專利名稱：凝集素用于識(shí)別、純化干細(xì)胞的方法、試劑盒及應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)、干細(xì)胞、腫瘤學(xué)領(lǐng)域，涉及采用凝集素用于識(shí)別、純化干細(xì)胞的方法、試劑盒及其應(yīng)用，具體而言，涉及采用特異識(shí)別糖蛋白和/或糖脂糖鏈末端的凝集素結(jié)合物用于從嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞群中識(shí)別、純化干細(xì)胞的方法、試劑盒，本發(fā)明所公開的方法、試劑盒可有效且精準(zhǔn)的用于從所述細(xì)胞群中識(shí)別、純化成體干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、癌干細(xì)胞，所述含干細(xì)胞的樣品不帶任何外來(lái)標(biāo)記。本發(fā)明還涉及獲得的干細(xì)胞及它們?cè)谥T如研究或治療中的廣泛用途。
背景技術(shù)：
“凝集素”這一術(shù)語(yǔ)最早在1888年出現(xiàn)，人們發(fā)現(xiàn)其具有凝集紅細(xì)胞的特性。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，凝集素也是一種蛋白質(zhì)，廣泛從植物、動(dòng)物、真菌、細(xì)菌等中分離，具有結(jié)合糖脂或糖肽末端特異性碳水化合物的特性(SharonN等,Science, 1972.177(53):949-59 ；PusztaiA，植物凝集素，1991.劍橋:劍橋大學(xué)出版社)，且其唯一的特異性在于，它們是一組結(jié)構(gòu)上有區(qū)別的蛋白質(zhì)，且可特異性結(jié)合細(xì)胞膜上的碳水化合物，并進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞膜表面寡糖基之間的交聯(lián)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的凝集(Pusztai A，植物凝集素，1991.劍橋:劍橋大學(xué)出版社；Sharon N, Trends Biochemistry Sci,1993.18(6):221-226)。眾所周知，糖基化是在酶的作用下，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)或脂質(zhì)附加上糖類的過(guò)程。此過(guò)程為共轉(zhuǎn)移(co-translational)與后轉(zhuǎn)移修飾的步驟之一,發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞表面蛋白發(fā)生糖基化的幾率幾乎超過(guò)50%。早在二十世紀(jì)的八十年代，有研究者發(fā)現(xiàn)，凝集素具有結(jié)合或殺死胚胎性的細(xì)胞癌和生殖系腫瘤細(xì)胞的能力，后來(lái)又發(fā)現(xiàn)，多潛能干細(xì)胞表面上的抗原常常顯示為糖蛋白或糖脂(Andrews PW等,Hybridoma, 1984.3 (4):347-61 ；Pere MF等，Differentiation, 1988.39 (2): 139-49),這提示蛋白質(zhì)特異性糖基化可能是細(xì)胞具有多潛能性的標(biāo)志。

上述研究結(jié)果表明 凝集素可能具有與多能性的細(xì)胞相互作用的特征(Draber P等，Somat Cell MolGenet, 1984.10:435-443 ；KosmehI H 等，Neoplasma 1989.36:29-39)。而且，膜結(jié)合蛋白和對(duì)應(yīng)配體的低聚糖化修飾常常介導(dǎo)細(xì)胞外分子或信號(hào)啟動(dòng)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)(Haltiwanger RS.Curr Opin Struct Biol2002.12 (5):593-8 ;Xia L 等，Blood,2004.104(10):3091-6)。人們發(fā)現(xiàn)，在許多細(xì)胞相關(guān)的事件，例如細(xì)胞分化(Moody AM等，Cell, 2001.107(4):501-12)以及腫瘤(Reis CA等，J Clin Pathol, 2010.63(4):322-9)發(fā)生中，均可觀察到蛋白糖基化的動(dòng)態(tài)變化。在胚胎水平，例如，小鼠胚胎多個(gè)組織器官的上皮細(xì)胞膜上，研究者發(fā)現(xiàn)其上有結(jié)合特異性凝集素的位點(diǎn)(Carter WG 等，J.Biol.Chem, 1975.250(7) =2756-62 ；NoguchiM等，J.Embryol.Exp.Morphol, 1982.72:39-52),進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，不同類型的凝集素在識(shí)別胚胎不同組織上皮方面具有差異性，有趣的是，當(dāng)用低劑量放射件射線照射小鼠胚胎后(0.25,0.50和0.75Gy)，細(xì)胞膜上結(jié)合SBA、PNA和DBA三種凝集素的表達(dá)量增加(Nievergelt-Egido MC等，Radiat Environ Biophys, 1993.32 (2):119-28),而且在胚胎不同區(qū)域，三種凝集素的結(jié)合強(qiáng)度不同。隨后在胚胎期發(fā)育的胰腺上皮和管狀細(xì)胞膜上，其他研究者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，上述細(xì)胞膜上有可特異性結(jié)合凝集素的位點(diǎn)，這表明識(shí)別細(xì)胞膜上特異性糖表位的凝集素可能作為一個(gè)指示細(xì)胞具有多能性的標(biāo)志，可用于表征胰腺前體細(xì)胞(Kobayashi 等,BBRC, 2002.293 (2):691-7)。近期研究發(fā)現(xiàn),路易斯寡糖(Lewis X antigen)在小鼠的胚胎干細(xì)胞、多潛能細(xì)胞和胚胎癌性細(xì)胞的細(xì)胞膜上均有表達(dá)，而不在人類相應(yīng)的胚胎干細(xì)胞、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或胚胎癌性細(xì)胞上表達(dá)(Muramatstu TA等，GlycoconjugateJournal, 2004.21:41-45),未來(lái)還需要進(jìn)一步研究這一不一致性。采用細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)方法，來(lái)自多個(gè)研究者的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，人類胚胎干細(xì)胞與其蛋白的糖基化密切相關(guān)(Xia L等，Blood, 2004.104:3091-6 ；Satomaa T等，BMCCell Biol, 2009.10:42 ；Venable A 等，BMCDev Biol 2005 ;5:15)。細(xì)胞膜上的特異性糖原表位可作為一個(gè)新的、特異性標(biāo)志，用于反映小鼠胚胎的早期分化狀態(tài)，其表達(dá)早于目前所發(fā)現(xiàn)的胚胎特異性抗原，如SSEA1，CD9和FA，而且，隨著胚胎分化進(jìn)程的發(fā)展，其膜上特異性糖原表位的表達(dá)逐漸降低并消失(Nash Rodney等,2006, stem cell.25(4):974-82)。Wang等采用培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞為研究對(duì)象，當(dāng)用凝集素芯片分析細(xì)胞抽提物后發(fā)現(xiàn)，特異性的凝集素可用來(lái)識(shí)別和分離胚胎干細(xì)胞(Wang YC等，Cell Research,2011.1-13)。。在成體水平，例如，識(shí)別D-半乳糖的刀豆凝集素(PNA)可用來(lái)對(duì)嚙齒動(dòng)物的造血干細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分群(Salner AL 等，1982, J Natl Cancer Inst.68 (4):639-41),甚至可用來(lái)從神經(jīng)組織中識(shí)別和分離出PNA陽(yáng)性的細(xì)胞群(Rietze RL等，Nature,2001.412(6848):736-9)，分選的細(xì)胞可能是干細(xì)胞。最近的研究發(fā)現(xiàn)，CD133+的人造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的N-糖基化模式與N-glycan結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)密切相關(guān)(Hemmoranta H等，Exp Hematol,2007.35(8):1279-92)。腫瘤/癌與凝集素腫瘤是機(jī)體細(xì)胞失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控而形成的新生物，是細(xì)胞自身調(diào)控和其所處的微環(huán)境相互作用的結(jié) 果，其治療仍是一個(gè)世界難題。目前腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)是癌干細(xì)胞(Cancer Stem Cells, CSCs)。早期由多倫多大學(xué)的分子生物學(xué)家JohnDick研究者提出“癌干細(xì)胞”理論(John Dick等，Nature, 1994.17:645-648)，這一新理論表明，癌癥的發(fā)生及難于根治的在于其內(nèi)癌干細(xì)胞(CSCs)的存在，隨后的多個(gè)癌癥研究中的研究結(jié)果支持此理論(ReyaT等，Nature, 2001.414:105-111),源自其他組織的進(jìn)一步研究證實(shí)了癌干細(xì)胞是存在的，它們?cè)诶缪骸⑷橄佟⒛X組織、肺組織和腸組織中存在(A1-Hajj M 等，PNAS，2003.100:3938-3988) ；He 等，Nat Genet, 2007.39:189-198 ；Kim CF等，Cell, 2005.121:823-835 ；Lapidot T 等，Nature, 1994.367:645-648 ；Ricc1-VitianiL 等，Nature, 2006 ；Singh SK 等，Nature, 2004.432:396-401 ；YiImaz OH 等，Nature,2006.441:475-482)?！鞍└杉?xì)胞”的提出給腫瘤的治療帶來(lái)曙光，因而，如果能夠識(shí)別癌干細(xì)胞將具有及其重要的臨床意義，例如通過(guò)靶向癌干細(xì)胞從而治愈腫瘤等，將產(chǎn)生重大的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。然而，遺憾的是，現(xiàn)在尚沒(méi)有很有效的方法從腫瘤組織中識(shí)別、分離出癌干細(xì)胞，這也意味著在治療中，不可能準(zhǔn)確而徹底地清除掉癌干細(xì)胞。這大大阻礙了針對(duì)腫瘤的有效治療。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞表面和其所處的微環(huán)境中大量糖鏈修飾改變以及凝集素受體功能異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用。其中，糖鏈合成的調(diào)控以及糖鏈與凝集素的相互作用參與了腫瘤生物學(xué)行為的各個(gè)方面。凝集素已廣泛應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞表面糖連接物的研究，其在腫瘤的生物學(xué)行為研究、診斷、治療及其預(yù)后方面起著十分重要的作用。成體干細(xì)朐:成體干細(xì)胞是另外一種特殊干細(xì)胞群，越來(lái)越多的證據(jù)表明成體干細(xì)胞可見于多種成熟組織(MooreKA, Science, 2006.311(5769): 1880-1885)，而成體干細(xì)胞研究的基礎(chǔ)和其在臨床上的應(yīng)用先決條件和最關(guān)鍵條件之一是對(duì)干細(xì)胞的有效且精準(zhǔn)篩選分離。當(dāng)前，研究者已鑒定到多個(gè)成體干細(xì)胞相關(guān)的分子表面標(biāo)志，例如Thy-llow、FLK2-Lineage-Sca-l+c_Kit+ 用于識(shí)別造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cells,HSCs) (Christemsen JL 等，PNAS,2001.98: 14541-14546 ；Uchida N 等，Experimentalhematology,1996.24:649-659), ISL1 +、Sca-1+ 或 c_kit+(Laugwitz KL,等，Nature.2004.433(7026):647-653 ；0kada S 等，Blood，1991.78 (7):1706-12 ；Matsuura K等，J Biol Chem，2004.279(12):11384-91), a 6brilOG7dim 用于識(shí)別表皮干細(xì)胞(LiA 等，PNAS, 1998.95(7):3902-7 ；Tani H 等，PNAS, 2000.97(20):10960-10965 ；Lavker RM 等，PNAS, 2000.97(25):13473-75)，雖然在成體干細(xì)胞特異分子標(biāo)志方面取得了一定進(jìn)展，但從成體中分離干細(xì)胞仍是極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)，一方面在于其數(shù)量較少且更難于定位、篩選分離各種組織特異性干細(xì)胞，另外一方面在于缺少可靠的特異性分子標(biāo)記物對(duì)其進(jìn)行識(shí)另O，目前特異的細(xì)胞表面標(biāo)記很難達(dá)到共識(shí)，其有效性需要進(jìn)一步分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開一種識(shí)別、純化干細(xì)胞的方法、試劑盒及其應(yīng)用方法，并進(jìn)
一步拓展其應(yīng)用。本發(fā)明人為實(shí)現(xiàn)上述目的，進(jìn)行了深入研究，結(jié)果本發(fā)明人驚喜的發(fā)現(xiàn)，特異性的凝集素不僅可用于識(shí)別嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物來(lái)源的正常組織或器官中的特異性成體干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、癌干細(xì)胞，而且也可用于從來(lái)源于所述物種的細(xì)胞群中純化出所述干細(xì)胞。本發(fā)明公開了一種采用凝集素用于識(shí)別、純化干細(xì)胞的方法，其包括:(I)在使所述細(xì)胞群與細(xì)胞預(yù)處理試劑預(yù)先接觸條件下，使樣品接觸一種凝集素，后者含有:(a)至少一種凝集素，其可識(shí)別糖蛋白和/或糖脂糖鏈末端特異位點(diǎn)，該凝集素與(b)至少一種結(jié)合物進(jìn)行直接或間接連接；和(2)將與所述凝集素結(jié)合物結(jié)合的細(xì)胞群從所述樣品中分離，獲得富含干細(xì)胞的樣品，其中，所述細(xì)胞上存在與所述凝集素特異親和性的受體表明它們是干細(xì)胞。其中，可通過(guò)加入洗脫糖的方法把所述凝集素結(jié)合物從所述細(xì)胞群上洗脫，從而獲得不含任何外來(lái)標(biāo)記的富含干細(xì)胞的樣品。其中，細(xì)胞預(yù)處理過(guò)程選擇采用沉淀或裂解法沉淀或裂解細(xì)胞群中的紅細(xì)胞的試齊U，所述試劑可選擇為質(zhì)量濃度為0.1 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；或可選擇為氯化銨紅細(xì)胞裂解液、質(zhì)量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；或可選擇泛影酸鈉-葡聚糖、HIT0PAQUE, Ficoll的任一一種進(jìn)行細(xì)胞預(yù)處理， 其中，所述試劑至少重復(fù)接觸所述細(xì)胞群一次。
其中，所述凝集素結(jié)合物中的凝集素包括天然的或化學(xué)合成的植物凝集素、動(dòng)物凝集素或其衍生物的一種或兩種以上的組合，所述凝集素的濃度為0.001 40mg/ml，與所述細(xì)胞群接觸的時(shí)間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于38°C。其中，所述凝集素結(jié)合物中的結(jié)合物可選擇預(yù)先與熒光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進(jìn)行結(jié)合，或選擇具有對(duì)凝集素有親和力抗體或抗體衍生物或抗體片段的一種。其中，所述與凝集素結(jié)合的聞分子量的生物大分子的分子量在一萬(wàn)道爾頓(Mw)至八十萬(wàn)道爾頓(Mw)之間，其中所述高分子量的生物大分子可選擇為牛血清白蛋白、羥乙基淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一種。其中，所述含干細(xì)胞的細(xì)胞群來(lái)源于嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物的成體組織、腫瘤/癌前組織、腫瘤/癌性組織、轉(zhuǎn)移瘤/癌組織或其他潛在包含干細(xì)胞的一種或兩種以上組織的組合，或選擇來(lái)自所述組織的原代、傳代細(xì)胞群的一種或兩種以上的組合。本發(fā)明還公開采用凝集素用于識(shí)別、純化干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，其中，所述凝集素還可用于確定組織、細(xì)胞群中干細(xì)胞存在與含量，其在用于從所述細(xì)胞群中富集、提純干細(xì)胞的用途。所述用于識(shí)別、純化干細(xì)胞的試劑盒，其包括:I)細(xì)胞預(yù)處理試劑A ；2)識(shí)別、純化試劑B ；3)以及任選的容器；`其中，所述細(xì)胞預(yù)處理試劑A可選擇為質(zhì)量濃度為01 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；或可選擇為氯化銨紅細(xì)胞裂解液、質(zhì)量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；所述細(xì)胞預(yù)處理試劑或可選擇泛影酸鈉-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一種，其中，所述試劑至少重復(fù)接觸所述細(xì)胞群一次。其中，識(shí)別、純化試劑B為凝集素結(jié)合物，包括但不限于天然的或人工合成的植物凝集素、動(dòng)物凝集素或其衍生物的一種或兩種以上的組合，其中所述凝集素結(jié)合物中的結(jié)合物可選擇預(yù)先與熒光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進(jìn)行結(jié)合，或選擇具有對(duì)凝集素有親和力抗體或抗體衍生物或抗體片段的一種，所述凝集素的濃度為
0.001 40mg/ml，與所述細(xì)胞群接觸的時(shí)間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于 38。。。其中，所述含干細(xì)胞的細(xì)胞群是嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物來(lái)源的正常成體和或病變、腫瘤、癌前、癌性、癌轉(zhuǎn)移組織，或來(lái)自所述組織的原代、傳代細(xì)胞群的一種或兩種以上的組合。其中，隨后可選擇采用熒光活化細(xì)胞分選法用于鑒定和分選結(jié)合凝集素結(jié)合化合物的細(xì)胞群或選擇沉淀法分離結(jié)合凝集素的所述細(xì)胞群，進(jìn)一步，分離的所述干細(xì)胞，其包含細(xì)胞膜上的可與凝集素結(jié)合的受體。其中，根據(jù)本發(fā)明方法、試劑盒獲得的純化的干細(xì)胞，可進(jìn)一步通過(guò)加入洗脫糖的方法把所述凝集素結(jié)合物從所述細(xì)胞上洗脫，從而使得獲得的干細(xì)胞不帶任何外來(lái)標(biāo)記物。
其中，所述識(shí)別、純化的干細(xì)胞包括全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、專能干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、癌干細(xì)胞，進(jìn)一步，其與已知干細(xì)胞標(biāo)志物接觸。其中，本發(fā)明所述試劑盒還包括洗脫糖，用于把所述凝集素結(jié)合物從所述細(xì)胞上洗脫，從而使得所述獲得含干細(xì)胞的樣品不帶任何外來(lái)標(biāo)記。其中，所述獲得的干細(xì)胞還可加入生理鹽水、PBS緩沖液、HBSS緩沖液以調(diào)整干細(xì)胞的濃度和體積。其中，根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒應(yīng)用方法，其應(yīng)用方法包括以下步驟:(I)所述細(xì)胞樣本與細(xì)胞預(yù)處理試劑A接觸:如加入紅細(xì)胞沉淀劑,選擇取上清；如加入紅細(xì)胞裂解液，選擇離心后丟棄上清取細(xì)胞沉淀；(2)使經(jīng)過(guò)步驟(I)的所述細(xì)胞群與所述識(shí)別、純化試劑B接觸，所述凝集素的濃度為0.001 40mg/ml，與所述細(xì)胞群接觸的時(shí)間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于38°C ；(3)分離獲得凝集素陽(yáng)性的細(xì)胞群:可選擇采用熒光活化細(xì)胞分選、磁珠分選法或靜置沉淀法；(4)加入洗脫糖把所述凝集素結(jié)合物從經(jīng)步驟(3)獲得的所述細(xì)胞上洗脫，從而使得獲得的干細(xì)胞不帶任何外來(lái)標(biāo)記物，進(jìn)一步，獲得的干細(xì)胞還可加入生理鹽水、PBS緩沖液、HBSS緩沖液以調(diào)整干細(xì)胞的濃度和體積。 所述分離的干細(xì)胞用于，例如生物化學(xué)、分子生物學(xué)或標(biāo)志物水平的進(jìn)一步分析，進(jìn)一步，所述細(xì)胞可以是同一表型或不同表型的集合，其中所述識(shí)別的干細(xì)胞包含至少I個(gè)，所述純化的干細(xì)胞包含至少為I %，優(yōu)選包含至少50%，更優(yōu)選包含至少70%，更優(yōu)選包含至少80 %，最優(yōu)選包含至少90 %。進(jìn)一步，所述分離的干細(xì)胞其細(xì)胞表面有可與凝集素結(jié)合物中的凝集素結(jié)合的受體，進(jìn)一步所述細(xì)胞與已知干細(xì)胞標(biāo)志物接觸，例如Sca-l、Alb、c-Kit、⑶90、Nkx2.5分子。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明所述的方法，可用于制備用于診斷樣品中干細(xì)胞存在和/或含量的診斷劑應(yīng)用。其中，本發(fā)明所述試劑盒識(shí)別、純化的干細(xì)胞為成體干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、癌干細(xì)胞，所述識(shí)別的干細(xì)胞包含至少I個(gè)，純化的干細(xì)胞的純度至少為1%。本發(fā)明所述成體干細(xì)胞，優(yōu)選出生后的組織獲得的干細(xì)胞。在諸如人類的哺乳動(dòng)物中，優(yōu)選的，從至少I歲大的個(gè)體中獲得的成體干細(xì)胞，優(yōu)選發(fā)育期后的個(gè)體，例如成年。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是成體干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞和/或癌干細(xì)胞。其中，檢測(cè)或分離干細(xì)胞的方法包括采用熒光活化細(xì)胞分選法(FACS)用于鑒定和純化結(jié)合凝集素結(jié)合物的細(xì)胞。其中，根據(jù)本發(fā)明所述方法、試劑盒獲得的分離的干細(xì)胞，進(jìn)一步，分離的干細(xì)胞，其包含細(xì)胞膜上的可與凝集素結(jié)合的受體。據(jù)此，本發(fā)明通過(guò)上述方法、試劑盒實(shí)現(xiàn)從所述嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物來(lái)源的樣品中識(shí)別、純化干細(xì)胞，并進(jìn)一步獲得不帶任何外來(lái)標(biāo)記的含所述干細(xì)胞的樣品，本發(fā)明所述分離的干細(xì)胞群在基礎(chǔ)與應(yīng)用研究、組織工程、治療、修復(fù)受損或病變組織、藥物篩選等中的應(yīng)用。 本發(fā)明所述試劑盒具有普遍適用性，可用于準(zhǔn)確且快速識(shí)別、純化嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物來(lái)源的干細(xì)胞。進(jìn)一步，所述試劑盒具有使用簡(jiǎn)捷、可工業(yè)化生產(chǎn)、特異性強(qiáng)、實(shí)用有效，應(yīng)用前景廣泛的優(yōu)點(diǎn)。


圖1識(shí)別、純化肺干細(xì)胞的結(jié)果圖，具體如實(shí)施例1。A圖表示同型對(duì)照組的流式圖(n = 2) ;Β圖表示分離、純化肺干細(xì)胞的流式圖，從細(xì)胞群中所純化的凝集素陽(yáng)性活細(xì)胞數(shù)量約為4.5% (n = 2) ；C圖表示所述肺干細(xì)胞的純度。圖2骨髓、臍帶血中識(shí)別、純化干細(xì)胞結(jié)果圖，具體如實(shí)施例2。A圖表示采用PE標(biāo)記的蝸牛凝集素(PE-HA)從骨髓細(xì)胞群中識(shí)別、純化干細(xì)胞的結(jié)果，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量為2.6% (η = 2),B圖表示細(xì)胞純度為95.7%；C圖表示采用PE標(biāo)記的荊豆凝集素(PE-UEA)從臍帶血細(xì)胞群中識(shí)別、純化干細(xì)胞的結(jié)果，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量為3.5%(n = 2)，D圖表示細(xì)胞純度為96.8 %。
·
圖3識(shí)別、純化肝癌干細(xì)胞的結(jié)果圖，具體如實(shí)施例3。A圖表示同型對(duì)照組，對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量為0.13% (n = 2) ；Β圖表示采用TRITC標(biāo)記的凝集素SJ(T-SJ)作為分子標(biāo)記從肝癌組織中提純干細(xì)胞的結(jié)果，凝集素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量為5.6% (n = 2) ；C圖表示新分離的T-SJ陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞群，星號(hào)指CD90+(綠色)細(xì)胞，其中細(xì)胞核用DAPI染色，圖片的放大倍數(shù)為100倍。圖4采用本發(fā)明試劑盒從細(xì)胞群中識(shí)別、純化肝干細(xì)胞和肺干細(xì)胞的結(jié)果圖，具體如實(shí)施例4。A-C圖表示肝干細(xì)胞的純化及顯微鏡觀察結(jié)果，其中，A圖表示同型對(duì)照組，對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量為0.05% (n = 2) ；Β圖表示采用明膠結(jié)合的凝集素PT從肝臟細(xì)胞群中純化干細(xì)胞并用FITC-PT進(jìn)行流式鑒定分析的結(jié)果，凝集素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量為2.6% (η = 2)；C圖表示新分離的細(xì)胞群，短箭頭指F-PT+/Alb+肝干細(xì)胞，星號(hào)指F-PT+/Alb-肝干細(xì)胞。A’ -C’圖表示肺干細(xì)胞的純化及顯微鏡觀察結(jié)果，其中，A’圖表示同型對(duì)照組，對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量為0.19% (n = 2) ;Β’圖表示采用明膠結(jié)合的凝集素RC從肺臟細(xì)胞群中純化干細(xì)胞并用TRITC-RC進(jìn)行流式鑒定分析的結(jié)果，凝集素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量為4.3% (n = 2) ;C’圖表示新分離的細(xì)胞群，箭頭指T-RC+(紅色)/c-Kit+(綠色)肺干細(xì)胞。細(xì)胞核用DAPI染色，圖片的放大倍數(shù)為100倍。圖5采用本發(fā)明試劑盒從細(xì)胞群中識(shí)別、純化心干細(xì)胞的結(jié)果圖，具體如實(shí)施例
5。A圖表示同型對(duì)照組,對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量為0.1% (n = 2) ；Β圖表示采用FITC標(biāo)記的凝集素SJ(F-SJ)作為分子標(biāo)記從心臟細(xì)胞群中純化干細(xì)胞的結(jié)果，凝集素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量為
4.9% (n = 2) ；C圖表示新分離的F-SJ陽(yáng)性的細(xì)胞群，其中細(xì)胞核用DAPI染色，短箭頭指F-SJ陽(yáng)性心臟干細(xì)胞，長(zhǎng)箭頭指F-SJ+/Nkx2.5+心臟干細(xì)胞，圖片的放大倍數(shù)為100倍。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例以詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施例目的是為了清楚的說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，并不是用于限制本發(fā)明，任何基于本發(fā)明的修飾、替換、改變均落在本發(fā)明的精神范疇和保護(hù)范圍之內(nèi)。如本發(fā)明所述，除非上下文另有明確指示，否則沒(méi)有限定對(duì)象的含義。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，本發(fā)明文中“一種”指“至少一種”。術(shù)語(yǔ)“包含”、“包括”、“含有”、“選擇”是同義詞，是具有包容性的或者開放性的，并且不排除額外的未詳述的成員、要素或方法步驟。如本發(fā)明所述，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞群”是指一個(gè)或一個(gè)以上的細(xì)胞的組合，通常是指一組細(xì)胞，除非另有說(shuō)明，否則該術(shù)語(yǔ)是指由本發(fā)明所述分離的細(xì)胞組成或包含此處分離的細(xì)胞的細(xì)胞群體。如本發(fā)明所述，術(shù)語(yǔ)“組織”包括從嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物獲得的正常組織或器官標(biāo)本、腫瘤/癌前組織、腫瘤/癌組織、轉(zhuǎn)移瘤/癌組織。所述細(xì)胞群源自嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物正常組織或器官標(biāo)本、腫瘤/癌前組織、腫瘤/癌組織、轉(zhuǎn)移瘤/癌組織，源自上述物種中所制備的原代細(xì)胞群、所述細(xì)胞群的傳代細(xì)胞或所建立的細(xì)胞系中獲得，其可由具有共同表型的細(xì)胞組成或包含至少部分具有共同表型的細(xì)胞組成，當(dāng)細(xì)胞在一個(gè)或多個(gè)顯著特征上基本相似或一致時(shí)，可以認(rèn)為細(xì)胞具有共同表型，其特征包括但不限于形態(tài)外觀，某細(xì)胞成分或產(chǎn)物(RNA、蛋白質(zhì)或其它物質(zhì))的表達(dá)的有無(wú)或水平、某生化途徑的活力、增殖能力和或動(dòng)力學(xué)行為、分化潛能和或?qū)Ψ只盘?hào)的響應(yīng)或體外培養(yǎng)行為。因此這種顯著特征可以定為一個(gè)細(xì)胞群或其部分。如本發(fā)明所述，術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”是指能夠長(zhǎng)期自我更新(即不分化而能夠增殖)的祖細(xì)胞，處于靜息或增殖，其中干細(xì)胞的后代或至少其一部分基本保持了親代干細(xì)胞未特化的或者相對(duì)較少特化的表型、分化潛能、以及增殖能力。該術(shù)語(yǔ)包括能夠基本上無(wú)限自我更新的干細(xì)胞，即:和親代相比，后代或其部分進(jìn)一步增殖的能力沒(méi)有顯著降低，以及表現(xiàn)出有限的自我更新的干細(xì)胞，即:和母細(xì)胞相比，后代或其部分進(jìn)一步增殖的能力顯著降低?；谄洚a(chǎn)生細(xì)胞的類型，所述干細(xì)胞或祖細(xì)胞可以是多能的、全能的、專能的、或單能的一種或以上的組合。術(shù)語(yǔ)“含干細(xì)胞的細(xì)胞群”在本發(fā)明中指含有至少一種干細(xì)胞或祖細(xì)胞，或者包含部分祖細(xì)胞或干細(xì)胞的細(xì)胞群。通常，所述部分的干細(xì)胞或祖細(xì)胞可以具有共同表型，也可具有不同表型。如本文所用的，本發(fā)明文中術(shù)語(yǔ)“嚙齒動(dòng)物”指大鼠、小鼠等；“哺乳動(dòng)物”指人類、牛、馬、狗、兔、猴等。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“離體”包括離開動(dòng)物或人類的組織或細(xì)胞且在體外保存或增殖，例如保存在培養(yǎng)容器中。術(shù)語(yǔ)“活檢”包括采用本領(lǐng)域普遍了解的方法從動(dòng)物或人類組織或器官中獲得組織。本文中的“正常組織或器官標(biāo)本”指健康的、未轉(zhuǎn)化的、非惡性、非癌性或非致瘤的 組織或器官標(biāo)本。任何病理學(xué)家、本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定組織是否是健康的、未轉(zhuǎn)化的、非惡性、非癌性或非致瘤的。本發(fā)明源于本發(fā)明人的深入研究，本發(fā)明人驚喜的發(fā)現(xiàn)特異凝集素可用于從嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物正常組織或器官標(biāo)本、腫瘤/癌前組織、腫瘤/癌組織、轉(zhuǎn)移瘤/癌組織中識(shí)別、純化出成體干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞或癌干細(xì)胞，進(jìn)一步可用于從來(lái)源于上述組織的原代細(xì)胞群、傳代細(xì)胞群、建立的細(xì)胞系中識(shí)別、純化出所述干細(xì)胞。本發(fā)明的目的在于公開一種采用特異凝集素結(jié)合物用于識(shí)別、純化干細(xì)胞的方法，其中包括，采用特定凝集素結(jié)合物用于從嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物來(lái)源的樣品中識(shí)別、純化成體干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、癌干細(xì)胞的方法，其中，所述樣品源自嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物的離體、活檢或通過(guò)常規(guī)手段獲得的任意一種或兩種以上組織中制備的原代細(xì)胞群、傳代細(xì)胞群、細(xì)胞系。本發(fā)明的另一目的在于公開一種從含干細(xì)胞的細(xì)胞群中識(shí)別和純化干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，其中，所述細(xì)胞群源自嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物的任意一種或兩種以上組織中制備的原代細(xì)胞群、傳代細(xì)胞群或建立的細(xì)胞系。進(jìn)一步，所述試劑盒具有使用簡(jiǎn)捷、特異性強(qiáng)、實(shí)用有效、可工業(yè)化生產(chǎn)、應(yīng)用前景廣泛的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明公開了一種采用凝集素用于識(shí)別、純化干細(xì)胞的方法，其包括:
(I)在使所述細(xì)胞群與細(xì)胞預(yù)處理試劑預(yù)先接觸條件下，使樣品接觸一種凝集素，后者含有:(a)至少一種凝集素，其可識(shí)別糖蛋白和/或糖脂糖鏈末端特異位點(diǎn)，該凝集素與(b)至少一種結(jié)合物進(jìn)行直接或間接連接；和(2)將與所述凝集素結(jié)合物結(jié)合的細(xì)胞群從所述樣品中分離，獲得富含干細(xì)胞的樣品，其中，所述細(xì)胞上存在與所述凝集素特異親和性的受體表明它們是干細(xì)胞。其中，可通過(guò)加入洗脫糖的方法把所述凝集素結(jié)合物從所述細(xì)胞群上洗脫，從而獲得不含任何外來(lái)標(biāo)記的富含干細(xì)胞的樣品。其中，細(xì)胞預(yù)處理過(guò)程選擇采用沉淀或裂解法沉淀或裂解細(xì)胞群中的紅細(xì)胞的試齊U，所述試劑可選擇為質(zhì)量濃度為0.1 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；或可選擇為氯化銨紅細(xì)胞裂解液、質(zhì)量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；或可選擇泛影酸鈉-葡聚糖、HITOPAQUE, Ficoll的任一一種進(jìn)行細(xì)胞預(yù)處理過(guò)程，其中，所述試劑至少重復(fù)接觸所述細(xì)胞群一次。其中，所述凝集素結(jié)合物中的凝集素包括天然的或化學(xué)合成的植物凝集素、動(dòng)物凝集素或其衍生物的一種或兩種以上的組合，所述凝集素的濃度為0.001 40mg/ml，進(jìn)一步，所述凝集素的濃度至少為0.001mg/ml,至少為0.5mg/ml,至少為3mg/ml,至少為6mg/ml,至少為12mg/ml,至少為20mg/ml,至少為25mg/ml,至少為30mg/ml,不超過(guò)40mg/ml。其中，所述凝集素結(jié)合物與所述細(xì)胞群接觸的時(shí)間為小于或等于120分鐘，進(jìn)一步，接觸時(shí)間至少為lmin、至少為lOmin、至少為20min、至少為30min、至少為40min、至少為lhrs、至少為 2hrs。其中，所述凝集素結(jié)合物與細(xì)胞群的孵育溫度為小于或等于38°C。進(jìn)一步，至少為2°C、至少為8°C、至少為12°C、至少為16°C、至少為20°C、至少為24°C、至少為28°C、至少為32°C、不超過(guò) 38 °C。其中，所述凝集素結(jié)合物中的結(jié)合物可選擇預(yù)先與熒光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進(jìn)行結(jié)合，或選擇具有對(duì)凝集素有親和力抗體或抗體衍生物或抗體片段的一種。其中，所述與凝集素結(jié)合的聞分子量的生物大分子的分子量在一萬(wàn)道爾頓(Mw)至八十萬(wàn)道爾頓(Mw)之間，其中所述高分子量的生物大分子可選擇為牛血清白蛋白、羥乙基淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一種。其中，所述含干細(xì)胞的細(xì)胞群來(lái)源于嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物的成體組織、腫瘤/癌前組織、腫瘤/癌性組織、轉(zhuǎn)移瘤/癌組織或其他潛在包含干細(xì)胞的一種或兩種以上組織的組合，或選擇來(lái)自所述組織的原代、傳代細(xì)胞群的一種或兩種以上的組合。本發(fā)明還公開采用凝集素用于識(shí)別、純化干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，其中，所述凝集素還可用于確定組織、細(xì)胞群中干細(xì)胞存在與含量，其在用于從所述細(xì)胞群中富集、提純干細(xì)胞的用途。所述用于識(shí)別、純化干細(xì)胞的試劑盒，其包括:
I)細(xì)胞預(yù)處理試劑A ；2)識(shí)別、純化試劑B;3)以及任選的容器；其中，所述細(xì)胞預(yù)處理試劑A可選擇為質(zhì)量濃度為0.1 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；或可選擇為氯化銨紅細(xì)胞裂解液、質(zhì)量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；所述細(xì)胞預(yù)處理試劑或可選擇為泛影酸鈉-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一種，其中，所述試劑至少重復(fù)接觸所述細(xì)胞群一次。其中，識(shí)別、純化試劑B為凝集素結(jié)合物，包括但不限于天然的或人工合成的植物凝集素、動(dòng)物凝集素或其衍生物的一種或兩種以上的組合，其中所述凝集素結(jié)合物中的結(jié)合物可選擇預(yù)先與熒光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進(jìn)行結(jié)合，或選擇具有對(duì)凝集素有親和力抗體或抗體衍生物或抗體片段的一種，所述凝集素的濃度為
0.001 40mg/ml，與所述細(xì)胞群接觸的時(shí)間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于 38。。。其中，所述含干細(xì)胞的細(xì)胞群是嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物來(lái)源的正常成體和或病變、腫瘤、癌前、癌性、癌轉(zhuǎn)移組織，或來(lái)自所述組織的原代、傳代細(xì)胞群的一種或兩種以上的組合。其中，隨后可選擇采用熒光活化細(xì)胞分選法用于鑒定和分選結(jié)合凝集素結(jié)合化合物的細(xì)胞群或選擇沉淀法分離結(jié)合凝集素的所述細(xì)胞群，進(jìn)一步，分離的所述干細(xì)胞，其包含細(xì)胞膜上的可與凝集素結(jié)合的受體。`其中，根據(jù)本發(fā)明方法獲得的純化的干細(xì)胞，可進(jìn)一步通過(guò)加入洗脫糖的方法把所述凝集素結(jié)合物從所述細(xì)胞上洗脫，從而使得獲得的干細(xì)胞不帶任何外來(lái)標(biāo)記物。其中，本發(fā)明所述試劑盒還包括洗脫糖，用于把所述凝集素結(jié)合物從所述細(xì)胞上洗脫，從而使得所述獲得含干細(xì)胞的樣品不帶任何外來(lái)標(biāo)記。其中，所述識(shí)別、純化的干細(xì)胞包括全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、專能干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、癌干細(xì)胞，進(jìn)一步，其與已知干細(xì)胞標(biāo)志物接觸。其中，所述獲得的干細(xì)胞還可加入生理鹽水、PBS緩沖液、HBSS緩沖液以調(diào)整干細(xì)胞的濃度和體積。其中，根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒應(yīng)用方法，其應(yīng)用方法包括以下步驟:(I)所述細(xì)胞樣本與細(xì)胞預(yù)處理試劑A接觸:如加入紅細(xì)胞沉淀劑,選擇取上清；如加入紅細(xì)胞裂解液，選擇離心后丟棄上清取細(xì)胞沉淀；(2)使經(jīng)過(guò)步驟(I)的所述細(xì)胞群與所述識(shí)別、純化試劑B接觸，所述凝集素的濃度為0.001 40mg/ml，與所述細(xì)胞群接觸的時(shí)間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于38°C ；(3)分離獲得凝集素陽(yáng)性的細(xì)胞群:可選擇采用熒光活化細(xì)胞分選、磁珠分選法或靜置沉淀法；(4)加入洗脫糖把所述凝集素結(jié)合物從經(jīng)步驟(3)獲得的所述細(xì)胞上洗脫，從而使得獲得的干細(xì)胞不帶任何外來(lái)標(biāo)記物，進(jìn)一步，獲得的干細(xì)胞還可加入生理鹽水、PBS緩沖液、HBSS緩沖液以調(diào)整干細(xì)胞的濃度和體積。
其中，本發(fā)明所述識(shí)別、純化的干細(xì)胞為成體干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、癌干細(xì)胞，進(jìn)一步，所述分離干細(xì)胞其細(xì)胞表面有可與凝集素結(jié)合物中的凝集素結(jié)合的受體，進(jìn)一步與已知干細(xì)胞標(biāo)志物接觸，例如Sca-1、Alb、c-Kit、CD90、Nkx2.5分子。其中，本發(fā)明還包括采用所述凝集素用于確定樣品中干細(xì)胞存在與含量。其中，本發(fā)明所述結(jié)合凝集素的結(jié)合物也可選擇與允許放射性成像、正電子發(fā)射斷層掃描、核磁共振成像或X射線或計(jì)算機(jī)斷層掃描的物質(zhì)結(jié)合。其中，凝集素陽(yáng)性細(xì)胞群的提純(純化)可采用流式細(xì)胞儀(與熒光素結(jié)合的凝集素)、磁珠篩選(包被了凝集素的磁珠)、吸附柱或其它已知的提純手段獲得，例如，免疫親和提純，結(jié)合化合物與固體支持物結(jié)合，再比如，淘選，結(jié)合化合物與組織培養(yǎng)皿結(jié)合。進(jìn)一步，如果用熒光素標(biāo)記凝集素，利用流式細(xì)胞儀的方法從細(xì)胞群中純化目標(biāo)細(xì)胞是優(yōu)選的，更優(yōu)選熒光激活細(xì)胞分類儀(FACS)分離所述細(xì)胞，通過(guò)使用該裝置，可以自動(dòng)分離、回收目標(biāo)細(xì)胞。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明的方法、試劑盒所識(shí)別的干細(xì)胞包含至少I個(gè)，進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明的方法、試劑盒所提純干細(xì)胞的純度至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%、至少50%、至少45%、至少40%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%、至少15%、至少10%、至少5%或至少1%。應(yīng)當(dāng)理解，許多凝集素都是本領(lǐng)域已知的信息。術(shù)語(yǔ)“凝集素”是指共有結(jié)合糖脂或糖蛋白特異性的碳水化合物基團(tuán)特性的蛋白質(zhì)組。所述凝集素可以從天然來(lái)源純化凝集素，例如從植物、動(dòng)物、真菌、藻類和細(xì)菌，或者選擇修飾的凝集素或其衍生物(天然的或合成的)，或者通過(guò)化學(xué)合成它。凝集素衍生物包括多-亞單位凝集素中的一個(gè)或多個(gè)亞單位。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中 ，凝集素可選擇植物凝集素，凝集素可以商業(yè)上從許多商業(yè)供應(yīng)商那里獲得，例如Sigma公司。進(jìn)一步，所述結(jié)合凝集素的結(jié)合物也可選擇與允許放射性成像、正電子發(fā)射斷層掃描、核磁共振成像或X射線或計(jì)算機(jī)斷層掃描的物質(zhì)結(jié)合。本發(fā)明還涉及凝集素結(jié)合物在用于從所述細(xì)胞群中識(shí)別、純化干細(xì)胞的用途。本發(fā)明的試劑盒的瓶中的凝集素組合物可以是藥學(xué)上可接受的溶液的形式，例如與無(wú)菌鹽水、PBS緩沖液或其它藥學(xué)上可接受的無(wú)菌液體組合?；蛘撸梢詢龈苫蚋稍锏哪亟M合物，在此類情況下，試劑盒還任選的包含裝在容器中的藥學(xué)上可接受的溶液，例如生理鹽水、PBS緩沖液等，優(yōu)選無(wú)菌的，以溶解所述凍干或干燥凝集素組合物。本發(fā)明所述的樣品包括，例如能夠通過(guò)將組織或器官標(biāo)本機(jī)械剪切、或破碎成更小的組織塊從而從實(shí)體器官中獲得單細(xì)胞懸液。任選的，能夠通過(guò)諸如化學(xué)制劑例如EDTA和或通過(guò)使用，膠原酶、分散酶、胰蛋白酶或胰酶制劑的消化特性將獲得的組織小塊進(jìn)一步分散為單個(gè)的細(xì)胞。骨髓和或(臍帶)血液、尿液、腦脊液可被視為天然細(xì)胞懸液。其中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法、試劑盒可獲得的分離的結(jié)合凝集素結(jié)合物的干細(xì)胞，當(dāng)需要從凝集素結(jié)合物分離干細(xì)胞時(shí)，能夠通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的多種方法來(lái)進(jìn)行分離，例如，通過(guò)加入洗脫糖，或通過(guò)改變PH值或鹽濃度來(lái)進(jìn)行所述干細(xì)胞與凝集素結(jié)合物的分離。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，所述分離的干細(xì)胞及其子代也屬于本發(fā)明的精神范疇和保護(hù)范圍。分離的干細(xì)胞，其包含細(xì)胞膜上的可與凝集素結(jié)合的受體?；诒景l(fā)明所述的分離的干細(xì)胞，可對(duì)其進(jìn)行基因修飾，例如，使所述干細(xì)胞與核酸接觸以修飾基因組序列，然后分離其中基因組序列已被修飾的干細(xì)胞，之后應(yīng)用于治療等應(yīng)用。進(jìn)一步，任何對(duì)基于本發(fā)明所獲得的干細(xì)胞的修飾、應(yīng)用，例如通過(guò)任何本發(fā)明所述的方法獲得的干細(xì)胞或干細(xì)胞的組合物在制備用于治療受損或患病組織的藥物中的用途，這均屬于本發(fā)明的精神范疇和保護(hù)范圍。進(jìn)一步，采用本發(fā)明所述識(shí)別純化方法、試劑盒所獲得的干細(xì)胞群在基礎(chǔ)與應(yīng)用研究、組織工程、治療、修復(fù)受損或病變組織、藥物篩選等中的應(yīng)用。實(shí)施例實(shí)施例1、肺干細(xì)胞的識(shí)別及其純化材料:DAP1、雙花扁豆凝集素DBA購(gòu)自Sigma，膠原酶(Sigma)、胎牛血清、DMEM/F-12K培養(yǎng)基、血球計(jì)數(shù)板、氯化銨(IX)。洗滌緩沖液:PBS(pH值為7.4±0.1);封閉緩沖液:在洗滌緩沖液(PBS)中加入3% BSA ;抗原修復(fù)液:檸檬酸緩沖液；透膜緩沖液:TBS (0.1% Triton+PBS)。其中，凝集素的結(jié)合物選擇為FITC標(biāo)記。a)新鮮活檢肺組織放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用PBS緩沖液清洗3次，每次3 5min，隨后，用無(wú)菌眼科剪剪切組織為小碎塊，轉(zhuǎn)入盛有膠原酶/胰蛋白酶消化液的50ml離心管中，在37°C, IOOrpm消化45min 60min,隨后加入4°C預(yù)冷的含10%胎牛血清(Fetal bovineserum, FBS)的DMEM/F12K培養(yǎng)基終止反應(yīng)，再用一次性注射器將經(jīng)消化的組織塊吹打成單細(xì)胞懸液，之后，在4°C，以200g離心3 5min，棄上清后加入4°C預(yù)冷的含2% FBS的PBS，輕輕混勻，經(jīng)180目篩網(wǎng)過(guò)濾入另一個(gè)50ml離心管中，加入NH4C1裂解液后混勻，室溫放置3 5min，在4°C，以200g離心3 5min，棄上清后加入Iml 4°C預(yù)冷含2% FBS的PBS混勻，用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞被等分為兩份，一份加入F-DBA，其中凝集素的濃度為5mg/ml，一份加入等體積過(guò)量的同型對(duì)照(圖1.A)，兩份細(xì)胞均在37°C避光孵育30 60min，之后，在4°C，以200g離心3 5min后，丟棄上清，加入4°C預(yù)冷的含2% FBS的PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分選F-DBA+細(xì)胞群(圖1.B)，純化的干細(xì)胞純度為94% (圖1.C)。在分析前，添加碘化丙碇(PD來(lái)排除分析中的死細(xì)胞。結(jié)果:采用本發(fā)明的方法能夠識(shí)別肺組織中的干細(xì)胞并進(jìn)一步可對(duì)其進(jìn)行純化(圖1)，可進(jìn)一步加入N-乙酰胺半乳糖胺把所述凝集素結(jié)合物從所述細(xì)胞群中洗脫，從而獲得不帶任何外來(lái)標(biāo)記的細(xì)胞樣品，并進(jìn)一步，加入生理鹽水調(diào)節(jié)所述樣品中干細(xì)胞的濃度和體積。實(shí)施例2、骨髓、臍帶血干細(xì)胞的識(shí)別及其純化分別制備骨髓、臍帶血。材料:同實(shí)施例1,其中右旋糖酐(Sigma)、HP、UEA購(gòu)自Vector,凝集素的結(jié)合物為牛血清白蛋白(BSA)。方法:a):加入6 15%質(zhì)量濃度的右旋糖酐于骨髓細(xì)胞懸液中，接觸細(xì)胞的時(shí)間為30min從而沉淀紅細(xì)胞，隨后吸取上清在4°C，以230g離心3 5min，棄上清后加入4°C預(yù)冷的含2% FBS的PBS，輕輕混勻，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾入另一個(gè)離心管中用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，胎盤藍(lán)染色細(xì)胞存活率98%，隨加入BSA結(jié)合的凝集素HP，其中，凝集素的濃度為1.2mg/ml，在35°C條件下接 觸60min后，吸取下層細(xì)胞沉淀，分選的細(xì)胞群可進(jìn)一步用洗脫糖N-乙酰半乳糖胺把凝集素結(jié)合物從細(xì)胞膜上洗脫下來(lái)，在4°C，以230g離心2 3min，棄上清后加入4°C預(yù)冷含1% FBS的PBS混勻。隨后，在4°C，以230g離心3 5min后，丟棄上清，加入4°C預(yù)冷的含I % FBS的PBS重懸細(xì)胞，從而獲得不含任何外來(lái)標(biāo)記的細(xì)胞群，進(jìn)一步可加入PBS緩沖液調(diào)節(jié)干細(xì)胞的濃度和體積。采用流式細(xì)胞儀鑒定分析所述細(xì)胞群的數(shù)量及純度，結(jié)果表明陽(yáng)性細(xì)胞的百分比為2.6% (圖2.A)，識(shí)別、純化的干細(xì)胞純度為95.7% (圖2.B)。在分析前，添加碘化丙碇(PI)來(lái)排除分析中的死細(xì)胞。b)加入6 15%質(zhì)量濃度的右旋糖酐于臍帶血細(xì)胞懸液中，接觸細(xì)胞的時(shí)間為40min從而沉淀紅細(xì)胞，隨后吸取上清在4°C，以220g離心3 5min，棄上清后加入4°C預(yù)冷的含2% FBS的PBS，輕輕混勻，經(jīng)160目篩網(wǎng)過(guò)濾入另一個(gè)離心管中用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，胎盤藍(lán)染色細(xì)胞存活率98%，離心丟棄上清后加入BSA結(jié)合的凝集素UEA，其中，凝集素的濃度為2.lmg/ml，在37°C條件下接觸45min后，吸取下層細(xì)胞沉淀，識(shí)別、純化的細(xì)胞群可進(jìn)一步用洗脫糖海藻糖把凝集素結(jié)合物從細(xì)胞膜上洗脫下來(lái)，在4°C，以220g離心2 3min，棄上清后加入4°C預(yù)冷含I % FBS的PBS混勻。隨后，在4°C，以220g離心3 5min后，丟棄上清，加入4°C預(yù)冷的含1% FBS的PBS重懸細(xì)胞，從而獲得不含任何外來(lái)標(biāo)記的細(xì)胞群，進(jìn)一步可加·入生理鹽水調(diào)節(jié)干細(xì)胞的濃度和體積。采用流式細(xì)胞儀鑒定分析陽(yáng)性細(xì)胞群的數(shù)量，結(jié)果表明陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量為3.5% (圖2.C)，識(shí)別、純化的干細(xì)胞純度為96.8% (圖2.D)。在分析前，添加碘化丙碇(PI)來(lái)排除分析中的死細(xì)胞。結(jié)果:采用本發(fā)明所述方法能夠從骨髓、臍帶血中識(shí)別、純化出干細(xì)胞(圖2)。實(shí)施例3、肝癌組織中肝癌干細(xì)胞的識(shí)別及其純化組織制備:制備了來(lái)自成體動(dòng)物的肝癌組織，組織經(jīng)PBS緩沖液清洗，清洗3次，每次3 5min。材料:同實(shí)施例1，其中TRITC標(biāo)記的SJ凝集素(T-SJ)購(gòu)自Sigma。方法:a)無(wú)菌條件下獲得新鮮肝癌組織轉(zhuǎn)入無(wú)菌培養(yǎng)皿中后，用無(wú)菌眼科剪剪切組織為小碎塊，再轉(zhuǎn)入盛有膠原酶/胰蛋白酶份散酶消化液的50ml離心管中，在37°C，IOOrpm消化45min 60min后，加入4°C預(yù)冷的含 10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的DMEM/F12K培養(yǎng)基終止反應(yīng)，再用一次性注射器將經(jīng)消化的組織塊吹打成單細(xì)胞懸液，之后，在40C，以180g離心3 5_，棄上清后加入4°C預(yù)冷的含2% FBS的PBS，輕輕混勻，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾入另一個(gè)50ml離心管中，加入0.2%氯化鈉裂解紅細(xì)胞，作用時(shí)間為30second Imm,再加入1.6%氯化鈉恢復(fù)溶液至等滲,之后在4°C,以180g離心3 5min,棄上清后加入4°C預(yù)冷含2% FBS的PBS混勻，用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞被等分為兩份，一份加入T-SJ，凝集素濃度為0.03mg/ml，一份加入等體積過(guò)量的同型對(duì)照，兩份細(xì)胞均在4°C條件下避光孵育100mm，之后，在4°C，以180g離心3 5min后，丟棄上清，加入4°C預(yù)冷的含2% FBS的PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分選T-SJ+細(xì)胞群，純化的干細(xì)胞純度為85%。在分析前，添加碘化丙碇(PI)來(lái)排除分析中的死細(xì)胞。b) 4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 40mim，室溫放置40min 60min后，再依次經(jīng)抗原修復(fù)(55°C 75°C,30min 80min)、室溫冷卻(30min 60min)后加入透膜緩沖液與固定細(xì)胞孵育，孵育時(shí)間為20 40min，之后加入BSA封閉(室溫，30min 60min)，PBS洗去剩余未結(jié)合BSA之后，用抗CD90抗體與固定細(xì)胞進(jìn)行孵育，4°C過(guò)夜孵育，再用PBS洗去未結(jié)合抗體，之后加入FITC- 二抗及DAPI，室溫孵育30min 120min后，再用PBS洗去未結(jié)合抗體及DAPI，室溫干燥后封片。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)，檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量為一個(gè)以上。結(jié)果:采用本發(fā)明的方法能夠從肝癌組織中識(shí)別干細(xì)胞并進(jìn)一步可對(duì)其進(jìn)行純化(圖 3)。實(shí)施例4、識(shí)別、純化肝干細(xì)胞和肺干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法所述試劑盒包括:I)細(xì)胞預(yù)處理試劑A:氯化銨(IX);2)識(shí)別、純化試劑B:明膠結(jié)合的PT和RC ；3)容器:用于盛放I)、2)兩種溶液的圓形試劑瓶；所述試劑盒還包括洗脫糖N-乙酰葡糖胺、半乳糖試劑。其他實(shí)驗(yàn)材料:同實(shí)施例1。應(yīng)用方法:a)加入等體積的NH4C1裂解液(溶液A)與細(xì)胞群混勻，室溫放置2 3min，在40C，以200g離心3 5min，棄上清后加入Iml 4°C預(yù)冷含2% FBS的PBS重懸細(xì)胞沉淀，之后用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞被等分為兩份，一份加入明膠結(jié)合的凝集素，其中凝集素的濃度為4.8mg/ml，在37°C條件下靜置30 45`min，之后，取下層細(xì)胞沉淀，識(shí)別、純化的細(xì)胞群可進(jìn)一步用N-乙酰葡糖胺、半乳糖兩種洗脫糖把凝集素結(jié)合物從細(xì)胞膜上洗脫下來(lái)，在4°C，以220g離心2 3min，棄上清后加入4°C預(yù)冷含1% FBS的PBS混勻。隨后，在4°C，以220g離心3 5min后，丟棄上清，加入4°C預(yù)冷的含I % FBS的PBS重懸細(xì)胞，從而獲得不含任何外來(lái)標(biāo)記的細(xì)胞群，進(jìn)一步可加入生理鹽水調(diào)節(jié)干細(xì)胞的濃度和體積。采用流式細(xì)胞儀鑒定分析陽(yáng)性細(xì)胞群的數(shù)量，結(jié)果表明陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量分別為2.6% (圖4.B)、4.3% (圖4.8’)，純化的肝干細(xì)胞和肺干細(xì)胞純度分別為80%、89%。在分析前，添加碘化丙碇(PD來(lái)排除分析中的死細(xì)胞。b) 4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 30mim，室溫放置30min 60min后，再依次經(jīng)抗原修復(fù)(55°C 75°C,30min 80min)、室溫冷卻(30min 60min)后加入透膜緩沖液與固定細(xì)胞孵育，孵育時(shí)間為20 40min，之后加入BSA封閉(室溫，30min 60min)，PBS洗去剩余未結(jié)合BSA之后，用抗-Alb抗體、抗-c-Kit抗體分別與固定含肝干細(xì)胞、肺干細(xì)胞的載玻片進(jìn)行孵育，4°C孵育過(guò)夜后，再用PBS洗去未結(jié)合抗體，含肝干細(xì)胞的載玻片加入對(duì)應(yīng)的凝集素、TRITC- 二抗及DAPI，含肺干細(xì)胞的載玻片加入對(duì)應(yīng)的凝集素、FITC- 二抗及DAPI，均在室溫孵育30min 120min后，再用PBS洗去未結(jié)合抗體及DAPI，室溫干燥后封片。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)，檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量為一個(gè)以上。結(jié)果:采用本發(fā)明試劑盒能夠從混合細(xì)胞群中識(shí)別肝干細(xì)胞和肺干細(xì)胞并進(jìn)一步可對(duì)其進(jìn)行純化(圖4)。實(shí)施例5、識(shí)別、純化心臟干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法所述試劑盒包括:I)細(xì)胞預(yù)處理試劑A:0.2%氯化鈉；2)識(shí)別、純化試劑B =FITC-SJ凝集素；3)容器:用于盛放I)、2)兩種溶液的方形試劑瓶；
所述試劑盒還包括洗脫糖N-乙酰葡糖胺試劑。其他實(shí)驗(yàn)材料:同實(shí)施例1。應(yīng)用方法:a)加入0.2%氯化鈉(溶液A)與細(xì)胞群混勻，室溫放置30second Imin后加入
1.6%氯化鈉恢復(fù)溶液至等滲,在4°C,以200g離心3 5min,棄上清后加入Iml 4°C預(yù)冷含2% FBS的PBS重懸細(xì)胞沉淀，之后用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞被等分為兩份，一份加入凝集素，其中，凝集素的濃度為7.6mg/ml，一份加入等體積的過(guò)量同型對(duì)照，兩份細(xì)胞在16°C條件下均避光孵育45 60min，之后，在4°C，以200g離心3 5mm后，丟棄上清，加入4°C預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分選凝集素陽(yáng)性細(xì)胞群，純化的干細(xì)胞純度為89%。在分析前，添加碘化丙碇(PD來(lái)排除分析中的死細(xì)胞。收集所述干細(xì)胞進(jìn)一步加入洗脫糖N-Z酰葡糖胺把所述凝集素結(jié)合物從所述細(xì)胞群中洗脫，從而獲得不帶任何外來(lái)標(biāo)記的細(xì)胞樣品，其中，可進(jìn)一步加入生理鹽水以調(diào)節(jié)樣品的體積和濃度。b) 4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 30mim，室溫放置30min 60min后，再依次經(jīng)抗原修復(fù)(55°C 75°C,30min 80min)、室溫冷卻(30min 60min)后加入透膜緩沖液與固定細(xì)胞孵育，孵育時(shí)間為30 60min，之后BSA封閉(室溫，30min 60min)，PBS洗去剩余未結(jié)合BSA之后，用抗Nkx2.5抗體與固定細(xì)胞進(jìn)行孵育，4°C孵育過(guò)夜，再用PBS洗去未結(jié)合的抗體，再加入TRITC- 二抗及DAPI室溫孵育60min 120min后，再用PBS洗去未結(jié)合抗體及DAPI，室溫干燥后封片。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)，檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量為一個(gè)以上。結(jié)果:采用本發(fā)明所述試劑盒能夠從混合細(xì)胞群中識(shí)別心臟干細(xì)胞并進(jìn)一步可對(duì)其進(jìn)行純化(圖5)。工業(yè)實(shí)用性 如上所述，依照本發(fā)明的方法、試劑盒，可以用一種簡(jiǎn)單、快速且經(jīng)濟(jì)的方法，一方面準(zhǔn)確且有效地識(shí)別出成體干細(xì)胞，另一方面可以高同收率地純化成體干細(xì)胞，而由此得到的含細(xì)胞液體無(wú)需隨后繁瑣的細(xì)胞懸液制備過(guò)程，可直接進(jìn)行深低溫保藏，且所述含干細(xì)胞的樣品可不帶任何外來(lái)標(biāo)記，以便其用于基礎(chǔ)研究和醫(yī)療應(yīng)用相關(guān)的產(chǎn)業(yè)，如干細(xì)胞自我更新機(jī)理及相關(guān)技術(shù)研究、干細(xì)胞用于治療、修復(fù)受損或病變組織、干細(xì)胞移植技術(shù)領(lǐng)域、免疫治療領(lǐng)域以及藥物篩選等。
權(quán)利要求
1.集素用于識(shí)別、純化干細(xì)胞的方法，其特征在于，其包括: (1)在使所述細(xì)胞群與細(xì)胞預(yù)處理試劑預(yù)先接觸條件下，使樣品接觸一種凝集素，后者含有:(a)至少一種凝集素，其可識(shí)別糖蛋白和/或糖脂糖鏈末端特異位點(diǎn)，該凝集素與(b)至少一種結(jié)合物進(jìn)行直接或間接連接；和 (2)將與所述凝集素結(jié)合物結(jié)合的細(xì)胞群從所述樣品中分離，獲得富含干細(xì)胞的樣品，其中，所述細(xì)胞上存在與所述凝集素特異親和性的受體表明它們是干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，可通過(guò)加入洗脫糖的方法把凝集素結(jié)合物從所述細(xì)胞群上洗脫，從而獲得不含任何外來(lái)標(biāo)記的富含干細(xì)胞的樣品。
3.胞預(yù)處理過(guò)程選擇采用沉淀或裂解法沉淀或裂解細(xì)胞群中的紅細(xì)胞的試劑，所述試劑可選擇為質(zhì)量濃度為0.1 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；或可選擇為氯化銨紅細(xì)胞裂解液、質(zhì)量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；或可選擇泛影酸鈉-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一種進(jìn)行細(xì)胞預(yù)處理，其中，所述試劑至少重復(fù)接觸所述細(xì)胞群一次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝集素結(jié)合物中的凝集素包括天然的或化學(xué)合成的植物凝集素、動(dòng)物凝集素或其衍生物的一種或兩種以上的組合，所述凝集素的濃度為0.001 40mg/ml，與所述細(xì)胞群接觸的時(shí)間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于38°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述凝集素結(jié)合物中的結(jié)合物可選擇預(yù)先與熒光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進(jìn)行結(jié)合，或選擇具有對(duì)凝集素有親和力抗體或抗體衍生物或抗體片段的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述與凝集素結(jié)合的高分子量的生物大分子的分子量在一萬(wàn)道爾頓(Mw)至八十萬(wàn)道爾頓(Mw)之間，其中所述高分子量的生物大分子可選擇為牛血清白蛋白、羥乙基淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述含干細(xì)胞的細(xì)胞群來(lái)源于嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物的成體組織、腫瘤/癌前組織、腫瘤/癌性組織、轉(zhuǎn)移瘤/癌組織或其他潛在包含干細(xì)胞的一種或兩種以上組織的組合，或選擇來(lái)自所述組織的原代、傳代細(xì)胞群的一種或兩種以上的組合。
8.集素用于識(shí)別、純化干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，其中，所述凝集素還可用于確定組織、細(xì)胞群中干細(xì)胞存在與含量，其在用于從所述細(xì)胞群中富集、提純干細(xì)胞的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于識(shí)別、純化干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括: 1)細(xì)胞預(yù)處理試劑A； 2)識(shí)別、純化試劑B； 3)以及任選的容器； 其中，所述細(xì)胞預(yù)處理試劑A可選擇為質(zhì)量濃度為01 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；或可選擇為氯化銨紅細(xì)胞裂解液、質(zhì)量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；細(xì)胞預(yù)處理試劑或可選擇為泛影酸鈉-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一種，其中，所述試劑至少重復(fù)接觸所述細(xì)胞群一次。
其中，識(shí)別、純化試劑B為凝集素結(jié)合物，包括但不限于天然的或人工合成的植物凝集素、動(dòng)物凝集素或其衍生物的一種或兩種以上的組合，其中所述凝集素結(jié)合物中的結(jié)合物可選擇預(yù)先與熒光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進(jìn)行結(jié)合，或選擇具有對(duì)凝集素有親和力抗體或抗體衍生物或抗體片段的一種，所述凝集素的濃度為·0.0Ol 40mg/ml，與所述細(xì)胞群接觸的時(shí)間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于 38。。。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述含干細(xì)胞的細(xì)胞群是嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物來(lái)源的正常成體和或病變、腫瘤、癌前、癌性、癌轉(zhuǎn)移組織，或來(lái)自所述組織的原代、傳代細(xì)胞群的一種或兩種以上的組合。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或9中任一權(quán)利要求所述，其中，隨后可選擇采用熒光活化細(xì)胞分選法用于鑒定和分選結(jié)合凝集素結(jié)合化合物的細(xì)胞群或選擇沉淀法分離結(jié)合凝集素的所述細(xì)胞群，進(jìn)一步，分離的所述干細(xì)胞，其包含細(xì)胞膜上的可與凝集素結(jié)合的受體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或9中任一權(quán)利要求的方法、試劑盒獲得的純化的干細(xì)胞，其特征在于，通過(guò)加入洗脫糖的方法把所述凝集素結(jié)合物從所述細(xì)胞上洗脫，從而使得獲得的干細(xì)胞不帶任何外來(lái)標(biāo)記物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1、10、11或12中任一權(quán)利要求所述，其中所述識(shí)別、純化的干細(xì)胞包括全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、專能干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、癌干細(xì)胞，進(jìn)一步，其與已知干細(xì)胞標(biāo)志物接觸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或9任一權(quán)利要求所述，獲得的干細(xì)胞還可加入生理鹽水、PBS緩沖液、HBSS緩沖液以 調(diào)整干細(xì)胞的濃度和體積。
15.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒應(yīng)用方法，其特征在于，其應(yīng)用方法包括以下步驟: (1)所述細(xì)胞樣本與細(xì)胞預(yù)處理試劑A接觸:如加入紅細(xì)胞沉淀劑，選擇取上清；如力口入紅細(xì)胞裂解液，選擇離心后丟棄上清取細(xì)胞沉淀； (2)使經(jīng)過(guò)步驟(I)的所述細(xì)胞群與所述識(shí)別、純化試劑B接觸，所述凝集素的濃度為·0.001 40mg/ml，與所述細(xì)胞群接觸的時(shí)間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于 38 0C ； (3)分離獲得凝集素陽(yáng)性的細(xì)胞群:可選擇采用熒光活化細(xì)胞分選、磁珠分選法或靜置沉淀法； (4)加入洗脫糖把所述凝集素結(jié)合物從經(jīng)步驟(3)獲得的所述細(xì)胞上洗脫，從而使得獲得的干細(xì)胞不帶任何 外來(lái)標(biāo)記物，進(jìn)一步，獲得的干細(xì)胞還可加入生理鹽水、PBS緩沖液、HBSS緩沖液以調(diào)整干細(xì)胞的濃度和體積。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)、干細(xì)胞、腫瘤學(xué)領(lǐng)域，公開了一種識(shí)別、純化干細(xì)胞的方法、試劑盒及其應(yīng)用方法，更具體而言，本發(fā)明涉及采用新的標(biāo)志物用于從嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物來(lái)源的樣品中識(shí)別、純化干細(xì)胞的方法、及相應(yīng)的識(shí)別、純化干細(xì)胞的試劑盒及其用途，本發(fā)明所公開的方法及試劑盒可有效且精準(zhǔn)的用于從所述源自人類或其他哺乳動(dòng)物的細(xì)胞群中識(shí)別、純化出干細(xì)胞，進(jìn)一步，所述純化后含干細(xì)胞的樣品可不帶任何外來(lái)標(biāo)記，以便于基礎(chǔ)研究和醫(yī)療應(yīng)用，同時(shí)可通過(guò)加入常規(guī)緩沖液用于調(diào)節(jié)其濃度和體積。本發(fā)明所述的試劑盒具有使用簡(jiǎn)捷、經(jīng)濟(jì)、可工業(yè)化生產(chǎn)、實(shí)用有效的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還涉及獲得的干細(xì)胞及它們?cè)谥T如研究或治療中的廣泛用途。
文檔編號(hào)C12N5/071GK103087980SQ20121044011
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月28日
發(fā)明者李福生, 盧磊磊, 盧淼淼, 盧晶晶 申請(qǐng)人:盧磊磊, 李福生