳(Auricularia mesenterica)獲得。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核苷酸序列可從多孔菌目(Aphyllophorales)， 更優(yōu)選從 Pulcherricium caeruleum, |樂 f包伏革菌(Peniophora quercina)， Phanerochaete sordida，Vuilleminia comedens，煙色韋刃革菌(Stereum gausapatum)， 血痕韋刃革菌(S. sanguinolentum)，Lopharia spadicea，梓樣繡球菌(Sparassis laminosa), Boletopsis subsquamosa, M iW^ (Bjerkandera adusta), Trichaptum biformis, Cerrena unicolor,朱紅密孑L 菌(pycnoporus cinnabarinus),血紅密孑L 菌(P. sanguineus)，Junghunia nitida，黃色枝瑚菌(Ramaria flava)，微黃擬鎖瑚菌(Clavulinopsis helvola)，微黃擬鎖瑚菌var. Geoglossoides或絢麗擬鎖瑚菌 (V. pulchra)獲得。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核苷酸序列可從蘑菇目(Agaricales)，更優(yōu)選從 Clitocybe cyathiformis,C. dicolor,C. gibba,C. odora,Lepista caespitosa,L inversa, L luscina，L nebularis，Mycena seynii，Pleurocybella porrigens，Marasmius oreales 或 Inocybe pyriodora 獲得。
在另ー優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核苷酸序列可從Gracilariales，更優(yōu)選 從 Lrraciiaria varrucosa, bracilaria tenuistipitata, bracilariopsis sp, 5 Gracilariopsis Iemaneiformis 狀侍。在另ー優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核苷酸序列可從Melanosporaceae，更優(yōu)選從 Melanospora ornata, Microthecium compressum, Microthecium sobe丄ii き犬得。本發(fā)明另一方面涉及ー種分離多核苷酸，選自(i)含有SEQ ID NO. 1的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸；(ii)含有能夠與SEQ ID NO. 1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，或其片段的多核 苷酸；(iii)含有能夠與SEQ ID NO. 1的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多 核苷酸；和(iv)含有由于SEQ ID NO. 1多核苷酸的遺傳密碼簡并性而產(chǎn)生的多核苷酸序列的 多核苷酸。優(yōu)選，所述核苷酸序列與啟動(dòng)子可操縱連接。本發(fā)明另一方面涉及ー種含有上述多核苷酸序列的構(gòu)建體。本發(fā)明另一方面涉及ー種含有上述多核苷酸序列的載體。本發(fā)明另一方面涉及ー種宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)摻入本發(fā)明的多核苷酸序列。另一方面涉及ー種含有本發(fā)明多核苷酸序列的表達(dá)載體，所述多核苷酸序列與能 夠指導(dǎo)所述多核苷酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列可操縱連接。另一方面涉及ー種由SEQ ID NO. 1的多核苷酸序列編碼的分離多肽，或其變體，同 系物，片段或衍生物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述分離多肽具有從N-末端除去的至多7個(gè)氨基酸。更優(yōu)選，所述分離多肽具有與SEQ ID NO. 1編碼的多肽序列相比，至少75%的同一 性。另一方面涉及ー種能夠結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體。另ー方面涉及制備本發(fā)明氨基酸序列的方法，其中所述方法包括表達(dá)本發(fā)明的核 苷酸序列，并任選地分離和/或純化它們。優(yōu)選，本發(fā)明的核苷酸序列是在沒有表達(dá)酶底物 的環(huán)境中表達(dá)的，例如，在沒有1，5-脫水果糖的環(huán)境中表達(dá)。另一方面涉及ー種使用本發(fā)明的氨基酸序列，或本發(fā)明核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物制 備薄閉殼素的方法。另一方面涉及ー種使用本發(fā)明的氨基酸序列，或本發(fā)明核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物制 備子囊吡喃酮P的方法。優(yōu)選，該方法包括使所述氨基酸序列或所述核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物與1，5_脫 水-D-果糖反應(yīng)。甚至更優(yōu)選，所述方法還包括使用APP合酶。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括使APP合酶及所述氨基酸序列或所述核 苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物與1，5_脫水-D-果糖反應(yīng)。在可選擇性的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述制備薄閉殼素(microthecin)的方法包括使 本發(fā)明的多肽與葡聚糖裂合酶及淀粉糊精反應(yīng)。
本發(fā)明另一方面涉及一種使用本發(fā)明的氨基酸序列或本發(fā)明核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物制備藍(lán)草菌酮(cortalcerone)的方法。
優(yōu)選，該方法包括使氨基酸序列或核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物與葡糖醛酮反應(yīng)。
在可選擇性的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述制備薄閉殼素的方法包括使本發(fā)明的多肽與葡萄糖及吡喃糖2-氧化酶反應(yīng)。
本發(fā)明另一方面涉及一種制備薄閉殼素的方法，包括使吡喃鄰?fù)┨敲撍概c1， 5-脫水-D-果糖反應(yīng)。
本發(fā)明另一方面涉及一種制備子囊吡喃酮P的方法，包括使吡喃鄰?fù)┨敲撍讣癆PP合酶與1，5-脫水-D-果糖反應(yīng)。
本發(fā)明其中一個(gè)方面涉及一種制備薄閉殼素的方法，包括使吡喃鄰?fù)┨敲撍概c葡萄糖及淀粉糊精反應(yīng)。
本發(fā)明另一方面涉及制備藍(lán)草菌酮的方法，包括使吡喃鄰?fù)┨敲撍概c葡糖醛酮反應(yīng)。
本發(fā)明另一方面涉及一種制備藍(lán)草菌酮的方法，包括使吡喃鄰?fù)┨敲撍概c葡萄糖及吡喃糖2-氧化酶反應(yīng)。
本發(fā)明另一方面涉及薄閉殼素用于防止和/或抑制微生物在物質(zhì)中的生長，和/ 或殺死物質(zhì)中的微生物的應(yīng)用。
本發(fā)明的可選擇性方面涉及藍(lán)草菌酮用于防止和/或抑制微生物在物質(zhì)中的生長，和/或殺死物質(zhì)中的微生物的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種或多種薄閉殼素，藍(lán)草菌酮，或其衍生物或異構(gòu)體用于防止和/ 或抑制微生物在物質(zhì)中的生長，和/或殺死物質(zhì)中的微生物的應(yīng)用。
優(yōu)選，所述物質(zhì)是食品。
優(yōu)選可使用藍(lán)草菌酮和/或薄閉殼素對(duì)其發(fā)揮作用的微生物是植物真菌病原體。
優(yōu)選可使用藍(lán)草菌酮和/或薄閉殼素對(duì)其發(fā)揮作用的微生物選自絲核菌屬，腐霉屬，絲囊霉屬和尾孢屬。
優(yōu)選可使用藍(lán)草菌酮和/或薄閉殼素對(duì)其發(fā)揮作用的微生物選自茄屬絲核菌，終極腐霉，螺殼狀絲囊霉和泰菜尾孢。
本發(fā)明另一方面涉及薄閉殼素，藍(lán)草菌酮，或其衍生物或異構(gòu)體在防止和/或抑制病原體絲囊霉的生長，和/或殺死病原體絲囊霉中的用途。
優(yōu)選，所述病原體是螺殼狀絲囊霉。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，薄閉殼素的衍生物是2-呋喃基-羥甲基-酮或4-脫氧-甘油-己-2, 3- 二酮糖(4-deoxy-glycero-hexo-2, 3-diluose)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，藍(lán)草菌酮的衍生物是2-呋喃基乙二醛。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述薄閉殼素，藍(lán)草菌酮，或其衍生物或異構(gòu)體用于處理植物或植物種子，甚至更優(yōu)選用于處理甜菜種子，豌豆植株或豌豆種子。
另一方面，本發(fā)明涉及薄閉殼素，藍(lán)草菌酮，或其衍生物或異構(gòu)體作為植物或種子保護(hù)劑的應(yīng)用。
本發(fā)明另一方面涉及薄閉殼素，藍(lán)草菌酮，或其衍生物或異構(gòu)體作為植物生長調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。
優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明提供了先前未公開的，有關(guān)吡喃鄰?fù)┨敲撍傅陌被峒昂塑账嵝蛄械?fn息ο
本發(fā)明還涉及吡喃鄰?fù)┨敲撍冈趶腁F向APP及薄閉殼素轉(zhuǎn)化，以及在藍(lán)草菌酮產(chǎn)生中的應(yīng)用。迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)中還沒有教導(dǎo)或暗示PD涉及，或能夠影響這些轉(zhuǎn)化的任一方面。
因此，本發(fā)明能夠促進(jìn)薄閉殼素，APP及藍(lán)草菌酮的大量生產(chǎn)。本發(fā)明還教導(dǎo)了薄閉殼素及藍(lán)草菌酮可作為抗菌劑使用，特別用于食品中。
測定法
下列測定法可用于描述并鑒定本發(fā)明實(shí)際和推定的氨基酸序列。
分離的
一方面，優(yōu)選所述序列為分離的形式。術(shù)語“分離的”是指序列不是存在于它的天然環(huán)境中(即，在自然中找到)。通常，術(shù)語“分離的”是指所述序列至少基本上沒有至少一種其它成分，所述其它成分與所述序列天然相關(guān)，并且可在自然中找到。這里，所述序列可從與它天然相關(guān)的至少一種其它成分中分離出來。
純化的
一方面，優(yōu)選所述序列為純化的形式。術(shù)語“純化的”也指所述序列不是存在于它的天然環(huán)境中(即，在自然中找到)。通常，術(shù)語“純化的”是指所述序列至少基本上是從至少一個(gè)其它成分中分離出來的，所述其它成分與所述序列天然相關(guān)，并且可在自然中找到。
核苷酸序列
本發(fā)明包括編碼具有此處定義的特殊性質(zhì)的酶的核苷酸序列。這里所用的術(shù)語 “核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，及其變體，同系物，片段和衍生物(如，它的一部分)。所述核苷酸序列可以是基因組或合成或重組來源的，其可以是雙鏈或單鏈的， 正義或反義鏈。
本發(fā)明中的術(shù)語“核苷酸序列”包括基因組DNA，cDNA，合成DNA，及RNA。優(yōu)選它是指DNA，更優(yōu)選本發(fā)明編碼序列的cDNA。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸序列本身不包括存在于其天然環(huán)境中的本發(fā)明的天然核苷酸序列，例如當(dāng)它與同樣存在于其天然環(huán)境中的其天然相關(guān)序列連接時(shí)。為便于對(duì)照，我們稱該優(yōu)選實(shí)施方案為“非天然的核苷酸序列”。在這點(diǎn)上，術(shù)語“天然核苷酸序列”是指存在于其天然環(huán)境中的完整核苷酸序列，且當(dāng)和與其天然相關(guān)的完整啟動(dòng)子可操縱連接時(shí)，啟動(dòng)子也存在于其天然環(huán)境中。然而，本發(fā)明的氨基酸序列可在核苷酸序列在其天然生物中表達(dá)之后，被分離和/或純化。然而，優(yōu)選本發(fā)明的氨基酸序列可被其天然生物中的核苷酸序列表達(dá)，但其中所述核苷酸序列不受該生物內(nèi)與其天然相關(guān)啟動(dòng)子的控制。
通常，本發(fā)明的核苷酸序列是利用重組DNA技術(shù)(即，重組DNA)制備的。然而，在本發(fā)明可選擇性的實(shí)施方案中，可利用本領(lǐng)域熟知的化學(xué)方法完整或部分合成所述核苷酸序列(見 Caruthers MH 等，(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 和 Horn T 等，(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
核苷酸序列的制備
編碼具有此處定義的特殊性質(zhì)的酶或適于修飾的酶的核苷酸序列可從產(chǎn)生所述酶的任何細(xì)胞或生物鑒定和/或分離和/或純化。用于鑒定和/或分離和/或純化核苷酸序列的各種方法都是本領(lǐng)域熟知的。例如，一旦已經(jīng)鑒定和/或分離和/或純化了一個(gè)適宜序列，就可利用PCR擴(kuò)增技術(shù)制備不止一個(gè)序列。
例如，基因組DNA和/或cDNA庫可使用染色體DNA或信使RNA從產(chǎn)生所述酶的生物構(gòu)造。如果酶的氨基酸序列是已知的，那么可合成標(biāo)記寡核苷酸探針，并用于鑒定來源于從生物制備的基因組庫的編碼酶的克隆?？蛇x擇性地，含有與其它已知酶基因同源的序列的標(biāo)記寡核苷酸探針可用于鑒定編碼酶的克隆。在后一種情況中，使用較低嚴(yán)格度的雜交和清洗條件。
可選擇性地，編碼酶的克隆可通過在表達(dá)載體，如質(zhì)粒中插入基因組DNA的片段， 用所得基因組DNA庫轉(zhuǎn)化酶-陰性菌，然后將轉(zhuǎn)化細(xì)菌平板接種在含有酶底物(即，麥芽糖)的瓊脂上，由此鑒定表達(dá)所述酶的克隆而鑒定。
可選擇性地，編碼所述酶的核苷酸序列可通過已經(jīng)確定的標(biāo)準(zhǔn)方法制備，例如由 Beucage S. L.等，(IgSl)iTetrahedron Letters 22，1859-1869 頁描述的氨基磷酸鹽法，或 Matthes等，(1984)EMBO J. 3，801-805頁描述的方法。例如，在氨基磷酸鹽法中，在自動(dòng)DNA 合成儀中合成寡核苷酸，純化，退火，連接并在適宜的載體中克隆。
所述核苷酸序列可以是混合的基因組及合成來源，混合的合成及cDNA來源，或混合的基因組及cDNA來源，它們是按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過連接合成基因組或cDNA來源(適宜) 的片段而制備的。每個(gè)連接的片段與完整核苷酸序列的各個(gè)部分相對(duì)應(yīng)。所述DNA序列還可使用特殊引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備，例如在US 4，683，202或Miki R K等， (Science (1988) 239,487-491 頁)中描述的。
氨基酸序列
本發(fā)明還包括此處定義的具有特殊性質(zhì)的酶的氨基酸序列。
這里所用術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“多肽”和/或術(shù)語“蛋白”同義。在某些例子中，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“肽”同義。在某些例子中，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“酶” 同義。
所述氨基酸序列可從適宜的來源制備/純化，或合成制備它或利用重組DNA技術(shù)制備它。
本發(fā)明的酶可與其它酶結(jié)合使用。因此，本發(fā)明還包括酶的組合，其中所述組合含有本發(fā)明的酶和其它酶，其可以是本發(fā)明的其它酶。此方面在后面的部分中討論。
優(yōu)選所述酶不是天然的酶。在這一點(diǎn)上，術(shù)語“天然的酶”是指完整的酶，它存在于其天然環(huán)境中，且它已經(jīng)由其天然核苷酸序列表達(dá)。
變體/同系物/衍生物
本發(fā)明還包括本發(fā)明酶的氨基酸序列或編碼這種酶的任一核苷酸序列的變體，同系物，和衍生物的應(yīng)用。這里，術(shù)語“同系物”是指與主體氨基酸序列和主體核苷酸序列具有一定同源性的實(shí)體。這里，術(shù)語“同源性”等同于“同一性”。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，同源性序列包括與主體序列至少75，80，85或90%相同，優(yōu)選至少95，96，97，98或99%相同的氨基酸序列。通常，同系物含有與主體氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)等。雖然同源性還可被考慮為相似性(即，具有相似化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)，但在本發(fā)明的范圍內(nèi)，優(yōu)選以序列同一性來表示同源性。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，同源性序列包括與編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列(主體 (subject)序列)至少 40，50，60，70，75，80，85 或 90%相同，優(yōu)選至少 95，96，97，98 或 99% 相同的核苷酸序列。通常，同系物包括編碼與主體序列相同的活性位點(diǎn)等的序列。雖然同源性還可被勞率為相似性(即，具有相似化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)，但在本發(fā)明的范圍內(nèi)，優(yōu)選以序列同一性表示同源性。
同源性比較可通過肉眼進(jìn)行，或更通常借助于很容易獲得的序列比較程序進(jìn)行。 這些商業(yè)可獲得的計(jì)算機(jī)程序可計(jì)算兩個(gè)或多個(gè)序列間的同源性％。
可對(duì)連續(xù)序列計(jì)算同源性％，S卩，將一個(gè)序列與另一序列進(jìn)行排列對(duì)比，并將其中一個(gè)序列中的每個(gè)氨基酸直接與另一序列中的相應(yīng)氨基酸進(jìn)行比較，每次比較一個(gè)殘基。 這被稱作“無空位”序列對(duì)比。通常，這種無空位序列對(duì)比只對(duì)相對(duì)較少數(shù)量的殘基進(jìn)行。
雖然這是一種非常簡單且可靠的方法，但它不能考慮到，例如，在另一對(duì)相同序列中，一次插入或缺失可導(dǎo)致下列核酸殘基不能進(jìn)行序列對(duì)比，從而當(dāng)進(jìn)行總體序列對(duì)比時(shí)， 可能導(dǎo)致同源性％大大降低。因此，絕大多數(shù)序列比較法都被設(shè)計(jì)成既能產(chǎn)生最佳序列對(duì)比，又考慮到了插入和缺失，而不會(huì)不適當(dāng)?shù)亓P分總的同源性值。這是通過在序列對(duì)比中插入“空位(gaps) ”，從而盡力使局部同源性達(dá)到最大而實(shí)現(xiàn)的。
然而，這些更復(fù)雜的方法將“空位罰分(gap penalties)”賦予序列對(duì)比中出現(xiàn)的每個(gè)空位，這樣，對(duì)于同樣數(shù)目的相同氨基酸而言，序列對(duì)比具有盡可能少的空位-反映兩個(gè)比較序列之間更高的相關(guān)性-將獲得比具有多個(gè)空位更高的值。通常使用“親族空位值”，它給空位的存在注入相對(duì)較高的值，而給空位中的每個(gè)后續(xù)殘基賦予較小的罰分。這是最普遍使用的空位評(píng)分系統(tǒng)。較高的空位罰分當(dāng)然可產(chǎn)生具有較少空位的最佳序列對(duì)比。絕大多數(shù)序列對(duì)比程序都可改變空位罰分。然而，當(dāng)使用這種軟件進(jìn)行序列比較時(shí)，優(yōu)選使用缺省值。例如，當(dāng)使用GCG Wisconsin Bestfit軟件包時(shí)，對(duì)于空位而言，氨基酸序列的缺省空位罰分是-一個(gè)空位12，一次延伸4。
因此，最大同源性％的計(jì)算首先要求產(chǎn)生最佳序列對(duì)比，同時(shí)考慮空位罰分。進(jìn)行這種序列對(duì)比的適宜計(jì)算機(jī)程序是GCG Wisconsin Bestfit軟件包(Devereux等，1984，Nuc Acids Research 12:387)?？蛇M(jìn)行序列比較的其它軟件的例子包括，但不限制于BLAST軟件包(見 Ausubel 等，1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed_Chapterl8)， FASTA (Altschul 等，1990，J. Mol. Biol.，403-410)和比較工具的 GENEW0RKS 程序組。BLAST 和FASTA可脫機(jī)和在線檢索(見Ausubel等，1999，7-58-7-60頁)。然而，對(duì)于某些應(yīng)用而言，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。一種被稱作BLAST 2 Sequences的新工具也可用于比較蛋白及核苷酸序列(見FEMS Microbiol Lett 1999174(2) :247-50 ；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1) :187-8 和 tatianaOncbi. nlm. nih. gov)。
雖然，最終的同源性％可以同一性的形式測量，但通常序列對(duì)比過程本身并不是以全有或絕無的成對(duì)比較為基礎(chǔ)的。相反，通常使用一定的相似性得分矩陣，以化學(xué)相似性或進(jìn)化距離為基礎(chǔ)，將值賦予每次成對(duì)比較。通常所用這種矩陣的例子是BL0SUM62矩陣-程序的BLAST程序組的缺省矩陣。GCG Wisconsin程序通常使用公共缺省值或自定義符號(hào)比較表(見詳述部分的用戶手冊(cè))。對(duì)于某些應(yīng)用而言，優(yōu)選使用GCG軟件包的公共缺省值，或?qū)τ谄渌浖?，使用缺省矩陣，如BL0SUM62。
可選擇性地，同源性百分比可以和CLUSTAL類似的算法為基礎(chǔ)，使用多序列對(duì)比特征在DNASIS (Hitachi Software)中計(jì)算(Higgins DG & Sharp PM(1998) ,Gene 73(1)， 237-244)。
一旦所述軟件產(chǎn)生了最佳序列對(duì)比，那么就可計(jì)算同源性％，優(yōu)選計(jì)算序列同一性％。通常所述軟件是作為序列比較的一部分進(jìn)行的，并產(chǎn)生數(shù)值結(jié)果。
所述序列還可具有氨基酸殘基的缺失，插入或置換，產(chǎn)生沉默改變及功能等價(jià)物質(zhì)。氨基酸置換可以殘基的極性，電荷，溶解性，疏水性，親水性，和/或兩親性為基礎(chǔ)進(jìn)行， 只要能夠保留物質(zhì)的次級(jí)結(jié)合活性。例如，帶負(fù)電的氨基酸包括天門冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有相似親水性值的不帶電的極性端基的氨基酸包括亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天門冬酰胺，谷酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，苯丙氨酸， 和酪氨酸。
保守置換可按照下表進(jìn)行。第二欄同一區(qū)塊(block)內(nèi)的氨基酸，優(yōu)選第三欄同一行的氨基酸可彼此置換
權(quán)利要求
1.薄閉殼素、藍(lán)草菌酮或薄閉殼素、藍(lán)草菌酮的衍生物在防止和/或抑制病原體絲囊霉的生長，和/或殺死病原體絲囊霉中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述薄閉殼素的衍生物是2-呋喃基-羥甲基-酮或4-脫氧-甘油-己-2，3- 二酮糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述藍(lán)草菌酮的衍生物是2-呋喃基乙二醛。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其用于處理植物或植物種子。
5.薄閉殼素、藍(lán)草菌酮或薄閉殼素、藍(lán)草菌酮的衍生物作為植物或種子保護(hù)劑的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述薄閉殼素的衍生物是2-呋喃基-羥甲基-酮或4-脫氧-甘油-己-2，3- 二酮糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述藍(lán)草菌酮的衍生物是2-呋喃基乙二醛。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其用于處理甜菜種子。
全文摘要
本發(fā)明涉及序列。本發(fā)明公開了有關(guān)吡喃鄰?fù)┨敲撍傅男蛄行畔ⅰ１景l(fā)明還涉及吡喃鄰?fù)┨敲撍冈趶腁F向APP和薄閉殼素轉(zhuǎn)化及從葡糖醛酮向藍(lán)草菌酮轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/88GK102511482SQ20111035517
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2002年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月31日
發(fā)明者A·J·莫甘, H·C·彼得森, I·維爾岡, 于書坤 申請(qǐng)人:丹尼斯科有限公司