專利名稱：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)試劑盒及其引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)試劑盒及其引物。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis, TB)簡(jiǎn)稱為結(jié)核桿菌(tuberclebacilli)。早在1882年，德國(guó)細(xì)菌學(xué)家郭霍(Robert Koch，1843-19 10)就已證明結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的病原菌。結(jié)核分枝桿菌可侵犯全身各組織器官，但以肺部感染最多見(jiàn)。隨著抗結(jié)核藥物的不斷發(fā)展和衛(wèi)生生活狀況的改善，結(jié)核的發(fā)病率和死亡率曾一度大幅下降。20世紀(jì)80年代后，由于艾滋病和結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)、免疫抑制劑的應(yīng)用、吸毒、貧困及人口流動(dòng)等因素，全球范圍內(nèi)結(jié)核病的疫情驟然惡化。如今，結(jié)核病仍然是影響人類健康流行性最廣、病死率最高的感染性疾病之一。尋求快速、準(zhǔn)確的診斷方法一直是結(jié)核病學(xué)首要研究的領(lǐng)域。目前，肺結(jié)核的診斷方法主要包括(I)痰涂片檢查。一般初次就診要查三個(gè)痰標(biāo)本，即夜間痰、清晨痰和即時(shí)痰。痰涂片檢查的陽(yáng)性率受標(biāo)本質(zhì)量、處理方法、觀察視野數(shù)、鏡檢者的技術(shù)水平和經(jīng)驗(yàn)等因素的影響。痰涂片鏡檢法操作簡(jiǎn)便、出結(jié)果快、費(fèi)用低廉，但只以抗酸性特征為依據(jù)，故不能作為結(jié)核桿菌種特異性鑒定的依據(jù)。(2)痰結(jié)核菌培養(yǎng)，結(jié)果可信度高，并能做結(jié)核菌藥敏試驗(yàn)，但需時(shí)6-8周，應(yīng)用受到限制。該法至少需要IO3—IO4細(xì)菌/ ml才能檢出陽(yáng)性結(jié)果。特別是微量菌、細(xì)胞壁缺陷菌和化療后細(xì)菌受到損傷培養(yǎng)難以生長(zhǎng)，就更突出了培養(yǎng)的局限性。同時(shí)由于肺結(jié)核屬于呼吸道傳播的烈性傳染病，對(duì)實(shí)驗(yàn)室安全要求較高,不利于結(jié)核桿菌的普遍篩查。(3)免疫法。此檢測(cè)技術(shù)快速簡(jiǎn)便、成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，否則因準(zhǔn)確性不夠，目前只能是輔助檢測(cè)手段。(4)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法技術(shù)因其靈敏、特異、快速，對(duì)于難以培養(yǎng)、生長(zhǎng)緩慢的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)有著獨(dú)特意義，已成功用于臨床標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)，近年來(lái)，該技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用研究取得很大進(jìn)展，特別是通過(guò)與DNA指紋技術(shù)、DNA探針技術(shù)結(jié)合，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，不但能定性，而且能定量檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌DNA的含量，該成果將對(duì)臨床具有極大的意義。由于目前基因檢測(cè)技術(shù)的復(fù)雜性和結(jié)核分枝桿菌的高傳染性，要進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的基因檢測(cè)，不僅需要昂貴的儀器設(shè)備，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件也有很高的要求，這給結(jié)核病的快速診斷造成許多困難，不利于基層醫(yī)療防疫機(jī)構(gòu)及現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，最初由日本科學(xué)家Notomi，T等設(shè)計(jì)用來(lái)檢測(cè)病原微生物，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。其基本原理是采用4條引物來(lái)識(shí)別基因上的6個(gè)特異區(qū)域，同時(shí)利用一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。將樣品、引物、具有鏈置換特性的DNA聚合酶及反應(yīng)液混合，置于60 65°C的恒溫條件下反應(yīng)，基因的擴(kuò)增和檢測(cè)即可一步完成。該擴(kuò)增法擴(kuò)增效率高，15 60分鐘內(nèi)DNA擴(kuò)增可達(dá)IO9 101°倍。鑒于其高特異性，可通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物是否生成來(lái)判斷目的基因是否存在。該方法不需要模板的熱變性、長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過(guò)程，LAMP法具有高特異性、高效性、快速、廉價(jià)(不需要特定的貴重檢測(cè)設(shè)備，只需要簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)的恒溫箱)、易檢測(cè)(直接進(jìn)行目測(cè)判斷)等特點(diǎn)。LAMP具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，能代替PCR方法的最新技術(shù)?，F(xiàn)已被廣泛用于微生物檢測(cè)及胚胎性別鑒定等領(lǐng)域，如何運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌在臨床診斷技術(shù)發(fā)展中具有重大意義，因此開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單快速、檢測(cè)效率高的運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)來(lái)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)成本低、使用方便、檢測(cè)快速高效、靈敏度高的基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)試劑盒，以及在該試劑盒上應(yīng)用到的引物。該試劑盒是基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)來(lái)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的。本發(fā)明環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的引物所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明所述引物包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP及內(nèi)引物BIP，其序列分別如下
外引物 F3 :5’ -ACCGAGGTCAAATCGITTGT-3’ ；
外引物 B3 :5’ -ATCCGTGGAACGGCAATC-3’ ；
內(nèi)引物 FIP :5’ -CGAGGACACAGCCTTGTTCACAGAACAGCTGACCCACTGG-3’ ；
內(nèi)引物 BIP :5’ -CGTATCGCGGCACGTAAGGCGGGCAATCCACCGATGTC-3’。本發(fā)明環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)試劑盒所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明所述試劑盒包括以下成分
權(quán)利要求
1.一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的引物，其特征在于，包括外引物F3、外弓丨物B3、內(nèi)引物FIP及內(nèi)引物BIP，其序列分別如下外引物 F3 :5’ -ACCGAGGTCAAATCGITTGT-3’ ；外引物 B3 :5’ -ATCCGTGGAACGGCAATC-3’ ；內(nèi)引物 FIP :5’ -CGAGGACACAGCCTTGTTCACAGAACAGCTGACCCACTGG-3’ ；內(nèi)引物 BIP :5’ -CGTATCGCGGCACGTAAGGCGGGCAATCCACCGATGTC-3’。
2.一種包括如權(quán)利要求I所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的引物的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括如下成分
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述擴(kuò)增體系預(yù)混合物中含有2. 5ul 10倍濃縮的Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液、4ul10mmol/L dNTP、lul 100mmol/L 硫酸鎮(zhèn)、5ul 5mol/L 甜菜減。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)成本低、使用方便、檢測(cè)快速高效、靈敏度高的基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)試劑盒，以及在該試劑盒上應(yīng)用到的引物。所述引物的序列如序列編號(hào)SEQ ID NO.1～4所示；本發(fā)明所述試劑盒除了包括上述引物外，還包括12.5μl的擴(kuò)增體系預(yù)混合物、1μl 5～15pmol/μl的引物F3、1μl 5～15pmol/μl的引物B3、1μl 20～40pmol/μl的引物FIP、1μl 20～40pmol/μl的引物BIP、2.5μl的無(wú)菌雙蒸水；利用所述試劑盒進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，能使檢測(cè)成本大大降低，且檢測(cè)快速高效，靈敏度高。本發(fā)明可應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102888455SQ20121033962
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月14日
發(fā)明者孫宜峰, 龔惠勇, 曾冰冰 申請(qǐng)人:珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司