專利名稱：充質(zhì)干細胞及提取方法在制備多發(fā)性硬化癥藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及充質(zhì)干細胞在制備具有免疫調(diào)節(jié)功能的藥物中的應(yīng)用，特別是皮膚間充質(zhì)干細胞(skin-derived Mesenchymal Stem Cells)在制備多發(fā)性硬化癥的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis)是一種發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦部以及脊髓)的慢性、炎癥性、自體免疫疾病，其特征是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中異常神經(jīng)退行病變(neurodegeneration)引發(fā)以T細胞、B細胞、抗原提呈細胞為主的炎癥細胞浸潤,從而導(dǎo)致多處的神經(jīng)出現(xiàn)脫髓鞘(demyelination)現(xiàn)象，并在髓鞘組織修復(fù)的過程中，沿著軸突受損硬化。多發(fā)性硬化癥的確切發(fā)病原因還不清楚，環(huán)境因子(諸如感染、外傷等)和遺傳因子等綜合因素決定了個體的易感性，患者可能出現(xiàn)行動不便、視力受損、疼痛等神經(jīng)功能殘缺癥狀(Hauser and Oksenberg, 2006)。多發(fā)性硬化癥目前尚無根治的藥物，IFN-β和glatiramer acetate為常見的治療復(fù)發(fā)型多發(fā)性硬化癥(relapsing-remitting multiple sclerosis)的第一線藥物，一般認為此兩種藥物能抑制炎癥T細胞免疫應(yīng)答，然而其作用機理尚不明確，也僅能達到適度舒緩疾病復(fù)發(fā)的機率(Hauser and Oksenberg, 2006)。另一種用于治療嚴(yán)重多發(fā)性硬化癥患者的藥物為Natalizumab，它的作用機理是透過抑制致病性淋巴細胞表面所表達的細胞黏附分子α 4整合素，達到阻止淋巴細胞遷移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的效果(Hauser andOksenberg, 2006)。雖然Natalizumab有較好的療效，由于淋巴細胞在機體正常免疫反應(yīng)中不可缺少，沒有選擇性地阻擋淋巴細胞遷移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致極高比例的病患在接受治療后產(chǎn)生腦部感染癥狀(M artin, 2010)。此外，抗體類藥物生產(chǎn)成本高、價格昂貴、普通病人很難能承受。多發(fā)性硬化癥為導(dǎo)致神經(jīng)功能殘缺的最主要的疾病之一，全球有上千萬人患病，患者的日常生活往往受到嚴(yán)重牽連?；谶@一點，自主研究開發(fā)高效且低副作用的新療法勢在必行。充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell)是一種未分化、能自我增生、且能分化成多種間充質(zhì)組織細胞的多能性細胞(Pittenger et al.，1999)。早期，間充質(zhì)干細胞多從骨髓中取得，骨髓間充質(zhì)干細胞具有抑制免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)外周免疫耐受的特質(zhì)(Xu et al.,2007)，曾被應(yīng)用于抑制骨髓移植時所導(dǎo)致的移植體對宿主排斥反應(yīng)(graft-versus-hostdisease, GVHD) (Le Blanc et al.，2004)。除了骨髓以外，間充質(zhì)干細胞也存在于其他成體組織中。不同于骨髓間充質(zhì)干細胞，在皮膚真皮層中的間充質(zhì)干細胞，除了能分化成中胚層(mesodermal)相關(guān)組織細胞(如脂肪細胞、平滑肌細胞)，還具有分化成神經(jīng)細胞、造血細胞、肝細胞等多種非中胚層組織細胞的特性，因此在臨床上有極大的應(yīng)用價值(Sellheyerand Krahl, 2010)。由于大量的皮膚樣本較骨髓易于取得，從皮膚樣本提取治療用間充質(zhì)干細胞實屬可行性高、用途廣、侵入性小、且具經(jīng)濟效益的選擇。
然而，皮膚間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)功能目前尚未被發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明提供一種透過皮膚間充質(zhì)干細胞在炎癥環(huán)境中有選擇地抑制致病性效應(yīng)T細胞應(yīng)答，促使神經(jīng)細胞再生而達到治療效果的多發(fā)性硬化癥細胞療法，并根據(jù)此法制備具有免疫調(diào)節(jié)功能的藥物的應(yīng)用特別是制備治療多發(fā)性硬化癥的藥物的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種充質(zhì)干細胞在制備具有免疫調(diào)節(jié)功能的藥物中的應(yīng)用，以及相關(guān)充質(zhì)干細胞的提取方法:
充質(zhì)干細胞在制備治療具有免疫調(diào)節(jié)功能的藥物中的應(yīng)用。充質(zhì)干細胞在制備治療多發(fā)性硬化癥的藥物中的應(yīng)用。所述的充質(zhì)干細胞在制備治療具有免疫調(diào)節(jié)功能的藥物中的應(yīng)用，其中所述的充質(zhì)干細胞來源于皮膚真皮層中。所述的充質(zhì)干細胞在制備治療多發(fā)性硬化癥的藥物中的應(yīng)用，其中所述的充質(zhì)干細胞來源于皮膚真皮層中。所述的應(yīng)用中所述的充質(zhì)干細胞通過下列方法提取:剪取背部皮膚置于dispase酶中，使用PBS液清洗，剝?nèi)ケ砥?，將真皮置于膠原酶中消化，完成后再添加DNase I消化，再用PBS洗一遍，用滴管吹打成單細胞懸液并過濾，接種于培養(yǎng)皿中，棄去懸浮細胞，將貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，待長滿瓶底大部分后，胰酶消化，常規(guī)傳代。
從小鼠皮膚真皮中分離得到真皮間充質(zhì)干細胞:取新生小鼠，處死后剪取背部皮膚置于dispase酶中，使用 PBS液清洗，剝?nèi)ケ砥?，將真皮置于膠原酶中消化，完成后再添加DNase I消化，再用PBS洗一遍，用滴管吹打成單細胞懸液并過濾，接種于培養(yǎng)皿中，棄去懸浮細胞，將貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，待長滿瓶底大部分后，胰酶消化，常規(guī)傳代，取傳至第三代的細胞進行研究。對其進行鑒定:將體外培養(yǎng)的真皮間充質(zhì)干細胞胰酶消化后接種于不同的分化誘導(dǎo)體系中，培養(yǎng)后經(jīng)行組織染色，鑒定分化情況。向成骨細胞分化通過茜素紅染色；向脂肪細胞分化通過形態(tài)學(xué)觀察和油紅染色(圖1)。觀察到從小鼠皮膚真皮層中提取的皮膚間充質(zhì)干細胞具有免疫調(diào)節(jié)的特性，在體外培養(yǎng)時能有效抑制效應(yīng)T細胞免疫應(yīng)答(圖2):用細胞標(biāo)記物標(biāo)記免疫磁珠分離的小鼠T細胞，與皮膚間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)；在共培養(yǎng)中用抗體刺激T細胞。標(biāo)記過的細胞的分裂增殖情況可以被流式細胞儀檢測，這個實驗說明了和骨髓間充質(zhì)干細胞一樣同體皮膚間充質(zhì)干細胞均可以在體外抑制抗體刺激下的T細胞分裂增殖。測試皮膚間充質(zhì)干細胞對多發(fā)性硬化癥的治療效果實驗中，將皮膚間充質(zhì)干細胞注入一種在組織學(xué)、免疫學(xué)、多基因特性和治療反應(yīng)性上與人類多發(fā)性硬化癥極為相似的 experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)小鼠體內(nèi),EAE 小鼠在皮膚間充質(zhì)干細胞治療30天后被基本治愈(圖3)。
本發(fā)明有益效果:充質(zhì)干細胞在炎癥環(huán)境中有選擇地抑制致病性效應(yīng)T細胞應(yīng)答并誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞發(fā)生而達到治療效果。本發(fā)明公開的皮膚間充質(zhì)干細胞取得容易、不具免疫排斥性、能夠在炎癥環(huán)境中特異抑制致病性效應(yīng)T細胞應(yīng)答、促使神經(jīng)細胞再生、療效好、治療后疾病不易復(fù)發(fā)而副作用小。


圖1:小鼠真皮間充質(zhì)干細胞的分離鑒定:
A，體外培養(yǎng)的真皮間充質(zhì)干細胞；
B，真皮間充質(zhì)干細胞的成骨誘導(dǎo)分化；
C，真皮間充質(zhì)干細胞的成脂誘導(dǎo)分化。_
圖2:小鼠的同體皮膚間充質(zhì)干細胞抑制效應(yīng)T細胞免疫應(yīng)答:
A,同體骨髓間充質(zhì)干細胞(autologous bone marrow mesenchymal stem cells)與 T細共培養(yǎng)3天，有11.5% T細胞分裂增殖；
B，同體皮膚間充質(zhì)干細胞(autologous skin-derived mesenchymal stem cells)與T細共培養(yǎng)3天，有19.6% T細胞分裂增殖；
D,T細胞單獨培養(yǎng)有85.0%的分裂增殖；
E,沒有用ant1-⑶3和ant1-⑶28抗體刺激的T細胞幾乎沒有分裂增值。這個預(yù)備實驗說明了和骨髓間充質(zhì)干細胞一樣同體皮膚間充質(zhì)干細胞均可以在體外抑制抗體刺激下的T細胞分裂增殖。圖3:小鼠同體皮膚間充質(zhì)干細胞對小鼠的EAE的治療效果明顯:
淺色點狀線條:同 體皮膚間充質(zhì)干細胞治療小鼠EAE30天的評分；
深色點狀線條:只注射PBS的對照小鼠EAE30天的評分。采用5分評分法，EAE評分標(biāo)準(zhǔn)如下:0分為不發(fā)病；1分為尾巴無力；2分為輕微后肢無力；3分為嚴(yán)重后肢癱瘓；4分為四肢癱瘓；5分為瀕臨死亡或死亡。
具體實施例方式1.小鼠真皮間充質(zhì)干細胞的分離
取出生3天左右的新生小鼠，引頸處死，酒精消毒，剪取背部皮膚置于0.25%的dispase酶中，4°C消化過夜，PBS液清洗3次，剝?nèi)ケ砥?，將真皮置?.2%的膠原酶中消化一個小時，消化完成后再添加DNase I消化10到15分鐘，用PBS洗一遍，用滴管吹打成單細胞懸液，過濾除去大塊組織和碎片，接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)條件為DMEM (low glucose)+10%胎牛血清，370C，5%C02。培養(yǎng)6小時后，輕輕棄去懸浮細胞，將貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，待長滿瓶底大部分后，胰酶消化，常規(guī)傳代。取傳至第三代的細胞進行研究。2.小鼠真皮間充質(zhì)干細胞的鑒定
將體外培養(yǎng)的真皮間充質(zhì)干細胞胰酶消化后接種于不同的分化誘導(dǎo)體系中，培養(yǎng)3周后經(jīng)行組織染色，鑒定分化情況。向成骨細胞分化通過茜素紅染色；向脂肪細胞分化通過形態(tài)學(xué)觀察和油紅染色。3.小鼠的皮膚間充質(zhì)干細胞抑制效應(yīng)T細胞免疫應(yīng)答；
用細胞標(biāo)記物CFSE來標(biāo)記免疫磁珠分離的小鼠CD4+CD25— T細胞，與皮膚間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)(皮膚間充質(zhì)干細胞=T細胞為1:4);在共培養(yǎng)中用ant1-CD3和anti_CD28抗體刺激T細胞3天。CFSE標(biāo)記過的細胞的分裂增殖情況可以被流式細胞儀檢測。
4.小鼠皮膚間充質(zhì)干細胞對小鼠EAE的治療；
首先是建立EAE模型，在不完全弗氏佐劑中加入熱滅活結(jié)核分枝桿菌，即為完全弗氏佐劑，M0G35-55配成終濃度10mg/ml。小鼠分別于背側(cè)中線兩側(cè)2點皮下注射由M0G35-55與CFA按1:1混合乳化抗原。免疫當(dāng)天及第二天給小鼠尾靜脈注射百日咳毒素200ng/只，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生EAE。運用一定的方法分離從小鼠皮膚真皮中分離間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)至P3代。每只患病小鼠尾靜脈注射Γ IO6個皮膚間充質(zhì)干細胞，觀察30天且每天評分。5.皮膚間充質(zhì)干細胞對人類多發(fā)性硬化癥患者的治療。從人的皮膚中分離出皮膚間充質(zhì)干細胞，無菌環(huán)境下培養(yǎng)至P3代。每位患者靜脈注射5(T IO6個皮膚間充質(zhì) 干細胞進行治療。
權(quán)利要求
1.充質(zhì)干細胞在制備治療具有免疫調(diào)節(jié)功能的藥物中的應(yīng)用。
2.充質(zhì)干細胞在制備治療多發(fā)性硬化癥的藥物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的充質(zhì)干細胞在制備治療具有免疫調(diào)節(jié)功能的藥物中的應(yīng)用，其中所述的充質(zhì)干細胞來源于皮膚真皮層中。
4.權(quán)利要求2所述的充質(zhì)干細胞在制備治療多發(fā)性硬化癥的藥物中的應(yīng)用，其中所述的充質(zhì)干細胞來源于皮膚真皮層中。
5.權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其中所述的充質(zhì)干細胞通過下列方法提取:剪取背部皮膚置于dispase酶中，使用PBS液清洗，剝?nèi)ケ砥?，將真皮置于膠原酶中消化，完成后再添加DNase I消化，再用PBS洗一遍，用滴管吹打成單細胞懸液并過濾,接種于培養(yǎng)皿中，棄去懸浮細胞，將貼壁細胞繼 續(xù)培養(yǎng)，待長滿瓶底大部分后，胰酶消化，常規(guī)傳代。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供充質(zhì)干細胞在制備具有治療多發(fā)性硬化癥的藥物中的應(yīng)用，充質(zhì)干細胞能夠有效地抑制多發(fā)性硬化癥患者在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)過度活化的效應(yīng)T細胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)具特異性功能的調(diào)節(jié)性T細胞發(fā)生，分化成新的神經(jīng)細胞，從而修補受損的神經(jīng)組織而治療發(fā)性硬化癥患。這種應(yīng)用中涉及的皮膚間充質(zhì)干細胞取得容易、不具免疫排斥性、療效高、治療后疾病不易復(fù)發(fā)而副作用小的有益效果。
文檔編號C12N5/0775GK103191155SQ201210002750
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者王宏林 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院