專利名稱：一種從水稻種子生產(chǎn)和分離純化重組人抗胰蛋白酶(OsrAAT)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻遺傳密碼子優(yōu)化的OsrAAT基因、相關(guān)載體及其從轉(zhuǎn)基因水稻種子生產(chǎn)、分離和純化OsrAAT的方法。
背景技術(shù)：
·人α1-抗胰蛋白酶(AAT)，也稱為人α 1_蛋白酶抑制劑(α 1-ΡΙ)，是人外周血中最富含絲氨酸的蛋白酶抑制劑。其主要是在肝臟中合成，并在肺中抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Blank、Brantly，1994)。AAT缺乏癥是一種與肺氣腫和肝臟疾病相關(guān)的遺傳性疾病(Eriksson, 1996)。靜脈注射增加源自血衆(zhòng)的人α1-抗胰蛋白酶(plasma-derived AAT,pAAT)是治療AAT缺乏癥病人唯一可行的臨床治療方法(Heresi和Stoller，2008)。此外，AAT還有許多的治療用途，如在預(yù)防小鼠I型糖尿病、治療皮膚病(Lewis，Shapiro等，2005 ；Brown, 2006)，并在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的抗炎作用(許、戴等，2001)。目前，商業(yè)化生產(chǎn)的pAAT主要是來自人血漿，其產(chǎn)量受到血液供應(yīng)的限制，而且人源PAAT具有傳播新的或未知病原體的風(fēng)險(xiǎn)，因此確保其安全性顯得非常復(fù)雜(Karnaukhova,Ophir等,2006)。除此之外，為了滿足市場需求,生產(chǎn)重組al_抗胰蛋白酶(rAAT)并具有成本效益的替代方法也不斷被開發(fā)出來。1983年，大腸桿菌首先被用于生產(chǎn)無活性的rAAT (Bollen等，1983)。之后用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表過rAAT的最高水平可達(dá)到38mg/L(Karnaukhova等,2004)。但是，由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺乏轉(zhuǎn)錄后的修飾作用，其表達(dá)的rAAT也只能用于實(shí)驗(yàn)室研究。作為真核表達(dá)系統(tǒng)的酵母可以進(jìn)行高甘露糖類型的聚糖修飾作用(Cregg, Cereghino等,2000),但這種修飾與人聚糖結(jié)構(gòu)不同。缺失和異常的糖基修飾是妨礙酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組多糖蛋白的主要問題。盡管通過分批補(bǔ)料培養(yǎng)酵母來大規(guī)模生產(chǎn)rAAT的收率高達(dá)到1. 23g/L (Tamer和Chisti，2001)，然而，藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，酵母生產(chǎn)的rAAT會(huì)被迅速地從血液中清除(Casolaro，F(xiàn)ells等，1987)。也有研究用黑曲霉表達(dá)rAAT，因?yàn)槠涮腔Ｊ绞歉愃朴诓溉閯?dòng)物(Maras，van Die等，1999 ；Gerngross 2004 ;Ward, Lin 等，2004 ;Nevalainen, Te' ο 等，2005)。然而，并沒有研究這個(gè)系統(tǒng)中的聚糖修飾作用，而且50mg/L的表達(dá)水平是仍然很低。因此這個(gè)系統(tǒng)表達(dá)的rAAT也僅限于實(shí)驗(yàn)室研究。如小鼠、兔、山羊和綿羊等動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)也成功地表達(dá)了 rAAT (Carlson, Rogers等，1989 ；Archibald, McClenaghan 等，1990 ；Massoud, Bischoff 等，1991 ； Wright, Carver等，1991 ；Carver, Wright 等，1992 ；Ziomek, 1998).也從綿羊奶(DalrympIe 和 Garner,1998)和山羊奶(Ziomek，1998)中獲得大規(guī)模生產(chǎn)的rAAT。盡管從轉(zhuǎn)基因綿羊奶中分離的rAAT純度達(dá)99. 9%，然而在人類體內(nèi)，痕量的天然綿羊AAT和α1-抗糜蛋白酶便可以誘導(dǎo)一種全身性抗體應(yīng)答(Spencer, Humphries等,2005)。也有用植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)rAAT,包括水稻細(xì)胞(Terashima,Murai等，1999)、轉(zhuǎn)基因番爺(Agarwal, Singh等,2008)和葉綠體(Nadai, Bally等，2009)。其中，轉(zhuǎn)基因番茄和葉綠體中rAAT的表達(dá)水平分別達(dá)到總蛋白質(zhì)的1. 55%至2%。在水稻細(xì)胞中rAAT的產(chǎn)量達(dá)到200毫克/升。最近發(fā)現(xiàn)，谷物作物的胚乳細(xì)胞是很有潛力的可用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)。水稻胚乳已被用來表達(dá)各種重組藥物蛋白，如人乳鐵蛋白(Suzuki, Kelleher等，2003)、人溶菌酶(Yang, Guo等,2003)、rhIGF-Ι融合和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞群激活因子(Ning, Xie等，2008 ；Xie, Qiu等，2008)。最近，水稻種子成功地應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的重組人血清白蛋白(He，Ning等，2011)。這些研究表明，水稻胚乳是具有成本效益和安全性的藥物蛋白質(zhì)表達(dá)平臺(tái)。盡管使用不同的表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)rAAT已經(jīng)取得了進(jìn)步，然而大規(guī)模生產(chǎn)植物源重組人抗胰蛋白酶仍受到表達(dá)水平的限制。而且，至今未見有關(guān)使用水稻胚乳來大規(guī)模生產(chǎn)重組人抗胰蛋白酶的報(bào)道，也未見有關(guān)從水稻種子中分離純化重組人抗胰蛋白酶方法的報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種水稻遺傳密碼子優(yōu)化的重組人抗胰蛋白酶基因，以提高人抗胰蛋白酶基因在水稻種子的表達(dá)水平；本發(fā)明稱0srAAT(0ryZasatiVa AAT)基因，具有如SEQ ID NO.1所示的序列。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了含有上述OsrAAT基因的載體，優(yōu)選水稻胚乳細(xì)胞特異性表達(dá)載體，更優(yōu)選具有如圖3所示的結(jié)構(gòu)的載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述載體在制備OsrAAT轉(zhuǎn)基因水稻種子中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備OsrAAT轉(zhuǎn)基因水稻種子的方法，包括以下步驟(I)制備具有如SEQ ID NO.1所示序列的OsrAAT基因； (2)構(gòu)建水稻胚乳細(xì)胞特異性表達(dá)的OsrAAT表達(dá)載體和選擇性標(biāo)記基因載體；(3)將步驟2所獲得載體共轉(zhuǎn)化到水稻品種的愈傷再生組織中；(4)培養(yǎng)所述愈傷再生組織，經(jīng)篩選和誘導(dǎo)獲得OsrAAT轉(zhuǎn)基因水稻植株；(5)培養(yǎng)OsrAAT轉(zhuǎn)基因水稻植株，獲得OsrAAT轉(zhuǎn)因水稻種子。其中，所述OsrAAT表達(dá)載體優(yōu)選具有如圖3所示的結(jié)構(gòu)。其中，所述選擇性標(biāo)記基因載體優(yōu)選具有如圖4所示的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種從OsrAAT轉(zhuǎn)基因水稻種子中分離純化OsrAAT的方法，包括以下步驟(I)以O(shè)srAAT轉(zhuǎn)基因水稻種子為原料制備OsrAAT提取液；(2)以陰離子交換層析對OsrAAT提取液進(jìn)行初級純化，獲得初級OsrAAT洗脫液，其中所述陰離子交換層析的介質(zhì)為DEAE sepharose FF;(3)以陽離子交換結(jié)合金屬螯合的復(fù)合層析對初級OsrAAT洗脫液進(jìn)行中級純化，獲得中級OsrAAT洗脫液,其中所述復(fù)合層析的介質(zhì)為MacroprepCHT-1 ；(4)以陰離子交換結(jié)合疏水作用的復(fù)合層析對中級OsrAAT洗脫液進(jìn)行末級純化，獲得純化的OsrAAT,其中所述復(fù)合層析的介質(zhì)為Capto Adhere。進(jìn)一步地，上述方法包括以下步驟(I)以O(shè)srAAT轉(zhuǎn)基因水稻種子為原料，將稻谷脫殼成半精米并研磨成80-100目的米粉，將所述米粉與提取緩沖液以重量(kg)/體積(L)為1: 5-1 10的比例混合，常溫下提取I小時(shí)后將得到的混合物經(jīng)濾布式板框壓濾機(jī)壓濾，得到澄清的OsrAAT提取液；其中所述提取緩沖液的成分為20-25mM磷酸鹽緩沖液、l-4mM巰基乙醇，pH6. 9-7.1 ；(2)采用DEAE sepharose FF填料的層析柱進(jìn)行初級分離純化,采用8_12個(gè)柱體積的PH為6. 9-7.1的20-25mM磷酸鹽緩沖液，以100-180cm/h的流速平衡柱子；以步驟I的OsrAAT提取液作為上樣樣品，其中樣品電導(dǎo)為2-3. 5ms/cm, pH為6. 80-7. O.;用pH為6. 8-7.1的IOO-1lOmMPB緩沖液以100_180cm/h的流速洗脫樣品，收集含有OsrAAT的洗脫液，獲得初級OsrAAT洗脫液；(3)采用Macroprep CHT-1層析柱進(jìn)行次級純化分離，采用8-12個(gè)柱體積的pH為6. 9-7. 2的5-12mM磷酸鹽緩沖液以100_150cm/h的流速平衡柱子，以稀釋四倍的步驟2中的初級OsrAAT洗脫液為上樣樣品，其中樣品電導(dǎo)為2-3. 5mS/cm，pH為6. 8-7. O ;用pH為
6.8-7.1的IOO-1lOmMPB緩沖液以100_180cm/h的流速洗脫樣品，收集含有OsrAAT的洗脫液，獲得中級OsrAAT洗脫液； (4)采用Capto Adhere層析進(jìn)行精純，用8-12倍柱體積的pH為7. 5-8. 2的8_12mM磷酸鹽緩沖液以100-180cm/h的流速平衡柱子，以中級OsrAAT洗脫液為上樣樣品，其中樣品電導(dǎo)為 2-3. 5ms/cm, pH 為 6. 8-7.1 ;用 pH 為 6. 6-7. O 的 46mMPB, 400mMNaCl 緩沖液以100-180cm/h的流速洗脫樣品，收集含有OsrAAT的洗脫液，獲得純化的OsrAAT。進(jìn)一步地,上述分離純化OsrAAT的方法包括以下步驟(I)以O(shè)srAAT轉(zhuǎn)基因水稻種子為原料，將稻谷脫殼成半精米并研磨成80-100目的米粉，將所述米粉與提取緩沖液以重量/體積為Ikg IOL的比例混合，常溫下提取I小時(shí)后將得到的混合物經(jīng)濾布式板框壓濾機(jī)壓濾，得到澄清的迦rAAT提取液；其中所述提取緩沖液的成分為20mM磷酸鹽緩沖液、ImM巰基乙醇，pH7. O ；(2M^2OmUtJDEAE sepharose FF 填料裝于 Econo-column 15/20 層析柱上，用200ml pH為7. O的20mM磷酸鹽緩沖液，以150cm/h的流速平衡柱子；以O(shè)srAAT提取液作為上樣樣品，其中樣品電導(dǎo)為2. 6ms/cm，pH為6. 95 ;用pH為7. O的108mMPB緩沖液以150cm/h的流速洗脫樣品，收集含有OsrAAT的洗脫液，獲得初級OsrAAT洗脫液；(3)將 20ml 的 Macroprep CHT-1 填料裝于 Econo-column 15/20 層析柱上，用200ml pH為7. O的IOmM磷酸鹽緩沖液以150cm/h的流速平衡柱子，以稀釋四倍的步驟2中初級OsrAAT洗脫液為上樣樣品，其中樣品電導(dǎo)為3. 0ms/cm, pH為6. 90 ;用pH為7. O的108mMPB緩沖液以150cm/h的流速洗脫樣品，收集含有OsrAAT的洗脫液，獲得中級OsrAAT洗脫液；(4)將 IOml 的 Capto Adhere 裝于 Econo-column 15/20 層析柱上，用 200mlpH 為
8.O的IOmM磷酸鹽緩沖液以150cm/h的流速平衡柱子，以中級OsrAAT洗脫液為上樣樣品，其中樣品電導(dǎo)為3. 0ms/cm，pH為6. 90 ;用pH為6. 8的46mMPB，400mMNaCl緩沖液以150cm/h的流速洗脫樣品，收集含有OsrAAT的洗脫液，獲得純化的OsrAAT。


圖1是質(zhì)粒p0sPMP02的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是質(zhì)粒p0sPMP131的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3是質(zhì)粒p0sPMP132的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4是質(zhì)粒p0sPMP135的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5是Western雜交結(jié)果。顯示9株不同的轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)的OsrAAT均聚集在其胚乳細(xì)胞中。圖6是Southern雜交結(jié)果圖。其中，分別用EcoR1、HindIII以及同時(shí)用EcoRI和HindIII進(jìn)行酶切。圖7顯示了不同植株中OsrAAT的表達(dá)水平。圖8是以陰離子交換層析作為初級純化，用不同填料進(jìn)行層析的電泳圖譜；其中，圖8A 為 DEAE sepharose FF 填料，圖 8B 為 Macroprep DEAE 填料，圖 8C 為Capto Q填料；M :分子標(biāo)記,S :上樣樣品,FT :穿透峰,Elu OsrAAT洗脫峰，Elul :雜質(zhì)洗脫·峰，Elu2 =OsrAAT洗脫峰，CIP :在位清洗。圖9是以復(fù)合填料作為初級純化,用Macroprep CHT-1層析時(shí)的電泳圖譜；其中，M :分子標(biāo)記，S :上樣樣品，F(xiàn)T :穿透峰，Elu =OsrAAT洗脫峰，CIP :在位清洗。圖10是以疏水層析作為中級純化，用不同填料進(jìn)行層析時(shí)的電泳圖譜；其中圖1OA 為 Phenyl sepharose HP 填料，圖1OB 為 Phenyl sepharose FF HS 填料，圖1OC為Octyl sepharose FF填料；M :分子標(biāo)記,S :上樣樣品,FT :穿透峰,Elu OsrAAT洗脫峰，CIP :在位清洗。圖11是以復(fù)合填料作為中級純化，用不同填料進(jìn)行層析時(shí)的電泳圖譜；其中，圖1lA 為 Macropr印 CHT-1 填料，圖1lB 為 Capto MMC 填料，圖1lC 為 CaptoAdhere ；M :分子標(biāo)記,S :上樣樣品,FT :穿透峰,Elu :OsrAAT洗脫峰,Elul :雜質(zhì)洗脫峰，Elu2 =OsrAAT洗脫峰，CIP :在位清洗。圖12是以復(fù)合填料作為末級純化，用Capto Adhere層析時(shí)的電泳圖譜；其中，M :分子標(biāo)記，S :上樣樣品，F(xiàn)T :穿透峰，Elu =OsrAAT洗脫峰，CIP :在位清洗。圖13是以親和填料作為末級純化，用不同填料進(jìn)行層析是的電泳圖譜；其中，圖13A 為 AAT-select 填料，圖 13B 為 ConA sepharose 6B 填料;M :分子標(biāo)記，S :上樣樣品,FT :穿透峰,Elu OsrAAT洗脫峰，clean 圖14是含有rAAT的粗體液依次經(jīng)過陰離子交換層析、陽離子結(jié)合金屬螯合作用層析、陰離子結(jié)合疏水作用層析進(jìn)行純化的電泳圖譜；其中使用的填料從左到右依次為DEAE sepharose FF、Macroprep CHT-J^PCaptoAdhere ；M :分子標(biāo)記，S :上樣樣品，F(xiàn)T :穿透峰，Elu OsrAAT洗脫峰。圖15是純化后獲得的OsrAAT的HPLC純度圖譜(HPLC-SEC)。圖16是對OsrAAT生物活性的分析結(jié)果；其中，左圖是條帶轉(zhuǎn)移的SDS-PAGE分析結(jié)果，右圖是Western雜交結(jié)果；M :分子標(biāo)記，1: 132-17T1代植株的OsrAAT，2 :人血漿AAT，3 :添加了豬彈性蛋白酶的OsrAAT，4 :添加了豬彈性蛋白酶的人血漿AAT，5 :水稻中華11的提取物。圖17是OsrAAT的豬彈性蛋白酶抑制活性的測定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下通過結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對本發(fā)明方法的舉例說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。
以下實(shí)施例中使用的Macroprep CHT-1填料,生產(chǎn)商是伯樂(BIO-RAD)公司；DEAEFast Flow、Macroprep-DEAE、Capto Q、Phenyl sepharose HP、Phenylsepahrose FF HS、Octyl sepharose FF>Capto MMC>Capto Adhere>MT~seIect> ConA sepharose 6B填料，生產(chǎn)商是通用電氣(GE Healthcare)公司；Econo_columnl5/20層析柱,購自伯樂(BIO-RAD)公司；XK16/20層析柱，購自通用電氣(GE Healthcare)公司；其他實(shí)施材料和試劑除特別說明之處均為普通市售。實(shí)施例1水稻特異性表達(dá)重組人抗胰蛋白酶載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得人AAT基因(Genbank登記號(hào)NM001002235)，由Heron Blue生物技術(shù)公司根據(jù)水稻偏好的遺傳密碼子合成，將46. 5%的人α1-抗胰蛋白酶(AAT)遺傳密碼子進(jìn)行優(yōu)化并使18. 1%的人α1-抗胰蛋白酶核苷酸發(fā)生改變，具體如SEQID NO.1所示，但是其相應(yīng)的氨基酸序列沒有變化；本實(shí)施例選用水稻特異性啟動(dòng)子Gtl3a及其信號(hào)肽來介導(dǎo)重組人抗胰蛋白酶基因在水稻胚乳細(xì)胞中的表達(dá)，具體參考
發(fā)明者楊代常, 施倩妮, 張莉平 申請人:武漢禾元生物科技有限公司