專利名稱：人白細胞介素-10的高效表達方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種由生物技術(shù)制備人白細胞介素-10(hIL-10)的方法，特別涉及一種畢赤酵母高效表達hIL-10的載體的構(gòu)建方法和高效表達hi L-10菌株的篩選和建立。
背景技術(shù)：
hIL-10能抑制T細胞介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)和通過刺激B淋巴細胞反應(yīng)而參與體液免疫調(diào)節(jié)，具有良好的臨床應(yīng)用前景。目前已應(yīng)用于包括I型糖尿病、銀屑病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、丙型肝炎等多種免疫性疾病的臨床實驗研究。天然hIL-10主要由巨噬細胞產(chǎn)生的分子量為18.5KD，無糖基修飾，活性形式是由非共價鍵連接兩個單體而形成的同
源寡二聚體。國內(nèi)外對hIL-10作用機制及臨床治療疾病的應(yīng)用進行了廣泛而深入的研究，一方面確認了 hIL-10生物學(xué)功能，另一方面也擴展了其臨床應(yīng)用范圍；因此，市場對hIL-10的需要將越來愈大。目前國內(nèi)外已報道hIL-10的重組表達系統(tǒng)主要有Ecoli，CH0-Kl，還有一些研究人員使用植物葉片表達；使用酵母表達hIL-10的相關(guān)工作也很少，關(guān)鍵是難以大量得到具有天然活性的同源寡二聚體。國際市場上重組hIL-10非常昂貴，且國內(nèi)尚無企業(yè)生產(chǎn)。國際上商品化重組hIL-10主要是大腸桿菌來源的，具有161個氨基酸，比正常hIL-10多一個氨基酸，在治療上具有潛在的危害。而大腸桿菌主要以包涵體的形式表達hIL-10，是無生物學(xué)活性的蛋白復(fù)合物，且變復(fù)性過程復(fù)雜，回收率低，嚴重影響了 hIL-10的研究和應(yīng)用。本發(fā)明前，一些研究人員用invitrogen公司購買的常用畢赤酵母表達載體，如pPIC9K(劉立藏，馬輝文等. 人白細胞介素10(hIL10)在畢赤酵母中的表達.武漢大學(xué)學(xué)報，2004，50(2)和井申榮，鄒全明等.重組人白細胞介素10在畢赤酵母中的表達及生物學(xué)活性測定.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2005，25 (9))，pPICZ α A(陳富超，孫萬邦等.重組hIL-10在畢赤酵母X-33的表達及其生物活性鑒定.中國免疫學(xué)雜志，2011,27(8))等，轉(zhuǎn)化畢赤酵母表達菌株(如GS115, X-33等)，參照invitrogen公司推薦的畢赤酵母表達菌株的常規(guī)篩選方法。由于這些常規(guī)的的畢赤酵母表達載體獲得高拷貝菌株的幾率很低，而用PA0815載體(井申榮，鄒全明等.白細胞介素-10基因多拷貝表達盒的構(gòu)建及在畢赤酵母中的表達.中國生物制品學(xué)雜志，2007,20(2))的方法雖然也能獲得高拷貝菌株，但這種方法十分費時費力，且結(jié)果不佳和不容易實現(xiàn)。同時，常規(guī)的篩選高效表達菌株是在溫度為28-30°C下進行的，忽略了酵母分泌機制可能對重組蛋白表達的不利影響，導(dǎo)致外源表達蛋白在細胞內(nèi)儲留并造成酵母細胞生存力影響。因此，利用常規(guī)的篩選方法未能獲得hIL-10的高效表達菌株。

發(fā)明內(nèi)容
1.本發(fā)明的技術(shù)方案
本發(fā)明一方面提供一種適用于酵母高效表達外源重組蛋白的方法，以及用于該方法的表達載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明另一方面提供一種hIL-10的酵母表達方法，以及用于所述方法的載體的構(gòu)建方法。具體而言，本發(fā)明一方面提供用于在酵母中表達外源蛋白的方法，其包括下述步驟:I)構(gòu)建表達載體，所述表達載體包含rDNA非編碼區(qū)，抗生素抗性基因，分泌信號肽和外源蛋白的編碼序列；2)逐步增加抗生素的濃度，從而擴增所述表達載體的拷貝數(shù)，構(gòu)建含有不同拷貝數(shù)的克隆的庫；3)選擇表達克隆，表達并回收外源蛋白。在本發(fā)明的一個實施方案中，所表達的外源蛋白優(yōu)選地是人白細胞介素-10。在本發(fā)明這一方面，利用rDNA在畢赤酵母基因組中的多拷貝特性，設(shè)計以rDNA的非編碼區(qū)為整合 位點，可以在同一個克隆中同時轉(zhuǎn)入多個表達載體，從而有利于獲得外源基因的高效表達；同時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過逐步增加抗生素的濃度，擴增所述表達載體的拷貝數(shù)，然后構(gòu)建含有不同拷貝數(shù)的克隆的庫，在此基礎(chǔ)上選擇表達克隆，可以容易地獲得高拷貝菌株，進而表達和回收外源蛋白。優(yōu)選地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)選擇分散在酵母的4條染色體上的rDNA非編碼區(qū)，可以在同一個克隆中同時轉(zhuǎn)入多個表達載體，有利于獲得外源基因的高效表達。更優(yōu)選地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用序列為SEQ ID No:1的rDNA非編碼區(qū)有利于高效地將外源基因的多個表達載體同時轉(zhuǎn)入到一個克隆中，并且轉(zhuǎn)化得到的高拷貝克隆穩(wěn)定性好，可以容易地獲得聞效表達的菌株。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述方法進一步包括低溫下甲醇誘導(dǎo)外源蛋白分泌表達。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述方法還包括比較酵母胞內(nèi)外源蛋白的量與分泌到上清中的外源蛋白的量的相對比例關(guān)系，從而選擇表達克隆，表達并回收外源蛋白。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過低溫(20°C)下比較酵母胞內(nèi)滯留的hIL-10與分泌到上清中hIL-10的量的相對比例關(guān)系，非常有效地避免了大量錯誤折疊的hIL-10蛋白在酵母胞內(nèi)滯留而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，保證了甲醇誘導(dǎo)下hIL-10表達菌株處于最佳活力狀態(tài)，同時有效地防止了真正的hIL-10高效表達克隆的落選。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)低溫下甲醇誘導(dǎo)hIL-10分泌表達可以顯著提高上清中hIL-10的表達比例。在本發(fā)明的一個實施方案中，低溫下甲醇誘導(dǎo)hIL-10分泌表達獲得的上清蛋白/胞內(nèi)蛋白的比例為1.3倍。在本發(fā)明的一個實施方案中，低溫下甲醇誘導(dǎo)hIL-10分泌表達獲得的上清蛋白/胞內(nèi)蛋白的比例為至少2倍，優(yōu)選為至少3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍等等。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，低溫下甲醇誘導(dǎo)hIL-10分泌表達獲得的上清蛋白/胞內(nèi)蛋白的比例為至少6倍。在本發(fā)明的一個實施方案中，所用的外源蛋白的編碼序列是未經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所用的外源蛋白的編碼序列是經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列。對編碼序列進行優(yōu)化以利于在宿主細胞中表達的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在本發(fā)明的方法中可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種合適的分泌信號肽，其包括但不限于α-因子、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、血清白蛋白分泌信號肽。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述分泌信號肽是α -因子分泌信號肽。本發(fā)明還一方面涉及在本發(fā)明所述的方法中構(gòu)建的表達載體。本發(fā)明再一方面涉及包含本發(fā)明的表達載體的酵母菌株。本發(fā)明又一方面涉及本發(fā)明的表達載體和本發(fā)明的酵母菌株用于表達人白細胞介素-10的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案示例性地說明如下。2.本發(fā)明的技術(shù)方案的示例性說明2.1)以pPICZca A載體為框架，再整合進畢赤酵母基因組中的rDNA-非編碼區(qū)片段，構(gòu)建出PUCZ9K載體。2.2)分別將α -交配因子-pre-pro序列與hIL_10編碼序列的N端融合，同時在hIL-10的C端引入His-tag,并將融合好的蛋白編碼序列插入pUCZ9K載體中，最后構(gòu)建了以α -交配因子-pre-pro序列為分泌信號肽的hIL-10-His高效表達載體。再利用PUCZ9K載體中的rDNA-非編碼區(qū)片段為整合位點，并通過逐步增加Zeocin的濃度(0.1mg/ml, 0.5mg/ml, 1.0mg/ml, 2.0mg/ml, 3.0mg/ml, 5.0mg/ml)來進行表達載體拷貝數(shù)的擴增，最終實現(xiàn)快速地獲得含有不同拷貝數(shù)的單克隆的庫。用Realtime PCR的方法鑒定單克隆庫中的不同克隆的拷貝數(shù)。再用低溫(20°C )下的甲醇誘導(dǎo)hIL-10表達，并以表達上清和菌體胞內(nèi)的hIL-10蛋白的相對量為評價標(biāo)準(zhǔn)，從不同拷貝數(shù)的克隆的庫中篩選出具有產(chǎn)業(yè)化價值的hIL-10高效表達菌 株。其中，酵母菌種可以采用X-33等常規(guī)畢赤酵母菌株。IL-10基因編碼序列可以采用未經(jīng)密碼子優(yōu)化或密碼子優(yōu)化后的序列。IL-10的分泌信號肽可以采用最為常用的α -交配因子，也可以選擇α -淀粉酶，葡糖淀粉酶，血清白蛋白等常規(guī)信號肽。3.本發(fā)明的技術(shù)效果采用rDNA的非編碼區(qū)為插入位點；用逐步增加Zeocin的濃度(0.lmg/ml,0.5mg/ml, 1.0mg/ml, 2.0mg/ml, 3.0mg/ml, 5.0mg/ml)來擴增陽性克隆中hIL-10表達載體的拷貝數(shù)；利用低溫(20°C )下甲醇誘導(dǎo)hIL-10分泌表達來進行高效表達菌株的篩選，這些是本發(fā)明特有的區(qū)別特征。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是利用rDNA在畢赤酵母基因組中的多拷貝特性，設(shè)計了以rDNA的非編碼區(qū)為整合位點，大大增加了同一個克隆中同時轉(zhuǎn)入多個表達載體的幾率，同時這種重復(fù)的rDNA非編碼區(qū)分散在畢赤酵母的4條染色體上，使轉(zhuǎn)化得到的高拷貝克隆具有穩(wěn)定性好的特性。同時，對這些陽性克隆用Zeocin的加壓進一步擴增拷貝數(shù)的方法，非常方便的獲得了一個含有不同拷貝數(shù)的克隆的庫。此外，采用低溫下甲醇誘導(dǎo)hIL-10蛋白表達的方式，比較酵母胞內(nèi)滯留的hIL-10與分泌到上清中hIL-10的量的相對比例關(guān)系，非常有效地避免了大量錯誤折疊的hIL-10蛋白在酵母胞內(nèi)滯留而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，保證了甲醇誘導(dǎo)下hIL-10表達菌株處于最佳活力狀態(tài)，同時有效地防止了真正的hIL-10高效表達克隆的落選，使篩選出來的克隆是真正的具有高效分泌表達hIL-10潛能的克隆，為下一步的發(fā)酵優(yōu)化提供了良好的基礎(chǔ)。


圖1質(zhì)粒pUCZ的構(gòu)建流程圖；圖2rDNA非編碼區(qū)片段的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖；圖35’ A0X-MCS-3’ AOX與rDNA非編碼區(qū)片段的重疊延伸PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖；圖4畢赤酵母高效表達載體PUCZ9K的構(gòu)建流程圖；圖5畢赤酵母高效表達載體PUCZ9K的質(zhì)粒圖譜；圖6hIL_10/pUCZ9K的構(gòu)建流程·
圖7Zeocin加壓擴增表達載體的方法；圖8酵母基因組抽提后的電泳結(jié)果圖；圖9還原條件下聚丙烯酰胺凝膠電泳后的Western Blot結(jié)果,3個陽性轉(zhuǎn)化克隆在20度和30度下同時誘導(dǎo)表達，并同時檢測畢赤酵母胞內(nèi)和分泌上清中的hL-10。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的所有弓I物合成均由上海生工完成。實施例1、畢赤酵母高效表達載體PUCZ9K的構(gòu)建，具體過程包括以下步驟:1.UpUCZ質(zhì)粒的構(gòu)建以pUC19質(zhì)粒(購自寶生物工程)為模板進行PCR擴增多克隆位點(MCS)，并在其兩端各引入I個BglII位點JfpPICZaA質(zhì)粒用BamHI和BglII雙酶切回收TEF1-EM7-Zeoc in-CYC I TT-pUC or i片段，與用Bgl II酶切回收后的MCS片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5ci (購自寶生物工程)，篩選陽性重組子。陽性重組質(zhì)粒委托英俊公司測序，結(jié)果表明MCS片段與TEFl-EM7-Zeocin-CYClTT-pUCori序列正確連接且序列正確，并命名為pUCZ，構(gòu)建流程見圖1。1.2、pUCZ9K重組質(zhì)粒的構(gòu)建以提取的質(zhì)粒pPIC9K(購自Invitrogen公司)為模板進行PCR擴增5’A0X-MCS-3’A0X片段，同時以GS115菌株(購自Invitrogen公司)的基因組為模板進行PCR擴增rDNA-非編碼區(qū)SEQ ID No:1(見圖2)，所用引物序列為:NTS-rDNA-Fw:5’ GTTTCGCTGGAAGGGGAACTTTAGA 3’ ；NTS-rDNA-Rv:5’ CAAAGACCAACCGAAAGCCGACGA 3’ ；rDNA 非編碼區(qū)序列 SEQ ID No:l(1153bp):GTTTCGCTGGAAGGGGAACTTTAGATTACAGGGCAAACATGCAAATCCCAGGCGGGGAAAGCGCTGATTTCTGCGGTTCAGGCCCTGATCCGGAGTTTGAGAACCCCAACATCAGAATACACCAAAATGGGTTGAGGTGGTGAATGCTATGTAGTGAACGCTTATGTAAGTGAGCACTTATGTAAGCGGTTGACCATTATGTAAGCTTGTGGTTTACGTAAACTGTTATGTAAGCTTTGACCATTATGTAAGCTTGTGGTTTACGTAAACTGTTATGTAAGCTTTGACCATTATGTAAGCTTGTGGTTTACGTAAACTGTTATGTAAGCTTTGACCATTATGTAAGCTTGTGGTTTACGTAAACTGTTATGTAAGCTTT
GGCCATTATGTAAGCTTTAAACACTTATGTAAGCTCGAGCCCAGTATGTAAGCAGATTGACCCATTATGTAAGCTTTGAACACTTATGTAAGCTCGAAACCGGTTAGGTAAGCAGCTTTGTAAGCAATCTGGACAATTATGTAAGCGGGTTACGTAAACAGTTATGTAAGCAGAAAAATTTCAAACGACAAAACTTGGGGTCTACAGACACAGTAGCCAGAAGATTGCACTACCATTCGACTCCTCATGACCCACTCTTTCGATCCATGTAGTTAGGTTACCGTTTTTCCTAATATTTAAGGATGTTGAAAATTCATTTTCATTTTTTTCGTTTTTAAGATTTTCTCACAACTCTTCCAAAGATTACTAGTTGACTTTTCAAATATTTAGGGTATTTTTCTCACTTTTTCCTAGCAAACTCCAATTGGTGGGTTCAGTGCAATGGAGTATCACCTTGCAACCACAACGTAATAGCTAACTTGTGGCCACCATGTCTGGTTGTAGAGATAATTGGATTCTAATGTGGATCACATGACTACTCACGTGTCAAAAACCCAACCTGACTTGGCCCAGCTTAGCAAGAATATTTCGAATCCACTCTTGTGGCCTAGTGGACAACTGGGAA AGCTTGCGACGCAGTCGTTTTTGGCGATCCAGGCGTAGTACTAGGTTCGAGCCTGGTCATTCAGATGGCTCAGAACTTGAGGTTGACTGAGTTCCAGGTTCGAGTCCAGGACGGGTTGGTTGGTGTCGTCGGCTTTCGGTTGGTCTTTG再用重疊延伸PCR的方法把5’ A0X-MCS-3’ AOX與rDNA非編碼區(qū)片段連接起來(見圖3)，并在其兩端分別引入XbaI和KpnI酶切位點。整個構(gòu)建流程見圖4，所用引物序列為:Ppic9k-5，AOX-Xbal-Fw:5，GCTCTAGAAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGG 3，Ppic9k-3，AOX-Rv:5，CCCTTCCAGCGAAACAAGCTTGCACAAACGAACTTCTCAC 3，NTS-rDNA-Fw:5 ’ CGTTTGTGCAAGCTTGTTTCGCTGGAAGGGGAACTTTAGA 3’NTS-rDNA-Kpnl-Rv:5’ GGGGTACCCAAAGACCAACCGAAAGCCGACGA 3’用Kpn I和Xba I雙酶切5’ A0X-MCS-3’ AOXtDNA非編碼區(qū)片段并回收，再與同樣雙酶切的pUCZ質(zhì)粒的回收產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，篩選陽性重組子。陽性重組質(zhì)粒委托英俊公司測序，結(jié)果表明5’ A0X-MCS-3’ AOX-rDNA非編碼區(qū)片段正確插入PUCZ質(zhì)粒且序列正確，并命名為PUCZ9K，質(zhì)粒圖譜見圖5。5’ AOX-MCS-3’ AOX-rDNA 全長序列:TCTAGAAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAACCTTTTTGCCATCCGACATCCACAGGTCCATTCTCACACATAAGTGCCAAACGCAACAGGAGGGGATACACTAGCAGCAGACCGTTGCAAACGCAGGACCTCCACTCCTCTTCTCCTCAACACCCACTTTTGCCATCGAAAAACCAGCCCAGTTATTGGGCTTGATTGGAGCTCGCTCATTCCAATTCCTTCTATTAGGCTACTAACACCATGACTTTATTAGCCTGTCTATCCTGGCCCCCCTGGCGAGGTTCATGTTTGTTTATTTCCGAATGCAACAAGCTCCGCATTACACCCGAACATCACTCCAGATGAGGGCTTTCTGAGTGTGGGGTCAAATAGTTTCATGTTCCCCAAATGGCCCAAAACTGACAGTTTAAACGCTGTCTTGGAACCTAATATGACAAAAGCGTGATCTCATCCAAGATGAA
權(quán)利要求
1.用于在酵母中表達外源蛋白的方法，其包括下述步驟: 1)構(gòu)建表達載體，所述表達載體包含rDNA非編碼區(qū)，抗生素抗性基因，分泌信號肽和外源蛋白的編碼序列； 2)逐步增加抗生素的濃度，從而擴增所述表達載體的拷貝數(shù)，構(gòu)建含有不同拷貝數(shù)的克隆的庫； 3)選擇表達克隆，表達并回收外源蛋白。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述rDNA非編碼區(qū)在酵母基因組中具有多拷貝特性，分散在酵母的4條染色體上。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述rDNA非編碼區(qū)序列為SEQID No:1。
4.權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其進一步包括低溫下甲醇誘導(dǎo)外源蛋白分泌表達。
5.權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其還包括比較酵母胞內(nèi)外源蛋白的量與分泌到上清中的外源蛋白的量的相對比例關(guān)系，從而選擇表達克隆，表達并回收外源蛋白。
6.權(quán)利要 求1-5中任意一項所述的方法，其中所述外源蛋白的編碼序列是未經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列或者是經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列，優(yōu)選地所述外源蛋白是人白細胞介素-10。
7.權(quán)利要求1-6中任意一項所述的方法，其中所述分泌信號肽包括α-因子、α -淀粉酶、葡糖淀粉酶、血清白蛋白分泌信號肽。
8.權(quán)利要求1-7中任意一項所述的方法中構(gòu)建的表達載體。
9.包含權(quán)利要求8所述的表達載體的酵母菌株。
10.權(quán)利要求8所述的表達載體和權(quán)利要求9所述的酵母菌株用于表達人白細胞介素-10的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及人白細胞介素-10的高效表達方法。具體而言，本發(fā)明提供用于在酵母中表達外源蛋白的方法，其包括下述步驟1)構(gòu)建表達載體，所述表達載體包含rDNA非編碼區(qū)，抗生素抗性基因，分泌信號肽和外源蛋白的編碼序列；2)逐步增加抗生素的濃度，從而擴增所述表達載體的拷貝數(shù)，構(gòu)建含有不同拷貝數(shù)的克隆的庫；3)選擇表達克隆，表達并回收外源蛋白。所述外源蛋白優(yōu)選為人白細胞介素-10。本發(fā)明還涉及用于本發(fā)明的方法的表達載體，包含本發(fā)明的表達載體的酵母菌株，以及本發(fā)明的表達載體和酵母菌株的用途。通過本發(fā)明的方法可以容易地獲得具有產(chǎn)業(yè)化價值的hIL-10高效表達菌株，進而表達回收人白細胞介素-10。
文檔編號C12R1/84GK103194480SQ20121000377
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者肖衛(wèi)華, 鐘永軍, 田志剛, 郭雨剛, 李光偉, 沈翼, 張國英 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)