專利名稱：一種利用固定化黑曲霉發(fā)酵玉米糖液制備檸檬酸的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領域，具體涉及一種利用固定化黑曲霉發(fā)酵玉米糖液制備檸檬酸的方法。
背景技術(shù)：
檸檬酸是一種廣泛應用子食品、醫(yī)藥、化工等領域的重要有機酸。目前國內(nèi)檸檬酸的生產(chǎn)供不應求，而且均以玉米、瓜干、糖蜜為原料，產(chǎn)品成本較高。本文的研究以蘋果罐頭、果汁果茶生產(chǎn)的廢料為原料，黑曲霉固態(tài)發(fā)酵，生產(chǎn)檸檬酸，其工藝筒單、設備投資少而且果渣經(jīng)發(fā)酵后不僅能提取檸檬酸，還可產(chǎn)生大量的果膠酶，可用子果膠酶的提取，二是由于菌體的繁殖，蛋白質(zhì)含量增加，可做飼料。
影響檸檬酸酸發(fā)酵的因素是多方面的，包括碳源、氮源和生長因子、無機鹽等，以及相互之間的比例和培養(yǎng)基質(zhì)中整個營養(yǎng)物質(zhì)的濃度；產(chǎn)酸刺激物可以促進產(chǎn)酸率的提高；還有一些非營養(yǎng)性因子如pH、溫度、通風量等。工藝條件是檸檬酸發(fā)酵能否成功的關鍵因素之一，合適的工藝條件可大大提高檸檬酸發(fā)酵水平，其中又以通氣、攪拌對發(fā)酵影響最為顯著。因此有必要對這些因素進行具體詳細的研究。近年來，隨著國內(nèi)經(jīng)濟的持續(xù)發(fā)展，市場對檸檬酸的需求也在增加。我國是檸檬酸生產(chǎn)大國，總產(chǎn)量達20萬t/a，其中70%出口國外。因此。采用先進技術(shù)改進生產(chǎn)方法，可以降低成本，增加產(chǎn)量，提高產(chǎn)品出口創(chuàng)匯能力。利用固定化細胞連續(xù)發(fā)酵檸檬酸，是目前研究較多，并初見成效的新技術(shù)。本發(fā)明以玉米糖液為碳源，對此技術(shù)進行了研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種利用固定化黑曲霉發(fā)酵玉米糖液制備檸檬酸的方法，本發(fā)明以黑曲霉為出發(fā)菌株，利用PVA復合凝膠包埋黑曲霉的孢子及菌絲體。固定后的細胞經(jīng)過一系列預培養(yǎng)，用于發(fā)酵玉米糖液生產(chǎn)檸檬酸。一種利用固定化黑曲霉發(fā)酵玉米糖液制備檸檬酸的方法，其特征在于發(fā)酵時，300HiL三角瓶中放入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，加入10 g固定化黑曲霉進行預培養(yǎng)后，在一定溫度下，以一定轉(zhuǎn)速的培養(yǎng)。步驟I所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備一定量的玉米糖液8 IOBx (濃度以勃力克斯比重計表示，簡寫B(tài)x)，加麩皮O. 5 g/100 mL。步驟2所述的玉米粉按δμ/g比例加入耐高溫淀粉酶，再加約4倍重量水，95°C溫度下，液化30 min，冷卻調(diào)整至所需濃度備用。步驟I所述的固定化細胞預培養(yǎng)的方法將固定化黑曲霉載體浸泡在糖液濃度3 4 Bx發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)24 h。至孢子開始萌發(fā)時，停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)基與載體分離，載體待用。步驟4所述的細胞固定化方法將10% (w/v)聚合度1780的聚乙烯醇(PVA)溶液加入l%(w/v)硼砂，3% (w/v)的甘油混合成復合凝膠。復合凝膠冷卻到30°C，加入定量的菌絲體及孢子懸浮液，混勻，-40°C成型，制成5. O mmX5.0 mmX5.0 mm的固定化黑曲霉
載體方塊備用。步驟I所述的玉米糖液最佳濃度為14 Bx0步驟I所述的最佳發(fā)酵溫度為36°C。步驟I所述的最佳發(fā)酵轉(zhuǎn)速為240 rpm。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明以玉米糖液為碳源，對此技術(shù)進行了研究。利用固定化細胞連續(xù)發(fā)酵檸檬酸，是目前研究較多，并初見成效的新技術(shù)。
具體實施例方式下面的實施例對本發(fā)明作詳細說明，但對本發(fā)明沒有限制。 本發(fā)明所用的菌株為黑曲霉，購買于ACCC，編號為ACCC30333。實施例I
本實施案例說明不同玉米糖液濃度對檸檬酸產(chǎn)量的影響，以不同濃度的玉米糖液為底物(8 16Bx)，pH4. 5-5. 0，溫度35°C，250 r/min轉(zhuǎn)速下，發(fā)酵64 h，觀察玉米糖液濃度對檸檬酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果如表I所示。由表I可見，在糖液濃度為8-14BX范圍內(nèi)對產(chǎn)酸影響很大，檸檬酸濃度和總酸轉(zhuǎn)化率逐漸增加。而超過14Bx時，產(chǎn)酸變慢，而且總酸轉(zhuǎn)化率開始下降。因此，本實驗研究選定最適宜糖度為14 Bx0
表I不同玉米糖液濃度對檸懞酸產(chǎn)量的影響
糖度(Bx) S 10 12 14 1618
發(fā)酵吋間(H) 64 64 64 64 6464
檸懞酸(g/L) 72 88 108 132 138143
總酸轉(zhuǎn)化率 95.34 96Λ2 9634 9824 94J793A2實施例2
本實施案例說明不同溫度對檸檬酸產(chǎn)量的影響，根據(jù)菌種特性介紹，我們觀察了溫度對檸檬酸產(chǎn)量的影響。調(diào)整發(fā)酵溫度32°C -38°C，實施案例在恒定搖瓶轉(zhuǎn)速250 r/min,初始pH4. 5 5.0，糖度為14 Bx條件下進行。結(jié)果如表2所示。由表2可知，溫度過高或過低均影響檸檬酸產(chǎn)量及總酸轉(zhuǎn)化率，當溫度為36°C時，檸檬酸濃度和總酸轉(zhuǎn)化率最高，分別為136 g/L和98. 26%，因此最佳發(fā)酵溫度選擇為35。。。
_表2不同溫度對梓懞酸產(chǎn)量的影響_
溫度 CO 30 32 34 36 38 40 檸懞酸 CgL) 128 129 130 136 132 127 總酸轉(zhuǎn)化率 95—74 96—45 96.21 98.26 94—25 93—42實施例3
本實施案例說明不同搖瓶轉(zhuǎn)速對檸檬酸發(fā)酵的影響，黑曲霉作為好氧菌其溶氧水平是決定其生產(chǎn)代謝的關鍵所在。搖瓶階段，影響溶氧的主要因素便是轉(zhuǎn)速。根據(jù)以上條件，我們確定在14 Bx玉米糖液發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入IOg固定化黑曲霉細胞，控溫36°C培養(yǎng)64 h，測定其不同轉(zhuǎn)速下產(chǎn)酸，結(jié)果見表3。由表3可知，搖瓶轉(zhuǎn)速對發(fā)酵產(chǎn)酸具有極大的影響，是控制檸檬酸發(fā)酵最關鍵的參數(shù)之一。在低轉(zhuǎn)速下，顯微觀察菌球形成緩慢。結(jié)合轉(zhuǎn)速與工藝控制的可能，再配合產(chǎn)酸與總酸轉(zhuǎn)化率，選定最適搖瓶轉(zhuǎn)速在240 r/min。
表3不同搖瓶轉(zhuǎn)速對利用黒曲霉進行檸檬酸發(fā)酵的影晌
權(quán)利要求
1.一種利用固定化黑曲霉發(fā)酵玉米糖液制備檸檬酸的方法，其特征在于發(fā)酵時，300mL三角瓶中放入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，加入10 g固定化黑曲霉進行預培養(yǎng)后，在一定溫度下，以一定轉(zhuǎn)速的培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基的制備一定量的玉米糖液8 10Bx，加麩皮 0. 5 g/100 mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，玉米粉按5M/g比例加入耐高溫淀粉酶，再加約4倍重量水，95°C溫度下，液化30 min，冷卻調(diào)整至所需濃度備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，固定化細胞預培養(yǎng)的方法將固定化黑曲霉載體浸泡在糖液濃度3 4 Bx發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)24 h ;至孢子開始萌發(fā)時，停止培養(yǎng)；將培養(yǎng)基與載體分離，載體待用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，細胞固定化方法將10%聚合度1780的聚乙烯醇溶液加入1%硼砂，3%的甘油混合成復合凝膠；復合凝膠冷卻到30°C，加入定量的菌絲體及孢子懸浮液，混勻，_40°C成型，制成5.0 mmX5.0 mmX5.0 mm的固定化黑曲霉載體方塊。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，玉米糖液濃度為14Bx0
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵溫度為36°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵轉(zhuǎn)速為240rpm。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用固定化黑曲霉發(fā)酵玉米糖液制備檸檬酸的方法，本發(fā)明以黑曲霉為出發(fā)菌株，利用PVA復合凝膠包埋黑曲霉的孢子及菌絲體。固定后的細胞經(jīng)過一系列預培養(yǎng)，用于發(fā)酵玉米糖液生產(chǎn)檸檬酸。
文檔編號C12R1/685GK102851328SQ20121031192
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月29日
發(fā)明者金雅新 申請人:太倉市茂通化建有限公司