專利名稱：一種降解苯酚的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物菌種構(gòu)建領(lǐng)域，尤其是一種降解苯酚的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
苯酚是ー種有毒有機(jī)的化工原料，是エ業(yè)廢水廢渣中的主要污染物，我國把苯酚列入嚴(yán)重污染環(huán)境和危害人體健康優(yōu)先污染物的“黑名単”之中。 目前，采用微生物降解含酚廢水因耗能少、成本較低、二次污染少等優(yōu)點(diǎn)成為了處理含酚廢水的常用的方法之一。研究學(xué)者從自然界中篩選分離出來能夠降解苯酚的高效微生物菌種，通過研究其降解特性、降解條件、對苯酚的耐受性以及降解效率，進(jìn)而有針對性地將菌劑投入到污水處理系統(tǒng)中，得到較好的處理效果。楊彥希等從煉油廠附近嚴(yán)重污染的廢水和土壌中通過富集分離篩選到12株絲孢酵母及假絲酵母，這12株菌都能夠以苯酚為唯一碳源生長，24-28h內(nèi)降解苯酚質(zhì)量濃度可高達(dá)1200mg/L,其中一菌株降解苯酹質(zhì)量濃度最高可達(dá)1700mg/L。袁麗娟等從ー絕緣材料廠的污水中分離得到一株可高效降解苯酹的菌株Bacillus simplex JY01,在接種量為2%，pH為6. 0-9. 0，溫度為18°C _36°C的條件下，在30h內(nèi)，當(dāng)苯酚濃度為IlOOmg/L和1300mg/L時，其降解率分別為99. 16%和74. 76%。顯然，通過篩選菌株，引入高降解活性菌株能夠提高含酚廢水的降解率，其意義是重大的。但是對于這些難降解的污染物，僅靠自然界中的微生物有時是不夠的，如何使這些優(yōu)良菌株長期地在生物處理系統(tǒng)中占優(yōu)勢，并保持其高降解活性是我們需要解決的主要問題，而且提高降解速率是生物處理含酚廢水的ー個關(guān)鍵問題，其中向微生物中引入編碼相應(yīng)酶的基因進(jìn)行菌株改造，是解決這ー問題的主要途徑，也可以說工程菌的構(gòu)建前景是肯定的。微生物好氧降解苯酚的代謝過程是微生物利用苯酚羥化酶將苯酚氧化為鄰苯ニ酚，鄰苯ニ酚由鄰位和間位途徑經(jīng)環(huán)裂解最終形成こ酰輔酶A、琥珀酸、丙酮酸等，這些產(chǎn)物進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)，繼續(xù)被微生物利用，一部分生成細(xì)胞物質(zhì)，另一部分則被氧化分解為ニ氧化碳和水，提供微生物新陳代謝作需的能量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種降解苯酚的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明從銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa PAOl中克隆的苯酹羥化酶基因，通過克隆、表達(dá)苯酚羥化酶基因構(gòu)建苯酚降解菌工程菌。本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種降解苯酚的基因工程菌，含有苯酚羥化酶基因。而且,所述苯酹輕化酶基因來自銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa PA01。而且，所述基因工程菌的宿主菌為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis DB1342。一種降解苯酚的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于步驟如下
(I) PCR擴(kuò)增苯酚羥化酶基因從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索出銅綠假單胞桿菌PAOl中苯酚羥化酶大亞基N的基因保守序列，利用DNAMAN軟件設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增獲得目的片段，正向引物見序列I，反向引物見序列2，PCR擴(kuò)增獲得苯酚羥化酶基因；(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建用BamHI和SalI進(jìn)行雙酶切PCR產(chǎn)物，與同樣經(jīng)過BamHI和SalI雙酶切的克隆表達(dá)載體PWB980相連接；⑶轉(zhuǎn)化將步驟(2)的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli DH5a感受態(tài)中，取150 μ L轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，涂布于 包含卡那霉素的LB平板上，370C，210-230rpm過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，分裝含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37°C，210-230rpm培養(yǎng)8-15h，提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及酶切鑒定目的片段已經(jīng)插入了載體，將驗(yàn)證成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis DB1342中，獲得降解苯酚的基因工程菌。一種降解苯酚的基因工程菌在降解苯酚中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是I、本發(fā)明從銅綠假單胞桿菌Pseudomonas aeruginosaPAOl基因組中克隆到一個編碼苯酚羥化酶基因，通過DNA重組技術(shù)在體外克隆表達(dá)構(gòu)建得到苯酚降解菌，并進(jìn)一歩驗(yàn)證本重組菌降酚特性，獲得了對苯酚的具有較強(qiáng)降解能力的遺傳工程菌，這將對苯酚降解菌的エ業(yè)化生產(chǎn)提供新的理論依據(jù)。2、本發(fā)明中表達(dá)的苯酚羥化酶是苯酚降解過程中關(guān)鍵酶，通過克隆和表達(dá)苯酚羥化酶基因獲得降解苯酚的工程菌，為酶法或生物法高效降解苯酚提供了很好的實(shí)現(xiàn)途徑。3、本發(fā)明構(gòu)建的重組菌對各種濃度的苯酚皆有較好的降解能力，在35h內(nèi)重組菌對濃度為 300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L 苯酚的降酚率分別為100%,100%,100%,98. 87%,85. 24%,78. 11%。


圖I 為本發(fā)明 PCR 擴(kuò)增結(jié)果，其中 M :100bp DNA Markerl, 2, 3,4, 5PCR product ；圖2為本發(fā)明枯草芽孢桿菌表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析，其中，M :Protein marker,I :空白菌發(fā)酵上清液，2 :重組菌發(fā)酵上清液。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例中涉及的百分比如果無特殊標(biāo)明，均為重量百分比。一種降解苯酚的基因工程菌，構(gòu)建方法如下I、PCR擴(kuò)增苯酚羥化酶基因從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索出銅綠假單胞桿菌PAOl中苯酚羥化酶大亞基N的基因保守序列，利用DNAMAN軟件設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增獲得目的片段。(I)設(shè)計如下引物
正向引物CGCGGATCCATGAAGCTGTACGCCATTTTTGATGCCTTC
該引物含有BamH I限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)；反向引物ACGCGTCGACGGTAGCCGCGCCAGAACCATTTGTC該引物含有Sal I限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)；(2) PCR反應(yīng)體系均為50 μ I :10 X 緩沖液 buffer :5 μ L ;上游引物I μ L ;下游引物I μ L ；dNTP : I μ L ;模板I μ L ；Taq 酶0. 5 μ L ；ddH20 :40. 5 μ L ⑶PCR 程序①94°C IOmin②②5 個循環(huán)94°C lmin, 58°C Imin, 72°C Imin ;5 個循環(huán)94°C lmin, 57°C lmin,72°C lmin ;25 個循環(huán)94で lmin,56°C lmin,72°C lmin③72°C IOmin(4)PCR產(chǎn)物確定將上述得到的PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時加上IOObp Ladder對PCR產(chǎn)物進(jìn)行初歩鑒定測序，確定是否得到正確的目的片段。經(jīng)電泳分析，在約600bp左右出現(xiàn)I條特異性條帶，大小與預(yù)期值相符(圖I)。切膠回收純化目的片段并進(jìn)行測序，測序結(jié)果與NCBI苯酚羥化酶基因(注冊號GQ396163. I)進(jìn)行比對。結(jié)果表明目的基因全長為601bp，而且序列與所報道的序列一致，已經(jīng)成功擴(kuò)增出目的片段。2、重組質(zhì)粒的構(gòu)建用BamH I和Sal I進(jìn)行雙酶切PCR產(chǎn)物，與同樣經(jīng)過BamH I和Sal I雙酶切的克隆表達(dá)載體PWB980相連接，連接反應(yīng)體系(10 μ L)如下無菌水5 μ L，10 X緩沖液buffer I μ L pffB980載體(25ng/ μ L) :2 μ L，新鮮PCR產(chǎn)物I μ L，T4DNA連接酶I μし此反應(yīng)操作在冰上進(jìn)行，將反應(yīng)產(chǎn)物置于16°C，過夜。3、轉(zhuǎn)化將步驟2的連接產(chǎn)物通過化學(xué)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入E. coli DH5 α。其具體步驟為①在冰上融化Ε. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞用移液器吸取10 μ I連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，用槍頭輕柔攪拌混勻②冰浴30min，42°C熱激細(xì)胞90s，不要搖動，請移至冰?、勖總€反應(yīng)中加入800 μ ILB培養(yǎng)基，在37°C搖床中，以220rpm的轉(zhuǎn)速水平振蕩Ih④取150 μ L轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，涂布于包含50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)，⑤挑取單菌落，分別接種于含有50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 °C，220rpm培養(yǎng)10h，提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及雙酶切鑒定目的片段已經(jīng)成功插入了表達(dá)載體。將驗(yàn)證成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis DB1342)中。其中枯草芽孢桿菌((Bacillus subtilis DB1342)感受態(tài)制備方法及所用培養(yǎng)基如下(I)枯草芽孢桿菌感受態(tài)制備用貯存液IOX Spizizen salts母液15%K2HPO4 ·3Η20，0· 6% KH2PO4, 2% (NH4)2SO4,0. 2% MgSO4,1 % 檸檬酸鈉，溶于蒸餾水中。115°C,6. 6 X IO4Pa高壓滅菌20min，室溫貯存。10%酵母粉、I %水解酪蛋白和25mmol/LMgCl2，6.6X104Pa高壓滅菌；20%葡萄糖、025%組氨酸和O. ImoVLCaCl2，用O. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌待用。⑵枯草芽孢桿菌感受態(tài)制備用培養(yǎng)基IOmL GMI ImLlOXSpizizen salts,O. lmL10%酵母粉，O. 25mL20%葡萄糖，O. 2mLl %水解酪蛋白，O. 2mL0. 25%組基酸，補(bǔ)充滅菌蒸懼水至總體積10mL。10mT ,GMT T ImLlO X Spizizen salts, 0/05mL10 % 酵母粉，O. 25mL20 % 葡萄糖，O. 04mLl % 水解酪蛋白，O. 2mL0. 25 % 組氨酸，O. 05mL0. lmol/LCaCl2, lmL25mmol/LMgCl2，補(bǔ)充滅菌蒸餾水至總體積10mL。(3)枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備方法挑取一新鮮培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis DB1342)單菌落接種于2. 5mLGMI培養(yǎng)基中，30°C 130_150r/min振蕩培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)物按10%接種量接種于
2.5mL新鮮的GMI中，37°C 200_230r/min振蕩培養(yǎng)3. 5h ;再以10%接種量將培養(yǎng)物接種于5mLGM II中進(jìn)行第二次傳代，37°C，200_230r/min振蕩培養(yǎng)90min ;取ImL培養(yǎng)物，5000r/min室溫離心5min，用1/10體積上清液重新懸浮細(xì)菌沉淀，即為枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞。(4)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化取驗(yàn)證成功重組質(zhì)粒加至上述所制的枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞懸液中，至終濃度lg/mL，質(zhì)粒體積不超過感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的1/20，混勻。37°C水浴中靜置30_60min，37°C 200r/min振蕩培養(yǎng)2_4h，取150 μ L轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，涂布于包含50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置過夜培養(yǎng)(李瑞芳，薛雯雯，黃亮等，枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法研究。生物技術(shù)通報[J]，2011 (5) :227-230)。4、重組質(zhì)粒的高效表達(dá)及SDS-PAGE電泳分析挑取含所需質(zhì)粒的單菌落至5mL含有50 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37で、220rpm振蕩過夜培養(yǎng)，次日以3%接種量接種于200mL含有50 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至菌液濃度OD6tltl = O. 7-1. O時，用濃度為O. 4mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，未誘導(dǎo)菌作對照，25°C誘導(dǎo)表達(dá)14h,取ImL菌液于12000r/min離心2min收集上清液，同樣的程序做空白菌(枯草芽孢桿菌DB1342)的對照，各取重組菌和空白菌上清10 μ I分別與10 μ I上樣緩沖液混合，沸水浴lOmin，離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE (12%分離膠、5%濃縮膠)電泳檢測蛋白表達(dá)情況(圖2)。由圖2的SDS-PAGE電泳分析表明，重組菌上清在22kDa處出現(xiàn)一條特異性條帶，與預(yù)期苯酚羥化酶分子量大小相符，而空白菌在22kDa處無條帶，說明了苯酚羥化酶基因在枯草芽孢桿菌中得到了表達(dá)。5、重組菌耐酚能力及降酚能力的測定將含有苯酚羥化酶基因的重組枯草芽孢桿菌接種于20mL的LB培養(yǎng)液中，37°C、200r/min過夜搖培，再以2 %的接種量接種到50mL分別含300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L苯酚的唯一碳源培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基具體成分為=KH2PO4O. 5g，K2HPO4O. 5g, MgSO4 · 7Η200· 2g, CaCl2O. lg, MnSO4 · H2OO. 03g, FeSO4 · 7H200. 03g, NH4NO3L Og加水到1L，根據(jù)所需添加不同苯酚量)同時以不加菌的相同培養(yǎng)基作為對照，37°C、200r/min搖培，每隔5h取5mL樣品測定苯酚的含量，來考査重組菌對苯酚的降解能力及耐受力。 苯酚含量的測定方法采用4-氨基安替吡啉直接吸光光度法。
測定結(jié)果表明，重組菌對各種濃度的苯酚皆有較好的降解能力。在35h內(nèi)重組菌對濃度為 300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L 苯酚的降酚率分別為100%,100%,100%,98. 87%,85. 24%,78. 11%。同時也測定了枯草芽孢桿菌((Bacillussubtilis DB1342)對苯酚的降解率，發(fā)現(xiàn)該菌對苯酚的利用率特別低，在含有苯酚的唯一碳源培養(yǎng)基中幾乎不能生長。說明經(jīng)過改造的菌株除了具有本身的ー些特性外，還獲得了降解苯酚能力的新性狀，而且該菌株比一些通過富集、分離、篩選得到的降解苯酚優(yōu)勢菌具有更強(qiáng)的降酚能力及耐受性。經(jīng)過檢測本重組菌株對苯酚的耐受性高于2000mg/L，而且在35h內(nèi)對2000mg/L苯酚的降解率高達(dá)78. 11%。、與本發(fā)明相關(guān)的對比菌的苯酚降解情況I、劉惠、叢燕燕、葉瑤等利用梯度壓力馴化篩選法從油田污泥中得到一株革蘭氏陰性苯酚降解菌PHE-2，該菌株對苯酚濃度為400mg/L的苯酚降解率在26h后達(dá)到80%以上,38h后達(dá)99%以上,該菌能耐受的最高苯酹濃度為500mg/L,當(dāng)苯酹濃度大于500mg/L時，該菌的生長受到抑制，但對苯酚的降解能力仍較強(qiáng)(劉惠、叢燕燕、葉瑤，趙孝保，顧中鑄.油田污泥中苯酚降解率的篩選及降解苯酚研究.中國給水排水，2009，25 (19)88-90.)。2、潘利華，姜紹通，劉鵬達(dá)等從某印染廠下水道的污泥中分離到ー株能高效降解苯酹的菌株P(guān)hl6,經(jīng)初步鑒定為微球菌屬(Micrococcus sp.)。該菌株最高可耐受I. 5g/L左右的苯酹，該菌降解苯酹最適條件為Ph7. O,溫度35°C,苯酹濃度I. Og/L,時間36h,通氣有利于苯酚的降解，降解率可達(dá)99. 6% (潘利華，姜紹通，劉鵬達(dá)，李慧星.苯酚降解菌的篩選及其降解特性的初步研究[J].微生物學(xué)通報，2003，30 (5) :78-81.)。3、何曉麗，陳晨，傅盈盈等從勝利油田河口采油廠的飛雁灘油田土壤樣品中分離得到一株能夠利用并降解苯酚的菌株P(guān)2。通過苯酚降解實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該菌能在30°C，192h內(nèi)完全降解500mg/L的苯酚(何曉麗，陳晨，傅盈盈，陳璐等.一株苯酚降解菌的篩選及其降解特性的初步研究[J].生物學(xué)雜志，2010，I (27) :31-35.)。通過以上數(shù)據(jù)對比可得該重組菌株在對苯酚的降解能力及耐受性方面具有優(yōu)勢，這將為采用生物方法處理含酚廢水提供可靠的方法，對苯酚降解菌的エ業(yè)化生產(chǎn)提供新的理論依據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種降解苯酚的基因工程菌，其特征在于含有苯酚羥化酶基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的降解苯酚的基因工程菌，其特征在于所述苯酚羥化酶基因來自銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa PAOl。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的降解苯酚的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌的宿主菌為枯草芽抱桿菌Bacillus subtilis DB1342。
4.一種如權(quán)利要求I或2或3所述的降解苯酚的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于步驟如下 (1)PCR擴(kuò)增苯酚羥化酶基因 從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索出銅綠假單胞桿菌PAOl中苯酚羥化酶大亞基N的基因保守序列，利用DNAMAN軟件設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增獲得目的片段，正向引物見序列1，反向引物見序列2，PCR擴(kuò)增獲得苯酚羥化酶基因； (2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用BamH I和Sal I進(jìn)行雙酶切PCR產(chǎn)物，與同樣經(jīng)過BamH I和Sal I雙酶切的克隆表達(dá)載體PWB980相連接； (3)轉(zhuǎn)化 將步驟(2)的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli DH5a感受態(tài)中，取150 ii L轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，涂布于包含卡那霉素的LB平板上，30-450C，210-230rpm過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，分裝含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，30-450C，210-230rpm培養(yǎng)8_15h，提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及酶切鑒定目的片段已經(jīng)插入了載體，將驗(yàn)證成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisDB 1342中，獲得降解苯酚的基因工程菌。
5.一種權(quán)利要求I所述的降解苯酚的基因工程菌在降解苯酚中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降解苯酚的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，含有銅綠假單胞桿菌PA01中苯酚羥化酶大亞基N的基因保守序，構(gòu)建步驟包括(l)PCR擴(kuò)增苯酚羥化酶基因；(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建；(3)轉(zhuǎn)化，還包括其在降解苯酚中的應(yīng)用。本發(fā)明從銅綠假單胞桿菌Pseudomonas aeruginosa PA01基因組中克隆到一個編碼苯酚羥化酶基因，通過DNA重組技術(shù)在體外克隆表達(dá)構(gòu)建得到苯酚降解菌，并進(jìn)一步驗(yàn)證本重組菌降酚特性，獲得了對苯酚的具有較強(qiáng)降解能力的遺傳工程菌，這將對苯酚降解菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供新的理論依據(jù)。
文檔編號C12N1/21GK102660489SQ20121012068
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月23日
發(fā)明者張同存, 楊晶, 趙華, 陳坤 申請人:天津科技大學(xué)