專利名稱：一種耐高溫阿拉伯多糖酶及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)及生物質(zhì)精煉技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種耐高溫阿拉伯多糖酶及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿拉伯多糖是L-阿拉伯糖以α-1，5-糖苷鍵連接組成的的中性多糖。它們通常聚合度較低(40-50)，輔以α-1,3或少量的α-1，2糖苷鍵相連的分支結(jié)構(gòu)，能從花生、蘋果和甜菜等植物組織中分離獲得。阿拉伯多糖酶是半纖維素降解酶系中的一種多糖水解酶，通過隨機(jī)切阿拉伯多糖的α-1，5-糖苷鍵，將阿拉伯多糖水解為L(zhǎng)-阿拉伯糖。臨床研究表明，L-阿拉伯糖對(duì)蔗糖的代謝轉(zhuǎn)化具有阻斷作用，因此在減肥、控制糖尿病等方面具有重要應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種耐高溫阿拉伯多糖酶，以使其滿足使用要求。本發(fā)明的另一目的是提供一種編碼上述耐高溫阿拉伯多糖酶的核苷酸序列。本發(fā)明還有一目的是提供上述一種耐高溫阿拉伯多糖酶的應(yīng)用。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種耐高溫阿拉伯多糖酶，氨基酸序列如SEQ NO 1所示。一種耐高溫阿拉伯多糖酶，其特征在于氨基酸序列為權(quán)利要求I所述的SEQ NO I序列中的氨基酸經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有阿拉伯多糖酶活性的衍生蛋白質(zhì)。一種編碼耐高溫阿拉伯多糖酶的基因，DNA序列如SEQ NO 2所示。一種可表達(dá)耐高溫阿拉伯多糖酶的重組載體，在所述的重組載體上克隆有如SEQNO 2所示的DNA序列。一種可表達(dá)耐高溫阿拉伯多糖酶的重組菌，在所述的重組菌內(nèi)克隆有如SEQ Ν02所示的DNA序列。一種擴(kuò)增編碼耐高溫阿拉伯多糖酶的基因的方法，所使用的引物對(duì)為Tth_l 5’ -GGAATTCCATATGGTATTCAACTGGGCAACTGTACAC-3’ ；Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGATCTTCGATCCGAACTCCCCAG-3，。所述的耐高溫阿拉伯多糖酶在酶解阿拉伯多糖中的應(yīng)用。酶解反應(yīng)溫度為60^85°C, pH為6. 0 8· O的反應(yīng)體系。耐高溫阿拉伯多糖酶在降解水果蔬菜和纖維原料中的應(yīng)用。上述的重組載體或重組菌在酶解阿拉伯多糖中的應(yīng)用。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的阿拉伯多糖酶具有極強(qiáng)的耐熱性能和偏中性PH條件下高活性的特性。在75°C、pH為6. 5的條件下酶活性最高，比酶活達(dá)到16. 7 U/mg ;該蛋白酶在溫度為60°C _85°C、pH為6. 0-8. O的范圍內(nèi)，均具有較高的酶活，在750C的反應(yīng)體系中，保溫2h酶活性保持不變。這些特性使得本發(fā)明得到的阿拉伯多糖酶比現(xiàn)有阿拉伯多糖酶具有更大的優(yōu)越性，適用于75V以上高溫、偏中性pH條件下水果、蔬菜及半纖維素中阿拉伯多糖的降解，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。


圖I 是 Tth arase 蛋白的 SDS-PAGE 圖2是Tth arase蛋白的最適溫度結(jié)果 圖3是Tth arase蛋白的最適pH結(jié)果 圖4是Tth arase蛋白的熱穩(wěn)定性結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。實(shí)施例I嗜熱陸地?zé)崛邷厣衽劬蚪MDNA的提取
取嗜熱陸地?zé)崛邷厣衽劬鷗hermarum DSM5069 (購(gòu)自德國(guó)微生物菌種保藏中心)新鮮菌體10g，懸于5mL 50mM Tris緩沖溶液中(pH8. 0)，混勻后，在37°C放置20min，然后加入2mL 10%SDS，55°C放置5min，用等體積的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清液加入2倍體積的無水乙醇，于_20°C放置30 min, 4°C 13000rpm離心20min，收集沉淀。沉淀溶于 O. 5mL TE 緩沖液(ρΗ8· 0，IOmM Tris, ImM EDTA)，加入 10mg/mL RNase 3μ L,37°C保溫lh，用等體積的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清加入2倍體積的無水乙醇，于_20°C放置30min，4°C 13000 rpm離心20min，收集沉淀，真空冷凍干燥，用O. 5mL超純水溶解，備用。實(shí)施例2阿拉伯糖基因Tth arase的制備
可采用如下方法制備Tth arase基因，也可以采用人工合成的方式得到。認(rèn)Thermotoga thermarum DSM5069的總DNA (實(shí)施例I制備)為模版，用下述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增
Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGTATTCAACTGGGCAACTGTACAC-3’ ；
Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGATCTTCGATCCGAACTCCCCAG-3 ；
在Tth-I引入Nde I酶切位點(diǎn)，在Tth-2引入Xho I酶切位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)體系1 μ L T1. iAerfflara 基因組 DNA, I μ L Tth-1, IuL Tth-2, 25 μ LPremix ExTaq, 22 μ L 超純水。PCR 反應(yīng)條件94°C變性 5 min ;94°C變性 30 sec，52°C退火 30 sec，72°C延伸 3min, 30 Cycles ;72°C延伸 IOmin ;4°C保溫。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)量和特異性，并用PCR產(chǎn)物回收試劑盒進(jìn)行純化(BI0MIGA，上海)。實(shí)施例3重組克隆、表達(dá)載體pET-20b-TiA arase的構(gòu)建與驗(yàn)證
將純化過的PCR產(chǎn)物(實(shí)施例2制備)、pET-20b (Novagen)用分別Nde I和Xho I雙酶切，瓊脂糖電泳回收酶切酶切PCR及載體大片段。割膠回收后的目的片段與載體，經(jīng)濃縮加入8μ L無菌水重懸，加入IyL IOXLigase Buffei^PlyL Ligase，于16°C連接過夜。用連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌pET-20b，然后涂于含IOOy g/mL Amp (氨芐青霉素)的培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng) 10-12h。從轉(zhuǎn)化平板上挑取多個(gè)單菌落，采用BI0MIGA的質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒。對(duì)獲得的質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證并對(duì)獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，pET-20b載體中插入了所克隆的目的片段(核苷酸長(zhǎng)度為1341bp)，進(jìn)而得到重組克隆及表達(dá)載體pET-20b-7iA arase,Tth arase的核苷酸如SEQ NO :2所示,其編碼的氨基酸序列如SEQ NO:I所示，將該蛋白命名為Tth arase。實(shí)施例4重組阿拉伯糖Tth arase的表達(dá)與純化
按常規(guī)方法將重組克隆、表達(dá)載體pET-20b-RA arase電轉(zhuǎn)至宿主菌疋coliBL21(DE3) (Novagen)，獲得含有重組質(zhì)粒的重組菌。將單菌落的重組菌接種于5mL含有100 μ g/ml氨節(jié)青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培養(yǎng)基,在37°C溫度下,200rpm震蕩培養(yǎng)8-12h。將上述4mL菌液接種于含400mL培養(yǎng)基的IOOOmL搖瓶中，37°C溫度下，200rpm 震蕩培養(yǎng)，當(dāng)吸光度達(dá)到O. 6-0. 8時(shí)，加人200 μ L的IM IPTG，并在30°C溫度下，120rpm誘導(dǎo)表達(dá)10-12 h。用高速冷凍離心機(jī)將培養(yǎng)液在4°C下，13000rpm離心15min，收集菌體。用50mL超純水洗漆并在4°C下，以13000 rpm離心15min,回收菌體,接著用20mL I XBindingBuffer 重懸(O. 5M NaCl, 20mM Tris_HCl，5mM imidazole，ρΗ7· 9)，在冰水浴中，用超聲波破碎機(jī)破碎細(xì)菌細(xì)胞，并在4°C下13000rpm離心15min,得到含阿拉伯多糖酶Tth arase的粗提液。粗提液先經(jīng)70°C加熱處理30min的熱處理，除去不耐熱的雜蛋白，再用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化(方法見His-Bind Kits,Novagen)。純化酶純度的鑒定和分子量的測(cè)定采用SDS-PAGE方法進(jìn)行，結(jié)果見圖1，1為pET-20b空質(zhì)粒表達(dá)出的蛋白，2為200mM咪唑純化過后的蛋白，3即表示400mM咪唑純化過后的Tth arase蛋白，分子量約為43kDa，略比理論值49kDa低。實(shí)施例5重組阿拉伯糖Tth arase的酶學(xué)性質(zhì)分析
酶活定義為=Imin內(nèi)催化甜菜阿拉伯多糖產(chǎn)生Iymol阿拉伯糖所需的酶量。( I)最適溫度
用PH值為6. 5的O. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實(shí)施4中的純酶液，用稀釋后的酶液進(jìn)行酶活測(cè)定。酶活測(cè)定反應(yīng)體系為200 μ L，由O. 2%甜菜阿拉伯多糖100 μ L，90 μ LO. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液和10 μ L稀釋酶液組成；反應(yīng)體系的pH為6. 5。將反應(yīng)體系在60-100°C溫育10 min后，加入300μ L DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5min后測(cè)定550nm的吸光值。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值作圖，結(jié)果如圖2所示，研究結(jié)果表明在75°C時(shí)，阿拉伯多糖酶具有最高的酶活性，為16. 7U/mg ;將此溫度下的酶活反應(yīng)體系的吸光值最為相對(duì)活性100%，其它溫度下酶活反應(yīng)體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值作為相對(duì)活性。其中，在溫度60-85°C的反應(yīng)體系中酶活性較高。(2)最適 pH
酶活性測(cè)定體系為200 μ L，由O. 2%甜菜阿拉伯多糖100 μ L，pH4. 0-8. O的90 μ L O. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液和10 μ L稀釋酶液組成。將反應(yīng)體系在75°C溫育IOmin后，加入300 μ L DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5 min后測(cè)定550nm的吸光值。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取平均值，結(jié)果如圖3所示，研究結(jié)果表明，在pH為6. 5時(shí)，阿拉伯多糖酶具有最高的酶活性，為16. 7U/mg ;將此pH值下的酶活反應(yīng)體系的作為相對(duì)活性100%，其它pH值下酶活反應(yīng)體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值的比值作為相對(duì)活性。在PH6. 0-8. O的條件下，酶活較高。 (3)重組酶熱穩(wěn)定性
用PH值為6. 5的O. I M咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實(shí)施例4中的純酶液，用稀釋后的酶液進(jìn)行酶活測(cè)定。將稀釋酶液在75°C、80°C、85°C、9(TC水浴30min、60min、90min和120min，測(cè)定酶的殘存酶活。酶活測(cè)定反應(yīng)體系中pH為6. 5，測(cè)定溫度為80°C。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值，結(jié)果如圖4所示，研究結(jié)果顯示，75°C處理2 h未見酶活下降，可見該阿 拉伯多糖酶在75°C條件下熱穩(wěn)定非常好，可以快速有效地將甜菜阿拉伯多糖降解為阿拉伯糖。
權(quán)利要求
1.一種耐高溫阿拉伯多糖酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ NO 1所示。
2.一種耐高溫阿拉伯多糖酶，其特征在于氨基酸序列為權(quán)利要求I所述的SEQ NO 1序列中的氨基酸經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有阿拉伯多糖酶活性的衍生蛋白質(zhì)。
3.一種編碼權(quán)利要求I所述的耐高溫阿拉伯多糖酶的基因，其特征在于DNA序列如SEQ NO 2 所示。
4.一種可表達(dá)耐高溫阿拉伯多糖酶的重組載體，其特征在于在所述的重組載體上克隆有如SEQ NO 2所示的DNA序列。
5.一種可表達(dá)耐高溫阿拉伯多糖酶的重組菌，其特征在于在所述的重組菌內(nèi)克隆有如SEQ NO 2所示的DNA序列。
6.一種擴(kuò)增編碼耐高溫阿拉伯多糖酶的基因的方法，其特征在于所使用的引物對(duì)為Tth-l :5’ -GGAATTCCATATGGTATTCAACTGGGCAACTGTACAC-3’；Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGATCTTCGATCCGAACTCCCCAG-3，。
7.權(quán)利要求I所述的耐高溫阿拉伯多糖酶在酶解阿拉伯多糖中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于酶解反應(yīng)溫度為6(T85°C，pH為6.(Γ8. O的反應(yīng)體系。
9.權(quán)利要求4所述的重組載體在酶解阿拉伯多糖中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種耐高溫阿拉伯多糖酶及其編碼基因和應(yīng)用，該阿拉伯多糖酶的氨基酸序列如SEQNO1所示。該阿拉伯多糖酶具有極強(qiáng)的耐熱性能和偏中性pH條件下高活性的特性。在75℃、pH為6.5的條件下酶活性最高，比酶活達(dá)到16.7U/mg；該蛋白酶在溫度為60℃-85℃、pH為6.0-8.0的范圍內(nèi)，均具有較高的酶活，在75℃的反應(yīng)體系中，保溫2h酶活性保持不變。這些特性使得本發(fā)明得到的阿拉伯多糖酶比現(xiàn)有阿拉伯多糖酶具有更大的優(yōu)越性，適用于75℃以上高溫、偏中性pH條件下水果、蔬菜及半纖維素中阿拉伯多糖的降解，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102864131SQ20121033385
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者王飛, 時(shí)號(hào), 李迅, 丁懷海 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)