專利名稱：Bcl-2/IgH基因重排在作為B細(xì)胞淋巴瘤骨髓浸潤(rùn)標(biāo)志中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Bcl-2/IgH基因重排在作為B細(xì)胞淋巴瘤骨髓浸潤(rùn)標(biāo)志中的應(yīng)用，特別涉及用于檢測(cè)Bcl-2/IgH基因重排的物質(zhì)或/和儀器在制備篩查B細(xì)胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤(rùn)或潛在骨髓浸潤(rùn)患者產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
B細(xì)胞淋巴瘤(B-NHL)在腫瘤病理組織學(xué)診斷中屬于疑難病種之一，種類繁多，分類復(fù)雜，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)中最頻發(fā)的類型，占新診斷NHL 的 30-40%。由于骨髓內(nèi)造血細(xì)胞的組織學(xué)特點(diǎn)，常規(guī)的病理組織形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)染色技術(shù)可以檢測(cè)出骨髓受侵，合并白血病階段，對(duì)骨髓微小浸潤(rùn)尚不能滿足診斷需要，微小浸潤(rùn)病灶是淋巴瘤復(fù)發(fā)的主要根源，骨髓是否浸潤(rùn)直接影響DLBCL的分期，進(jìn)而影響治療及預(yù)后。目前，評(píng)價(jià)淋巴瘤骨髓浸潤(rùn)與否的常用方法是骨髓涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)染色，該方法存在一定的局限性一是淋巴瘤細(xì)胞形態(tài)變化多樣不好辨認(rèn)，尤其化療后更是難判別，易導(dǎo)致假陽(yáng)性和假陰性；二是常規(guī)判定幼稚淋巴細(xì)胞> 5%為骨髓受侵，而正常人骨髓幼稚淋巴細(xì)胞< 1%。這就給我們提出了如下迫切需要解決的問題對(duì)于骨髓形態(tài)學(xué)檢查幼稚淋巴細(xì)胞在1-5%之間，如何判定哪些是正常狀態(tài)，哪些是骨髓形態(tài)學(xué)陰性的潛在的微小浸潤(rùn)？骨髓形態(tài)學(xué)檢查固然重要，如何增加其他輔助手段減少人為因素盡量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化？個(gè)體化治療需要實(shí)驗(yàn)室提出個(gè)體化的診斷，骨髓檢查如何為下一步的臨床靶向治療提供有價(jià)值的靶點(diǎn)？這些問題現(xiàn)階段均無(wú)滿意的答案。人類B淋巴細(xì)胞在發(fā)育至前B細(xì)胞階段時(shí)重組酶有選擇地將分隔在胚系基因染色體上的可變區(qū)(V)、多樣區(qū)(D)、連接區(qū)(J)及恒定區(qū)(C)基因連接，即所謂重鏈(IgH)重排。由于V、D、J基因是多拷貝的，其間又有隨機(jī)堿基插入(N區(qū)插入)V-D. D-J之間，因此所形成的V-N-D-N-J序列數(shù)以百萬(wàn)計(jì)，但對(duì)于每個(gè)B淋巴細(xì)胞來(lái)說該序列卻是獨(dú)特的。B-NHL是由巳完成IgH重排的B細(xì)胞惡變來(lái)的。bcl-2/IgH重排中bcl-2斷點(diǎn)發(fā)生于距bcl_2第3個(gè)外顯子3’端280bp的非翻譯區(qū)，稱為主要斷裂區(qū)(major breakpoint region, MBR),發(fā)生于距主要斷裂區(qū)30kb的下游，稱為次要斷裂區(qū)(minor cluster region，MCR)，其余的斷裂點(diǎn)分布在MBR和MCR之間或bcl-2基因5’端序列。IgH的斷點(diǎn)在J片段的5’側(cè)，大多位于J5和J6，少數(shù)斷裂點(diǎn)位于IgH的JH區(qū)3'端,極少數(shù)位于IgH的轉(zhuǎn)換區(qū)。D-J之間可有堿基缺失，bcl-2同額外的堿基一起插入該區(qū)，形成bcl-2/IgH融合基因。發(fā)生在MBR的重排，產(chǎn)生bcl-2/IgH融合mRNA轉(zhuǎn)錄；發(fā)生在MCR的重排，導(dǎo)致bcl-2mRNA水平上調(diào)。隨后可能是在MBR和MCR之間插入了一小段包含E u增強(qiáng)子的IgH基因超越了正常的bcl — 2基因調(diào)控過程，導(dǎo)致bcl-2基因在B細(xì)胞的高表達(dá)，從而抑制B細(xì)胞凋亡，使B細(xì)胞持續(xù)增殖，引發(fā)腫瘤。
間期核FISH技術(shù)的研究材料廣泛，無(wú)論是細(xì)胞病理學(xué)的涂片、印片、穿刺，還是組織病理學(xué)的新鮮標(biāo)本和石蠟切片都適用。這種方法比傳統(tǒng)的染色體顯帶技術(shù)更加精確、靈敏度更高，比PCR方法的操作更為簡(jiǎn)便，敏感性和特異性均較高，結(jié)果更加客觀可靠。再者，目前已知某些基因異常與蛋白表達(dá)異常并非同步顯現(xiàn)。遺傳學(xué)改變?cè)诹馨徒M織病變的良、惡性鑒別、類型鑒別、復(fù)合型淋巴瘤的診斷及骨髓受侵情況的診斷均有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)Bcl-2/IgH基因重排的物質(zhì)或/和儀器的新用途。本發(fā)明所提供的檢測(cè)Bcl-2/IgH基因重排的物質(zhì)或/和儀器的新用途具體為用于 檢測(cè)Bcl-2基因和IgH基因重排的物質(zhì)或/和儀器在制備篩查B細(xì)胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤(rùn)或潛在骨髓浸潤(rùn)患者的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述骨髓浸潤(rùn)為骨髓涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性，即骨髓中出現(xiàn)淋巴瘤細(xì)胞或幼稚淋巴細(xì)胞占有核細(xì)胞總數(shù)百分比> 5%。在本發(fā)明中，所述Bcl-2基因?yàn)槿薆cl-2基因，所述IgH基因?yàn)槿薎gH基因。所述Bcl-2基因和IgH基因的重排具體為由t (14 ；18)染色體易位所致所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，更為具體的，為由t (14；18) (q32;q21)染色體易位所引起的所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，使所述Bcl-2基因置于所述IgH基因啟動(dòng)子下游。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述用于檢測(cè)Bcl-2基因和IgH基因重排物質(zhì)具體為用于檢測(cè)Bcl-2基因和IgH基因重排的探針，更為具體的，為用于檢測(cè)Bcl-2基因和IgH基因重排的熒光原位雜交探針，如美國(guó)Vysis公司LSI系列Bcl-2/IgH雙色雙融合探針(產(chǎn)品目錄號(hào)32-191018)。Bcl-2/IgH雙色雙融合探針，IgH基因被綠色熒光素標(biāo)記，范圍大約I. 5Mb，覆蓋了 14q32上IgH的整個(gè)同源序列，并從3'端向IgH基因外擴(kuò)展了 300kb的長(zhǎng)度。Bcl-2基因被橙紅色熒光素標(biāo)記，范圍大約750kb，覆蓋了整個(gè)Bcl-2基因并向遠(yuǎn)近兩端延伸了 250kb的長(zhǎng)度。當(dāng)然，根據(jù)實(shí)際需要也可以為其它類型的探針，或是其他可用于檢測(cè)所述Bcl-2基因和IgH基因重排的物質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述B細(xì)胞淋巴瘤具體為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種篩查B細(xì)胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤(rùn)或潛在骨髓浸潤(rùn)患者的廣品。本發(fā)明所提供的篩查B細(xì)胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤(rùn)或潛在骨髓浸潤(rùn)患者的產(chǎn)品具體為用于檢測(cè)Bcl-2基因和IgH基因重排的物質(zhì)或/和儀器。所述骨髓浸潤(rùn)為骨髓涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性，即骨髓中出現(xiàn)淋巴瘤細(xì)胞或幼稚淋巴細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)百分比> 5%。在本發(fā)明中，所述Bcl-2基因?yàn)槿薆cl-2基因，所述IgH基因?yàn)槿薎gH基因。所述Bcl-2基因和IgH基因的重排具體為由t (14 ；18)染色體易位所致所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，更為具體的，為由t (14；18) (q32;q21)染色體易位所引起的所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，使所述Bcl-2基因置于所述IgH基因啟動(dòng)子下游。在本發(fā)明中，所述篩查B細(xì)胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤(rùn)或潛在骨髓浸潤(rùn)患者的產(chǎn)品可為用于篩查B細(xì)胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤(rùn)患者或潛在骨髓浸潤(rùn)患者的試劑或試劑盒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述用于檢測(cè)Bcl-2基因和IgH基因重排物質(zhì)具體為用于檢測(cè)Bcl-2基因和IgH基因重排的探針，更為具體的，為用于檢測(cè)Bcl-2基因和IgH基因重排的熒光原位雜交探針，如美國(guó)Vysis公司LSI系列Bcl-2/IgH雙色雙融合探針(產(chǎn)品目錄號(hào)32-191018)。Bcl-2/IgH雙色雙融合探針，IgH基因被綠色熒光素標(biāo)記，范圍大約I. 5Mb，覆蓋了 14q32上IgH的整個(gè)同源序列，并從3'端向IgH基因外擴(kuò)展了 300kb的長(zhǎng)度。Bcl-2基因被橙紅色熒光素標(biāo)記，范圍大約750kb，覆蓋了整個(gè)Bcl-2基因并向遠(yuǎn)近兩端延伸了 250kb的長(zhǎng)度。當(dāng)然，根據(jù)實(shí)際需要也可以為其它類型的探針，或是其他可用于檢測(cè)所述Bcl-2基因和IgH基因重排的物質(zhì)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述B細(xì)胞淋巴瘤具體為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤。在實(shí)際應(yīng)用中，為了提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率，也可以將本發(fā)明的方法配合其他檢測(cè)手段一同使用，如常規(guī)的骨髓涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)染色檢測(cè)法。在本發(fā)明中，所述產(chǎn)品的篩查對(duì)象是臨床上確診患有彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者，或是健康人。更為具體的，所述彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者為原發(fā)部位(如淋巴結(jié))發(fā)生所述Bcl-2基因和IgH基因重排的患者；所述健康人滿足外周血中淋巴細(xì)胞占白細(xì)胞比例在0. 20-0. 40之間，且無(wú)異型淋巴細(xì)胞及幼稚淋巴細(xì)胞的條件。所述產(chǎn)品的篩查樣本具體為采自所述對(duì)象的骨髓。本發(fā)明利用熒光原位雜交(FISH)等技術(shù)對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)患者的原發(fā)部位(如淋巴結(jié))石蠟組織切片和骨髓涂片進(jìn)行檢測(cè)，最終發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因和IgH基因的重排可作為DLBCL骨髓浸潤(rùn)與否的分子標(biāo)志以及治療效果評(píng)價(jià)的標(biāo)志，具體體現(xiàn)為與傳統(tǒng)的單一骨髓涂片形態(tài)學(xué)染色法相比，形態(tài)學(xué)結(jié)合FISH法比單一形態(tài)學(xué)染色法提高了陽(yáng)性率(33. 0%vsl0. 3%);本發(fā)明骨髓涂片F(xiàn)ISH檢測(cè)Bcl-2/IgH基因重排且骨髓涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)存在1-5%幼稚淋巴細(xì)胞的病例83. 3% (10/12)比單一形態(tài)學(xué)染色不同程度提早診斷骨髓浸潤(rùn)，比臨床復(fù)發(fā)提早預(yù)警至少3個(gè)月以上。這為淋巴瘤骨髓浸潤(rùn)的臨床分期、治療及預(yù)后復(fù)查提供了有力的補(bǔ)充。


圖I為Bcl-2/IgH雙色雙融合探針結(jié)構(gòu)和原理。圖2為DLBCL患者淋巴結(jié)和骨髓的Bcl-2/IgH基因分析和Bcl_2蛋白表達(dá)。a，冰凍淋巴結(jié)石蠟切片證實(shí)是DLBCL(HE X 100 )。b，細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查骨髓涂片計(jì)數(shù)幼稚淋巴細(xì)胞是6. 0%，按常規(guī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，判為骨髓浸潤(rùn)(X 1000)。C，免疫組化染色評(píng)價(jià)DLBCL的Bcl_2蛋白陽(yáng)性表達(dá)(X 400)。d，免疫細(xì)胞化學(xué)染色Bcl-2蛋白細(xì)胞漿呈棕黃色陽(yáng)性表達(dá)(X 400)。
e,淋巴結(jié)石蠟切片(2 y m)的Bcl-2/IgH熒光原位雜交結(jié)果，基因融合信號(hào)黃色箭頭標(biāo)記(X630)。f，骨髓受侵間期核片的Bcl-2/IgH熒光原位雜交結(jié)果，可見14號(hào)及18號(hào)染色體呈多體改變黃色箭頭標(biāo)記(X 630)。圖3為DLBCL骨髓微小浸潤(rùn)的瑞氏-吉姆薩染色和雙色熒光原位雜交在同一張骨髓涂片的結(jié)果對(duì)比(Bcl-2/IgH)。A，陽(yáng)性對(duì)照(X630)。B，陰性對(duì)照(X630)。C，DLBCL骨髓形態(tài)學(xué)瑞氏-吉姆薩染色涂片，可疑細(xì)胞用黃色箭頭標(biāo)記(X 630 )。D，DLBCL骨髓細(xì)胞的熒光原位雜交結(jié)果，形態(tài)可疑細(xì)胞發(fā)生基因融合用黃色箭頭標(biāo)記(X 630)。圖4為DLBCL淋巴結(jié)石蠟切片和骨髓經(jīng)雙色熒光原位雜交檢測(cè)發(fā)生信號(hào)擴(kuò)增(黃色箭頭標(biāo)記)。A，淋巴結(jié)石蠟切片(X630)。B，骨髓間期核片(X630)。
圖5為不同厚度石蠟組織切片的熒光原位雜交結(jié)果(2um和4um) (X630)。A，
2u m0 B，4 u m0圖6為DLBCL骨髓浸潤(rùn)病例的病程進(jìn)展中的骨髓形態(tài)學(xué)與雙色熒光原位雜交結(jié)果(Bcl-2/IgH)的比較。A，淋巴結(jié)石蠟切片證實(shí)為DLBCL (HEX100)。B，淋巴結(jié)組織切片(2um厚)FISH檢測(cè)Bcl-2/IgH顯示陽(yáng)性(X630，箭頭所示)。C，3個(gè)月后復(fù)診行骨髓穿刺，骨髓形態(tài)學(xué)檢查幼稚淋巴細(xì)胞I. 5%，依據(jù)形態(tài)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)判為骨髓未受侵(X 1000)。D，3個(gè)月后復(fù)診的骨髓間期核片經(jīng)FISH檢測(cè)Bcl-2/IgH顯示陰性。E，6個(gè)月后復(fù)診，骨髓形態(tài)學(xué)檢查幼淋細(xì)胞3. 5%，依據(jù)形態(tài)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)判為骨髓未受侵(X 1000)。F，6個(gè)月后復(fù)診的骨髓間期核片經(jīng)FISH檢測(cè)Bcl-2/IgH顯示陽(yáng)性(X 630，箭頭所示)。G，14個(gè)月后復(fù)診，骨髓形態(tài)學(xué)診斷為NHL合并急性淋巴細(xì)胞白血病(X 1000)。H，14個(gè)月后復(fù)診的骨髓間期核片經(jīng)FISH檢測(cè)Bcl-2/IgH顯示陽(yáng)性(X 630，箭頭所示)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。I、主要試劑和儀器Bcl-2/IgH探針美國(guó)Vysis公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為32-191018。Bcl-2/IgH探針是雙色雙融合探針，IgH基因被綠色熒光素標(biāo)記，范圍大約I. 5Mb，覆蓋了 14q32上IgH的整個(gè)同源序列，并從3'端向IgH基因外擴(kuò)展了 300kb的長(zhǎng)度。Bcl-2基因被橙紅色熒光素標(biāo)記，范圍大約750kb，覆蓋了整個(gè)Bcl-2基因并向遠(yuǎn)近兩端延伸了 250kb的長(zhǎng)度。正常的一個(gè)間期核中可見各自獨(dú)立的兩個(gè)橙紅色信號(hào)和兩個(gè)綠色信號(hào)(202G)，發(fā)生染色體易位(Bcl-2/IgH基因重排)的細(xì)胞核內(nèi)有兩個(gè)黃色信號(hào)(101G2F)，見圖1，有時(shí)可以觀察到更多的融合信號(hào)或其他異?，F(xiàn)象。Bcl-2抗體丹麥Dako公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為IR614。PV-9000試劑盒(二步法免疫組化檢測(cè)試劑)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為PV-9000，內(nèi)含3%H202去離子水、Polymer Helper (試劑I)、polyperxidase-anti-mouse/rabbit IgG (試劑 2)。一抗稀釋液、濃縮型DAB Kit,EDTA緩沖液、PBS緩沖液北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。2、溶液配方(I) 20XSSC :175. 3g NaCl，88. 2g 檸檬酸鈉，用 10ml/L NaOH 調(diào)制 pH7. 0，加蒸餾水定容至1L。(2)1 Xpepsin (胃蛋白酶)10% (w/v)pepsinO. 5 U 1,0. OlN HCLlmlo(3) 10XPBS 40g NaCl，IgKCl，14. 35g Na2HPO4,用 HCl 調(diào)制 pH7. 4，加蒸餾水定容至 500ml。(4) 40%硫酸葡聚糖40g硫酸葡聚糖，100ml8XSSC溶液。(5) 1% 多聚甲醛lg 多聚甲醛，IOOmll XPBS0(6)70% 甲酰胺 /2XSSC (pH = 7. 0，100ml)70ml 100%(v/v)甲酰胺，10ml20XSSC溶液，20ml去離子水。、
(7)50% 甲酰胺 /2XSSC(pH = 7. 0，100ml)50ml 100%(v/v)甲酰胺，10ml20XSSC溶液，40ml去離子水。(8) 0. 075M KCl :1. 12gKCl，200ml 去離子水。(9)20iU雜交液3iil7%(v/v)吐溫-20水，12 甲醛，5 硫酸葡聚糖(現(xiàn)用現(xiàn)配)。(10)2XSSC/0. 3%NP-40 100ml20 X SSC(pH5. 3)溶于 850ml 純化水，加 3mlNP_40，至NP-40完全溶解。NaOH調(diào)至pH7. 0，加純化水至1L。3、主要儀器
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)Bcl-2基因和IgH基因重排的物質(zhì)或/和儀器在制備篩查B細(xì)胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤(rùn)或潛在骨髓浸潤(rùn)患者的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述物質(zhì)為用于檢測(cè)Bcl-2基因和IgH基因重排的探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述B細(xì)胞淋巴瘤為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤。
4.篩查B細(xì)胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤(rùn)或潛在骨髓浸潤(rùn)患者的產(chǎn)品，為用于檢測(cè)Bcl-2基因和IgH基因重排的物質(zhì)或/和儀器。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的產(chǎn)品，其特征在于所述物質(zhì)為用于檢測(cè)Bcl-2基因和IgH基因重排的探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的產(chǎn)品，其特征在于所述B細(xì)胞淋巴瘤為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了Bcl-2/IgH基因重排在作為B細(xì)胞淋巴瘤骨髓浸潤(rùn)標(biāo)志中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的應(yīng)用具體為用于檢測(cè)Bcl-2基因和IgH基因重排的物質(zhì)或/和儀器在制備篩查B細(xì)胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤(rùn)或潛在骨髓浸潤(rùn)患者的產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述B細(xì)胞淋巴瘤為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤。實(shí)驗(yàn)證明，與傳統(tǒng)的單一骨髓涂片形態(tài)學(xué)染色法相比，形態(tài)學(xué)結(jié)合FISH法比單一形態(tài)學(xué)染色法提高了陽(yáng)性率(DLBCL:33.0%vs10.3%)；本發(fā)明骨髓涂片F(xiàn)ISH檢測(cè)Bcl-2/IgH發(fā)生基因重排且骨髓涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)存在1-5%幼稚淋巴細(xì)胞的病例83.3%(10/12)比單一形態(tài)學(xué)染色不同程度提早診斷骨髓浸潤(rùn)，比臨床復(fù)發(fā)提早預(yù)警至少3個(gè)月以上。這為淋巴瘤骨髓浸潤(rùn)的臨床分期、治療及預(yù)后復(fù)查提供了有力的補(bǔ)充。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102747156SQ20121024343
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月13日
發(fā)明者劉鵬, 張長(zhǎng)弓, 徐欣, 曲媛, 王明榮, 羅揚(yáng), 車軼群, 郝佳潔, 齊軍 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院