專利名稱：光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化纖維素?zé)峤庖汉蛢?nèi)醚糖產(chǎn)類胡蘿卜素和單細(xì)胞蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以纖維素類生物質(zhì)的熱解液和內(nèi)醚糖為原料增養(yǎng)光合菌產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的方法，具體涉及利用光合細(xì)菌發(fā)酵纖維素?zé)峤庖汉蛢?nèi)醚糖產(chǎn)類胡蘿卜素和單細(xì)胞菌體蛋白。
背景技術(shù)：
類胡蘿卜素(carotenoids)是一種廣泛存在于植物和微生物中的重要天然性色素(羅璇，紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素提取工藝的優(yōu)化研究[J].生物技術(shù)，2007，17(4) :86-89)。類胡蘿卜素之所以具有重要的經(jīng)濟(jì)價值，是因其不僅具有預(yù)防癌癥和心血管疾病的功能， 可以廣泛地用于醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域(王歲樓.劉鳳珠.高建奇.紅酵母類胡蘿卜素發(fā)酵助劑的篩選及應(yīng)用[J].食品與生物技術(shù)，2002，21(1):1-5.)，作為光合作用的輔助色素，類胡蘿卜素還參與執(zhí)行光能傳遞和物質(zhì)轉(zhuǎn)化功能，具有抗光敏作用、淬滅自由基等重要的生理生態(tài)功能(張坤生.張亮.呂曉玲.陳曉娟.紅酵母色素抗氧化性質(zhì)的研究[J]，食品科學(xué)，2004，25(3) :61-63)。因動植物材料生長繁殖受季節(jié)、氣候、產(chǎn)地等因素的影響，原料不足，從中提取的色素價格昂貴，應(yīng)用受到局限，而利用微生物資源生產(chǎn)天然色素，克服以動植物為原料生產(chǎn)天然色素的諸多缺點，易于工業(yè)化(王君.微生物產(chǎn)天然色素的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報，2007，34(3) :580-583)。光合細(xì)菌是20億年前最早出現(xiàn)的利用光能進(jìn)行光合作用生長繁殖的原核古微生物，能夠進(jìn)行不放氧的光合作用，在自然界C、N、P的循環(huán)中起著重要的作用(楊官娥，張肇銘，熊琦.光合細(xì)菌的化學(xué)成分、生理活性研究及新應(yīng)用的進(jìn)展動態(tài).2004年中國藥學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文，2004)，其個體雖小，但營養(yǎng)成分極豐富，含有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白，菌體除含有蛋白、脂肪、可溶性糖類外還含有多種生物活性物質(zhì)，例如類胡蘿卜素、泛醌、葉酸、B族維生素、生物素等等。光合細(xì)菌不僅可以作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料添加劑，還可用于改善土壤質(zhì)量、防治植物病蟲害等(杜近義.光合細(xì)菌的開發(fā)應(yīng)用進(jìn)展[J].生物學(xué)通報，1998，33(11) :15-17)。通常光合細(xì)菌合成培養(yǎng)基成本較高，制約了其大規(guī)模的推廣應(yīng)用。因此降低生產(chǎn)成本，尋求廉價的原料是應(yīng)用中迫切需要解決的問題(楊啟銀，陳育如.菌肥用光合菌在纖維素水解液中的培養(yǎng)[J].南京師大學(xué)報，2001，24(3) :82-87)。本發(fā)明提供的方法，利用光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化經(jīng)濟(jì)廉價的纖維素類生物質(zhì)熱解產(chǎn)物產(chǎn)類胡蘿卜素，具有營養(yǎng)要求簡單，菌體無毒，營養(yǎng)豐富等優(yōu)點。纖維素類生物質(zhì)原料來源廣泛，成本低廉。本發(fā)明利用光合細(xì)菌將廉價的生物質(zhì)經(jīng)熱解后轉(zhuǎn)化為高值類胡蘿卜素和單細(xì)胞蛋白，是將纖維素類生物質(zhì)變廢為寶，提高環(huán)境效益和經(jīng)濟(jì)效益的有效途徑
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種利用廉價纖維素生物質(zhì)高溫?zé)峤猱a(chǎn)物培養(yǎng)光合細(xì)菌產(chǎn)類胡蘿卜素和單細(xì)胞蛋白的方法。本發(fā)明利用光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化從生物質(zhì)熱解得到的內(nèi)醚糖或熱解液產(chǎn)類胡蘿卜素和單細(xì)胞蛋白菌體，光合菌可用于污水處理、植物病蟲害防治和作為飼料添加劑等。將初始0D660值O. 2光合細(xì)菌接種到內(nèi)醚糖或纖維素?zé)峤庖号渲玫呐囵B(yǎng)基中，在300C，15001x光照，厭氧條件下培養(yǎng)7天，得到菌體，將菌體用鹽酸破壁2h后，丙酮萃取可得到類胡蘿卜素。本發(fā)明公開了一種制備類胡蘿卜素的方法，是將光合細(xì)菌接種到含內(nèi)醚糖的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)后得到菌體，菌體中含類胡蘿卜素。還公開了一種獲得光合菌單細(xì)胞蛋白的方法，是將光合細(xì)菌接種到含內(nèi)醚糖的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)后得到的菌體作為單細(xì)胞蛋白使用。 上述含內(nèi)醚糖的培養(yǎng)液配方為0. 2-20%內(nèi)醚糖、1%硫酸銨、O. 1%KH2P04、O. 5%MgS04、0. 01%FeS04、pH 為 2. 0-7. 0.內(nèi)醚糖濃度最好 1-5%, pH 最好為 4. 0-5. O。另一種利用光合細(xì)菌制備類胡蘿卜素和單細(xì)胞蛋白的方法，是用光全細(xì)菌對纖維素?zé)峤庖哼M(jìn)行轉(zhuǎn)化，具體是將光合細(xì)菌接種到以纖維素?zé)峤庖号渲煤玫呐囵B(yǎng)液中，培養(yǎng)后得到類胡蘿卜素和單細(xì)胞蛋白；所述培養(yǎng)液的配方為0. 2-20%熱解液、1%硫酸銨、
O.1%ΚΗ2Ρ04、0· 5%MgS04、0. 01%FeS04、pH 為 2. 0-7. O。所述纖維素是木材纖維素、竹材纖維素或秸桿纖維素。所述的光合細(xì)菌包括紫色光合細(xì)菌(Thermochromatium tepidum)、紅螺菌(Rhodospirillum sp.)、紅球菌(Rhodococcus sp.)、紅微菌(Rhodomicrobium sp.)菌株號ACCC00063、紅假單胞菌(Rhodopseudomonsi)等通稱為光合菌的單菌種或菌群。本發(fā)明所提及的微生物可以市購或從相關(guān)的微生物保藏機(jī)構(gòu)獲得。類胡蘿卜素的測量方法將浸提液適當(dāng)稀釋后用分光光度計在475nm下測定吸光值，按下式計算類胡蘿卜素含量。類胡蘿卜素的含量(ug/g)=AwXDXV/0·16XW式中Αλ_-最大吸收波長475nm下的吸光度，V-提取所用有機(jī)溶劑的總體積9(ml), D—浸提液稀釋倍數(shù)，W—干酵母菌體重量，O. 16—類胡蘿卜素的消光系數(shù)。實驗中所提到的熱解液是由本實驗室制得，具體是將秸桿、竹材、木材等生物質(zhì)廢料烘干并粉碎，利用管式爐熱解反應(yīng)器(主要由管式爐熱解器、電加熱器、溫控儀、冷凝和真空系統(tǒng)組成)在高溫條件下進(jìn)行熱解，收集冷凝得到的組分即為熱解液。


圖I紫色光合細(xì)菌菌量的增長曲線。
具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合具體的實驗和數(shù)據(jù)作進(jìn)一步的說明，舉例是為了說明本發(fā)明的過程，而非僅限于實施例。實施例I :配制O. 2% (W/W)、pH為5.0，內(nèi)醚糖為底物的培養(yǎng)基，具體的配方為O. 2%內(nèi)醚糖、1% 硫酸銨、O. 1%ΚΗ2Ρ04、0· 5%MgS04、0. 01%FeS04。接入紫色光合細(xì)菌(Thermochromatiumtepidum), 30°C, 1500x1光照,厭氧靜止培養(yǎng)7天，5000rpm離心收集菌體,3mol/L的鹽酸破壁，丙酮萃取獲得類胡蘿卜素，內(nèi)醚糖的同化率為79. 4%，類胡蘿卜素的量401.3ug/g，單細(xì)胞蛋白產(chǎn)量1.61g/L.實施例2 配制20% (WO、pH為5. O,內(nèi)醚糖為底物的培養(yǎng)基，具體的配方為20%內(nèi)醚糖、1% 硫酸銨、O. 1%ΚΗ2Ρ04、0· 5%MgS04、0. Ol%FeS04 接入的紫色光合細(xì)菌(Thermochromatiumtepidum), 30°C, 1500x1光照,厭氧靜止培養(yǎng)7天，5000rpm離心收集菌體,3mol/L的鹽酸破壁，丙酮萃取獲得類胡蘿卜素，內(nèi)醚糖的同化率為70%，類胡蘿卜素的量377. lug/g，單細(xì)胞蛋白的量1.34g/L.實施例3:配制2% (W/W)、pH為5.0，內(nèi)醚糖為底物的培養(yǎng)基，具體的配方為2%內(nèi)醚糖、1% 硫酸銨、O. 1%ΚΗ2Ρ04、0· 5%MgS04、0. 01%FeS04.接入的紫色光合細(xì)菌(Thermochromatiumtepidum), 30°C, 1500x1光照,厭氧靜止培養(yǎng)7天，5000rpm離心收集菌體,3mol/L的鹽酸破壁，丙酮萃取獲得類胡蘿卜素，內(nèi)醚糖的同化率為79. 2%，類胡蘿卜素的量517. 6ug/g，單細(xì)胞蛋白的量1.74g/L.實施例4 配制2% (WO、pH為5. O,內(nèi)醚糖為底物的培養(yǎng)基，具體的配方為2%內(nèi)醚糖、1%硫酸銨、0. 1%ΚΗ2Ρ04、0· 5%MgS04、0. 01%FeS04.接入 O. 1% 的紫色光合細(xì)菌(Thermochromatiumtepidum), 30°C, 1500x1光照,厭氧靜止培養(yǎng)7天,菌量增加如圖I所示。5000rpm離心收集菌體，3mol/L的鹽酸破壁，丙酮萃取獲得類胡蘿卜素，類胡蘿卜素的量132. 3ug/g，單細(xì)胞蛋白的量0. 83g/L.實施例5 配制2% (WO、pH為5.0，內(nèi)醚糖為底物的培養(yǎng)基，具體的配方為2%內(nèi)醚糖、1%硫酸銨、0. 1%ΚΗ2Ρ04、0· 5%MgS04、0. 01%FeS04。接入 10% 的紫色光合細(xì)菌(Thermochromatiumtepidum), 30°C, 1500x1光照,厭氧靜止培養(yǎng)7天，5000rpm離心收集菌體,3mol/L的鹽酸破壁，丙酮萃取獲得類胡蘿卜素，類胡蘿卜素的量517. 6ug/g，單細(xì)胞蛋白的量I. 74g/L.實施例6 配制2% (WO、pH為5. O,內(nèi)醚糖為底物的培養(yǎng)基，具體的配方為2%內(nèi)醚糖、1%硫酸銨、0. 1%ΚΗ2Ρ04、0· 5%MgS04、0. 01%FeS04。接入 5% 的紫色光合細(xì)菌(Thermochromatiumtepidum), 30°C, 1500x1光照,厭氧靜止培養(yǎng)7天，5000rpm離心收集菌體,3mol/L的鹽酸破壁，丙酮萃取獲得類胡蘿卜素，類胡蘿卜素的量374. 4ug/g，單細(xì)胞蛋白的量1.46g/L.實施例7 配制2% (WO、pH為2. O,內(nèi)醚糖為底物的培養(yǎng)基，具體的配方為2%內(nèi)醚糖、1%硫酸銨、0. 1%ΚΗ2Ρ04、0· 5%MgS04、0. 01%FeS04。接入 10% 的紫色光合細(xì)菌(Thermochromatiumtepidum), 30°C, 1500x1光照,厭氧靜止培養(yǎng)7天，5000rpm離心收集菌體,3mol/L的鹽酸破壁，丙酮萃取獲得類胡蘿卜素，類胡蘿卜素的量386. 3ug/g，單細(xì)胞蛋白的量I. 37g/L.實施例8 配制2% (WO、pH為7. O,內(nèi)醚糖為底物的培養(yǎng)基，具體的配方為2%內(nèi)醚糖、1%硫酸銨、O. 1%ΚΗ2Ρ04、0· 5%MgS04、0. 01%FeS04.接入 10% 的紫色光合細(xì)菌(Thermochromatiumtepidum), 30°C, 1500x1光照,厭氧靜止培養(yǎng)7天，5000rpm離心收集菌體,3mol/L的鹽酸破壁，丙酮萃取獲得類胡蘿卜素，類胡蘿卜素的量517. 6ug/g，單細(xì)胞蛋白的量2. 03g/L.實施例9 配制木材熱解液為底物的培養(yǎng)基，具體的配方為10%木材熱解液、1%硫酸銨、
O.1%ΚΗ2Ρ04、0· 5%MgS04、0. 01%FeS04, ρΗ5· O 接入 10% 的紫色光合細(xì)菌(Thermochromatiumtepidum), 30°C, 1500x1光照,厭氧靜止培養(yǎng)7天，5000rpm離心收集菌體,3mol/L的鹽酸破壁，丙酮萃取獲得類胡蘿卜素，內(nèi)醚糖的轉(zhuǎn)化率為31. 7%.類胡蘿卜素的量234.6ug/g，單細(xì)胞蛋白的量O. 72g/L..實施例10 配制木材熱解液為底物的培養(yǎng)基，具體的配方為O. 2%木材熱解液、1%硫酸銨、
O.1%ΚΗ2Ρ04、0· 5%MgS04、0. 01%FeS04, ρΗ5· O 接入 10% 的紫色光合細(xì)菌(Thermochromatiumtepidum), 30°C, 1500x1光照,厭氧靜止培養(yǎng)7天，5000rpm離心收集菌體,3mol/L的鹽酸破壁，丙酮萃取獲得類胡蘿卜素，類胡蘿卜素的量157. 3ug/g，單細(xì)胞蛋白的量0. 46g/L.實施例11 配制木材熱解液為底物的培養(yǎng)基，具體的配方為20%木材熱解液、1%硫酸銨、
0.1%ΚΗ2Ρ04、0· 5%MgS04、0. 01%FeS04, ρΗ5· O 接入 10% 的紫色光合細(xì)菌(Thermochromatiumtepidum), 30°C, 1500x1光照,厭氧靜止培養(yǎng)7天，5000rpm離心收集菌體,3mol/L的鹽酸破壁，丙酮萃取獲得類胡蘿卜素，類胡蘿卜素的量261. 2ug/g,單細(xì)胞蛋白的量I. 69g/L.實施例12 與實施例9基本相同，只是將木材熱解液替換為竹材熱解液。實施例13 與實施例12基本相同，只是將竹熱解液替換為秸桿熱解液。實施例14 與實施例I基本相同，其中的光合細(xì)菌為紅螺菌(Rhodospirillum sp.)ACCC00318。實施例15 與實施例I基本相同，其中的光合細(xì)菌為紅微菌(Rhodococcus sp. )ACCC00063。實施例16 與實施例I基本相同，其中的光合細(xì)菌為紅球菌(Rhodomicrobium sp.)MCCC1A00766。實施例17 與實施例I基本相同，其中的光合細(xì)菌為紅假單胞菌(Rhodopseudomonai )CGMCCI. 219。
權(quán)利要求
1.一種制備類胡蘿卜素的方法，其特征在于，是將光合細(xì)菌接種到含內(nèi)醚糖的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)后得到菌體，菌體中含類胡蘿卜素；培養(yǎng)液的配方為0. 2-20%內(nèi)醚糖、1%硫酸銨、0.1%KH2P04、0. 5%MgS04、0. 01%FeS04、pH 為 2. 0-7. O。
2.一種獲得光合菌單細(xì)胞蛋白的方法，是將光合細(xì)菌接種到含內(nèi)醚糖的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)后得到的菌體作為單細(xì)胞蛋白使用；培養(yǎng)液的配方為0. 2-20%內(nèi)醚糖、1%硫酸銨、0.1%KH2P04、0. 5%MgS04、0. 01%FeS04、pH 為 2. 0-7. O。
3.一種光合細(xì)菌對纖維素?zé)峤庖旱霓D(zhuǎn)化方法，其特征在于，是將光合細(xì)菌接種到以纖維素?zé)峤庖号渲煤玫呐囵B(yǎng)液中，培養(yǎng)后得到類胡蘿卜素和單細(xì)胞蛋白；所述培養(yǎng)液的配方為:0. 2-20% 熱解液、1% 硫酸銨、0. 1%KH2P04、0. 5%MgS04、0. 01%FeS04、pH 為 2. 0-7. O。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其持征在于所述纖維素是木材纖維素、竹材纖維素或秸桿纖維素。
5.根據(jù)權(quán)利要求I一 3之一所述的方法，其持征在于所述光合細(xì)菌包括紫色光合細(xì)胃(Thermochroma tium tepidum)^ il M (RhodospiriIlum sp. )、tE 5J< |if (Rhodococcussp.)、紅微菌(TPAot/offiicroAitt sp.)、紅假單胞菌)。
全文摘要
本發(fā)明涉及光合細(xì)菌及其應(yīng)用。利用纖維素?zé)峤庖汉蛢?nèi)醚糖培養(yǎng)光合細(xì)菌，所得光合細(xì)菌可以產(chǎn)類胡蘿卜素和單細(xì)胞蛋白，也可作為水質(zhì)改進(jìn)劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和處理污水或作為葉面肥等。將內(nèi)醚糖或纖維素?zé)峤庖?，制成培養(yǎng)液，在一定裝液量，轉(zhuǎn)化溫度條件下，培養(yǎng)一定時間得到富含類胡蘿卜素的光合菌菌體，提取類胡蘿卜素后的菌體可作為單細(xì)胞蛋白飼料使用。本發(fā)明利用光合細(xì)菌有效利用纖維素類生物質(zhì)的高溫?zé)峤猱a(chǎn)物和內(nèi)醚糖制備類胡蘿卜素和光合菌單細(xì)胞蛋白，是對纖維素生物質(zhì)的有效利用，可將來源豐富的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具更高附加值的產(chǎn)物，變廢為寶，具有良好的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境應(yīng)用潛力和社會效益。
文檔編號C12R1/01GK102978271SQ20121053192
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者陳育如, 趙乙萱, 孫歡, 劉軍利, 衛(wèi)民 申請人:南京師范大學(xué)