一種中國對蝦dwd抗菌肽分子的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種中國對蝦DWD抗菌肽分子的制備方法，還公開了該DWD抗菌肽在制備抗菌蛋白與蛋白酶抑制劑蛋白方面的應(yīng)用。利用本發(fā)明制備的重組中國對蝦具有雙乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域（DWD）抗菌肽能夠直接抑制常見細(xì)菌的生長，而且可以抑制細(xì)菌生長過程中分泌的蛋白酶的活性，可以在食品抗菌生物試劑、醫(yī)用抗生素替代品方面具有較大的應(yīng)用前景。
【專利說明】—種中國對蝦DWD抗菌肽分子的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種中國對蝦具有雙乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域(DWD)的抗菌肽分子的制備方法，以及這種DWD抗菌肽分子的抑菌活性與蛋白酶抑制劑活性的應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]長期以來，在我國食品和藥品行業(yè)存在著一個難以解決的問題，那就是食品行業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)廣泛使用的保鮮劑、抗菌劑、抗生素帶來的嚴(yán)重后果。食品行業(yè)目前廣泛使用的保鮮劑、抗菌劑多數(shù)屬于化學(xué)藥品和試劑，這些化學(xué)藥品和試劑與食品的包裝存在于一個空間，一旦被人體吸收將造成十分不良的后果；醫(yī)藥行業(yè)被廣泛使用的抗生素，目前已經(jīng)暴露出了濫用抗生素從而不斷刺激病菌浸染和致病能力增強(qiáng)的后果，因此，在食品和藥品行業(yè)尋找綠色、安全、對人體健康沒有影響的生物類抗菌物質(zhì)，已經(jīng)是一個科學(xué)研究的熱點(diǎn)問題了。
[0003]在動物的進(jìn)化史上，低等的動物不像我們?nèi)祟惥哂刑貏e發(fā)達(dá)的后天獲得性免疫系統(tǒng)，它們僅僅具有一個固有的、特定的先天免疫系統(tǒng)，正是因?yàn)檫@個較為低等的先天免疫系統(tǒng)的防御功能，才使得數(shù)量眾多的、進(jìn)化地位低等的無脊椎動物進(jìn)化到今天仍然存在于地球上，這也說明了這個低等的先天免疫系統(tǒng)防御功能的強(qiáng)大之處。通過不斷研究，存在于低等無脊椎動物體內(nèi)先天免疫系統(tǒng)的神秘面紗逐漸被揭開，原來在先天免疫系統(tǒng)中主要存在著細(xì)胞免疫和體液免疫兩種方式，當(dāng)病毒、細(xì)菌、真菌入侵這類動物機(jī)體的時候，這兩種免疫途徑幾乎是同時發(fā)揮功能的。其中，值得一提的是先天免疫系統(tǒng)體液免疫途徑中的抗菌肽分子是清除入侵細(xì)菌和真菌的主要免疫效應(yīng)分子，而且，抗菌肽分子幾乎是體液免疫途徑中多種信號傳導(dǎo)途徑的最后表達(dá)出來的那個執(zhí)行清除功能的效應(yīng)分子，針對革蘭氏陽性細(xì)菌、針對革蘭氏陰性細(xì)菌以及針對真菌入侵的各種信號傳導(dǎo)途徑，通過免疫刺激信號的逐級傳遞和放大，最終激活了相關(guān)抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，從而形式抗菌功能。因此，抗菌肽分子表達(dá)量的高低，直接關(guān)系到病原是否能夠被徹底清除。
[0004]在眾多抗菌肽分子中，有一類分子比較特別，這類抗菌肽分子的典型特點(diǎn)就是存在著由8個半胱氨酸殘基形成的4對二硫鍵而折疊形成的一個球狀實(shí)體結(jié)構(gòu)域,這個結(jié)構(gòu)域被稱為乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域，簡稱WAP結(jié)構(gòu)域，在不同的分子中WAP結(jié)構(gòu)域的數(shù)量有所不同，常見的是存在一個和兩個WAP結(jié)構(gòu)的抗菌肽分子。這類具有乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域的抗菌肽分子在發(fā)揮清除細(xì)菌作用的過程，主要是通過分子的活性位點(diǎn)針對細(xì)菌細(xì)胞壁的特殊結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，從而引起細(xì)菌細(xì)胞壁產(chǎn)生“漏洞”將細(xì)胞內(nèi)溶物釋放出來，引起細(xì)菌自身的死亡，所以，這類抗菌肽的抗菌活性具有廣泛的作用范圍。所以，這類抗菌肽具有如下的優(yōu)點(diǎn):第一，作用范圍廣。第二，作用條件溫和。第三，不會引起細(xì)菌的抗藥性問題。第四，對人體無危害，因?yàn)樗鼘儆诘鞍踪|(zhì)物質(zhì)，進(jìn)入人的腸道之后便可被蛋白酶徹底水解形成氨基酸營養(yǎng)物質(zhì)。
[0005]中國對蝦是我國稀有的水產(chǎn)產(chǎn)品，集中分布在我國東部沿海，也是我國主要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物。中國對蝦在進(jìn)化過程中，面臨白斑綜合癥病毒以及各種細(xì)菌的侵染能夠保持以較大的數(shù)量分布在我國東部沿海水域，說明其抗病毒、抗細(xì)菌、抗真菌能力特別強(qiáng)大。因此，如果將中國對蝦具有雙乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域(DWD)的抗菌肽在體外進(jìn)行重組表達(dá)，獲得具有抗菌活性和蛋白酶抑制劑活性的重組分子，它在食品抗菌、醫(yī)用抗生素替代方面具有較大的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種中國對蝦具有雙乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域(DWD)抗菌肽的制備方法，同時提供該DWD抗菌肽抑菌活性和蛋白酶抑制劑活性的研究方法。
[0007]技術(shù)解決方案:
[0008]本發(fā)明的具體方法如下:
[0009]I)中國對蝦DWD抗菌肽基因表達(dá)片段的克隆:取冷凍保存的中國對蝦3只-5只，無菌條件下解剖收集肝臟組織供100mg-150mg，利用動物基因組DNA小量提取試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)進(jìn)行中國對蝦肝臟基因組DNA的提取，具體方法參照試劑盒說明書。之后，以lyL-2yL中國對蝦肝臟基因組DNA作為模板，以前引物DWD-F:5'-tac tea gaa ttcacg aga ggcccg cta aag c_3 和后弓丨物 DWD-R:5 -tac tea ctc gag tct gcg ctt agaegg act g-3'作為擴(kuò)增中國對蝦DWD抗菌肽基因表達(dá)片段的一對引物，PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min-10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳處理，并且在凝膠成像儀紫外燈下將目的片段所在凝膠條帶切下回收，利用DNA膠回收試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)進(jìn)行目的片段的純化與回收，獲得中國對蝦DWD抗菌肽基因表達(dá)片段溶解液；
[0010]2)中國對蝦DWD抗菌肽基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建:取步驟(I)的中國對蝦DWD抗菌肽基因表達(dá)片段溶解液16 μ L，進(jìn)行內(nèi)切酶EcoR I和Xho I的雙酶切處理，20 μ L的體系中基因表達(dá)片段為16 μ L，內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer緩沖液為2 μ L，同時，取大腸桿菌pET_28a質(zhì)粒載體溶解液10 μ L進(jìn)行內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切處理，20 μ L的體系中質(zhì)粒載體溶解液為10 μ L，內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各I μ L，IOXH Buffer緩沖液為2 μ L，無菌水6 μ L，之后，取雙酶切處理的DWD抗菌肽基因表達(dá)片段6 μ L，雙酶切處理后的大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒載體溶解液2 μ L，再加T4DNA連接酶I μ L和IOX ligationbuffer緩沖液I μ L，在16°C金屬浴中進(jìn)行10h_12h連接，獲得連接產(chǎn)物；
[0011]3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5CI感受態(tài)細(xì)胞與陽性克隆子的篩選:將步驟(2)的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5a感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司產(chǎn)品)，主要是利用“熱激法”進(jìn)行轉(zhuǎn)化，要求卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為25 μ g/ μ L，將固體LB培養(yǎng)基平板在37°C條件下過夜培養(yǎng)10h-12h，之后，挑取固體LB培養(yǎng)基平板表面的單個白色菌落，以前引物 DWD-F:5'-tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3' 和后引物 DWD-R:5'-tactea ctc RaR tct gcg ctt aga egg actg-3'作為菌落PCR反應(yīng)的一對引物,進(jìn)行陽性克隆子的篩選，PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴(kuò)增出目的條帶的陽性菌落進(jìn)行菌種保存的同時，進(jìn)行LB液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)10h-12h，獲得陽性菌株菌液；
[0012]4)質(zhì)粒提取:取步驟(3)的陽性菌株菌液lmL，利用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)進(jìn)行質(zhì)粒提取，具體提取方法可以參照試劑盒說明書，獲得陽性重組質(zhì)粒;
[0013]5)轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞與陽性表達(dá)菌株的篩選:將步驟(4)的陽性重組質(zhì)粒，利用“熱激法”轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司產(chǎn)品)，要求卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為25 μ g/μ L，將固體LB培養(yǎng)基平板在37°C條件下過夜培養(yǎng)10h-12h，之后，挑取固體LB培養(yǎng)基表面的單個白色菌落，以前引物 DWD-F:5'_tac tea gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3' 和后引物 DWD-R:5'-tactea ctc RaR tct gcg ctt agacgg act g-3'作為菌落PCR反應(yīng)的一對引物,進(jìn)行陽性表達(dá)菌株的篩選，PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴(kuò)增出目的條帶的陽性菌落進(jìn)行菌種保存的同時，利用3mL-5mL液體LB培養(yǎng)基進(jìn)行液體震蕩培養(yǎng)10h_12h，液體搖瓶培養(yǎng)的條件為:37°C，180rp m-200rpm，培養(yǎng)12h_14h，獲得陽性表達(dá)菌株菌液；
[0014]6)中國對蝦DWD抗菌肽的誘導(dǎo)表達(dá)與親和純化:將步驟(5)的陽性表達(dá)菌株菌液作為誘導(dǎo)表達(dá)的母液，從中取ImL菌液在無菌條件下轉(zhuǎn)接到一瓶IOOmL新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為50μ g/mL，在37°C、180rpm-200rpm條件下轉(zhuǎn)培養(yǎng)3h-4h之后，在無菌條件下加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG最終物質(zhì)的量濃度為0.3mmol/L,誘導(dǎo)表達(dá)的條件為在37°C、180rpm-200rpm條件下誘導(dǎo)3h_4h,之后，6000rpm低速離心收集菌體，用20mLlXPBS緩沖液重新懸起菌體沉淀，在冰浴中進(jìn)行菌體沉淀的超聲波破碎50min (功率200w,超聲破碎Is、間歇2s,全程50min),結(jié)束后12000rpm高速離心收集上清液，取5mL上清液利用His-tag凝膠親和純化柱(上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的親和純化，方法可以參照試劑盒說明書，最后根據(jù)蛋白質(zhì)電泳的結(jié)果合并洗脫液，得到目的重組蛋白質(zhì)IXelute洗脫合并液；
[0015]7)中國對蝦DWD抗菌肽液體抑菌功能檢測:將步驟(6)的目的重組蛋白質(zhì)IXelute洗脫合并液利用截留孔徑為3500Da的透析袋對IXPBS緩沖液進(jìn)行24h透析，12h期間更換一次IXPBS緩沖液，透析液經(jīng)過12000rpm高速離心之后的上清液作為被檢測樣品進(jìn)行液體抑菌功能檢測，方法為:選擇大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為液體抑菌試驗(yàn)的菌種，將這些菌種事先進(jìn)行3mL-5mL的LB液體培養(yǎng)基過夜活化10h-12h，之后，分別取ImL菌液放入潔凈的1.5mL eppendof離心管中作為對照樣品，分別另取ImL菌液放入潔凈的1.5mL eppendof?離心管中作為液體抑菌管，之后要在液體抑菌管里面加入100 μ L的經(jīng)過濾膜過濾處理的DWD抗菌肽透析后上清液，在37°C、180rpm-200rpm條件下?lián)u菌培養(yǎng)5h-6h，之后利用分光光度計測定OD595的數(shù)值，最后以對照管的OD595作為對照，利用excel分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并且利用t-test檢驗(yàn)方法分析顯著性差異；
[0016]8)中國對蝦DWD抗菌肽蛋白酶抑制劑活性的檢測:將步驟(6)的目的重組蛋白質(zhì)IXelute洗脫合并液之后利用截留孔徑為3500Da的透析袋對IXPBS緩沖液進(jìn)行24h透析，12h期間更換一次IXPBS緩沖液，透析液經(jīng)過12000rpm高速離心之后的上清液作為被檢測樣品進(jìn)行蛋白酶抑制劑活性的檢測，具體方法為:首選在生長繁殖過程中能夠分泌蛋白酶的細(xì)菌——枯草芽孢桿菌(革蘭氏陽性細(xì)菌)和綠膿桿菌(革蘭氏陰性細(xì)菌)，在LB固體培養(yǎng)基上劃線37°C過夜培養(yǎng)(不加抗生素)，然后用經(jīng)過滅菌的牙簽挑去細(xì)菌的單克隆，在同一個固體脫脂奶粉培養(yǎng)基(配方為1%的脫脂奶粉與1%的瓊脂)上按照十字對角的方式分別接種四個單菌落，在上面覆蓋一個經(jīng)過滅菌的濾紙小圓片(直徑為8mm-10mm)，然后，預(yù)留一個小圓片作為空白對照，在其他3個小圓片上分別滴加經(jīng)過濾膜過濾除菌的DWD重組蛋白透析液、過濾除菌的I XPBS緩沖液、過濾除菌的BSA蛋白溶液(與DWD重組蛋白透析液的蛋白質(zhì)濃度相同)，28°C條件下過夜培養(yǎng)，觀察透明圈出現(xiàn)的情況。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明涉及的一種中國對蝦DWD抗菌肽分子的制備方法，通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)的DWD抗菌肽分子，能夠抑制細(xì)菌的生長，也可以抑制細(xì)菌生長過程分泌的蛋白酶的活性，可以成為抗生素的良好替代產(chǎn)品，因此，在食品抗菌、醫(yī)用抗生素替代方面具有較大的應(yīng)用潛力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]附圖1為重組中國對蝦DWD抗菌肽蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與親和純化的蛋白電泳結(jié)果圖；
[0019]附圖2為重組中國對蝦DWD抗菌肽蛋白的液體抑菌結(jié)果圖；
[0020]附圖3為重組中國對蝦DWD蛋白的枯草芽孢桿菌分泌性蛋白酶活性抑制結(jié)果圖；
[0021]附圖4為重組中國對蝦DWD蛋白的綠膿桿菌分泌性蛋白酶活性抑制結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
`[0022]實(shí)施例1:中國對蝦DWD抗菌肽的重組表達(dá)與液體抑菌活性檢測
[0023]圖1中，I為誘導(dǎo)前大腸桿菌總蛋白，2為誘導(dǎo)后大腸桿菌總蛋白，3為純化后的重組中國對蝦DWD抗菌肽蛋白，4為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量。
[0024]圖2中，I為大腸桿菌對照組，2為大腸桿菌抑菌試驗(yàn)組，3為綠膿桿菌對照組，4為綠膿桿菌抑菌試驗(yàn)組，5為金黃色葡萄球菌對照組，6為金黃色葡萄球菌抑菌試驗(yàn)組，7為白色念珠菌對照組，8為白色念珠菌抑菌試驗(yàn)組，*表示數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異。
[0025]I)中國對蝦DWD抗菌肽基因表達(dá)片段的克隆:取冷凍保存的中國對蝦3只_5只，無菌條件下解剖收集肝臟組織供100mg-150mg，利用動物基因組DNA小量提取試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)進(jìn)行中國對蝦肝臟基因組DNA的提取，具體方法參照試劑盒說明書。之后，以lyL-2yL中國對蝦肝臟基因組DNA作為模板，以前引物DWD-F:5'-tac tea gaa ttcacg aga ggcccg cta aag c_3 和后弓丨物 DWD-R:5 -tac tea ctc gag tct gcg ctt agaegg act g-3'作為擴(kuò)增中國對蝦DWD抗菌肽基因表達(dá)片段的一對引物，PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min-10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳處理，并且在凝膠成像儀紫外燈下將目的片段所在凝膠條帶切下回收，利用DNA膠回收試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)進(jìn)行目的片段的純化與回收，方法為:將切下的膠帶放入潔凈的1.5mL離心管中，加入400 μ L solution SN溶解液，在55°C -65°C條件下孵育5min-10min,間隔要求每間隔Imin晃動一次離心管，使膠帶充分溶解，之后將3S柱放回同一個收集管中，繼續(xù)加入500 μ L Wash Solution洗脫溶液，IOOOOrpm離心Imin,倒去收集管中的廢液，重復(fù)洗脫一次，倒去收集管中的廢液，將3S柱放回同一個收集管中，IOOOOrpm離心2min，將洗滌液充分去掉，將3S柱放入一個新的滅菌的RNase-Freel.5mL潔凈的離心管中，加入20 μ L-30 μ L無RNA酶的滅菌水，在超凈工作臺中室溫條件下放置2min，并且使離心管蓋子敞開，最后，IOOOOrpm條件下離心Imin,將目的產(chǎn)物收集在離心管中，獲得DWD抗菌肽基因表達(dá)片段溶解液；
[0026]2)中國對蝦具DWD抗菌肽基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建:取步驟(I)的DWD抗菌肽基因表達(dá)片段溶解液16 μ L，進(jìn)行內(nèi)切酶EcoR I和Xho I的雙酶切處理，20 μ L的體系中基因表達(dá)片段為16 μ L，內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer緩沖液為2 μ L，同時，取大腸桿菌pET_28a質(zhì)粒載體溶解液10 μ L進(jìn)行內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切處理，20 μ L的體系中質(zhì)粒載體溶解液為10 μ L，內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各I μ L，IOXH Buffer緩沖液為2 μ L，無菌水6 μ L，之后，取雙酶切處理的DWD抗菌肽基因表達(dá)片段6 μ L，雙酶切處理后的大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒載體溶解液2 μ L，再加T4DNA連接酶I μ L和IOX ligationbuffer緩沖液I μ L，在16°C金屬浴中進(jìn)行連接10h_12h，獲得連接產(chǎn)物；
[0027]3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5ci感受態(tài)細(xì)胞與陽性克隆子的篩選:將步驟(2)中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5a感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司產(chǎn)品)，主要是利用“熱激法”進(jìn)行轉(zhuǎn)化，卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為25μ g/μ L，固體LB培養(yǎng)基平板在37°C條件下過夜培養(yǎng)10h-12h，之后，挑取固體LB培養(yǎng)基平板表面的單個白色菌落，以前引物DffD-F:5 -tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3 和后引物 DWD-R:5 -tac teaetc RaR tct gcg ctt aga egg actg-3'作為菌落PCR反應(yīng)的一對引物,進(jìn)行陽性克隆子的篩選，PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴(kuò)增出目的條帶的陽性菌落進(jìn)行菌種保存的同時，進(jìn)行LB液體培養(yǎng) 基震蕩培養(yǎng)10h-12h，獲得陽性克隆菌株菌液；
[0028]4)質(zhì)粒提取:取步驟(3)的陽性克隆菌株菌液lmL，利用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)進(jìn)行質(zhì)粒提取，具體提取方法為:按照質(zhì)粒提取試劑盒的要求，取陽性克隆菌株菌液ImL,在6000rpm條件下低速離心3min-5min,去掉上清，收集細(xì)胞沉淀，并且室溫條件下立即加入試劑盒中的Solution I溶液300yL (此溶液需要存放在4°C環(huán)境)，馬上用渦旋震蕩器將細(xì)胞沉淀充分振蕩混勻，繼續(xù)加入試劑盒中的Solution II溶液300 μ L,要求輕輕混勻至液體清亮，室溫條件下靜置3min-5min,之后繼續(xù)緩慢加入試劑盒中的Solution III溶液300 μ L,要求立即混勻，放在冰浴中5min_10min后在室溫條件下，12000rpm高速離心5min-10min,并且將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5mL潔凈的離心管中，并且加入等體積的異丙醇，充分混勻之后再冰浴中放置5min-10min，室溫條件下10000rpm-12000rpm離心10min-15min后，去掉上清,用70%乙醇溶液洗漆沉淀2次-3次，室溫條件下10000rpm-12000rpm離心5min-10min,棄去上清,室溫條件下在超凈工作臺中干燥質(zhì)粒沉淀，最后，加入20 μ L-30 μ L滅菌水進(jìn)行溶解，獲得陽性重組質(zhì)粒；
[0029]5)轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞與陽性表達(dá)菌株的篩選:將步驟(4 )的陽性重組質(zhì)粒，利用“熱激法”轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3 )感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司產(chǎn)品)，那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為25 μ g/ μ L，將固體LB培養(yǎng)基平板在37°C條件下過夜培養(yǎng)10h-12h，之后，挑取固體LB培養(yǎng)基平板表面的單個白色菌落，以前引物DWD-F:5 -tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3 和后弓 I物 DWD-R:5 -tac tea ctc gagtct gcg ctt aga egg actg-3'作為菌落PCR反應(yīng)的一對引物,進(jìn)行陽性克隆子的篩選,PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)粒體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴(kuò)增出目的條帶的陽性菌落進(jìn)行菌種保存的同時，利用3mL-5mL液體LB培養(yǎng)基進(jìn)行液體震蕩培養(yǎng)，液體搖瓶培養(yǎng)的條件為:37°C，180rpm-200rpm,培養(yǎng)12h-14h，獲得陽性表達(dá)菌株菌液；
[0030]6)中國對蝦DWD抗菌肽的誘導(dǎo)表達(dá)與親和純化:將步驟(5)的陽性表達(dá)菌株菌液作為誘導(dǎo)表達(dá)的母液，從中取ImL菌液在無菌條件下轉(zhuǎn)接到一瓶IOOmL新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為50μ g/mL，在37°C、180rpm-200rpm條件下轉(zhuǎn)培養(yǎng)3h-4h之后，在無菌條件下加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG最終物質(zhì)的量濃度為0.3mmol/L,誘導(dǎo)表達(dá)的條件為在37°C、180rpm-200rpm條件下誘導(dǎo)3h_4h,之后，6000rpm低速離心收集菌體，用20mLlXPBS緩沖液重新懸起菌體沉淀，在冰浴中進(jìn)行菌體沉淀的超聲波破碎50min (功率200w,超聲破碎Is、間歇2s,全程50min),結(jié)束后12000rpm高速離心收集上清液，取3mL-5mL上清液利用His-tag凝膠親和純化柱(上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的親和純化，方法為:取出4°C條件下在20%酒精溶液中保存的His-tag凝膠親和柱，在室溫下將酒精流通至膠面之后，用3倍-5倍柱體積的去離子水充分洗柱，再用3倍-5倍柱體積的I XPBS緩沖液充分洗脫柱子，然后用5倍-10倍柱體積的試劑盒中的I X charge Buffer溶液流通洗柱,再用3倍-5倍柱體積的I Xbinding Buffer溶液流通洗柱，之后就是反復(fù)上樣，要求用3mL-5mL超聲波破碎后的高速離心上清液反復(fù)流通柱子3次-5次，目的是讓重組蛋白與柱子凝膠顆粒充分結(jié)合，之后，用5倍-10倍柱體積的I Xbinding Buffer溶液緩慢流通柱子,用3倍-5倍柱體積的I Xwash Buffer溶液緩慢流通柱子來除掉雜蛋白，之后，用6mL的I X elute洗脫溶液進(jìn)行樣品的洗脫，并且用6只1.5mL eppendof離心管收集蛋白洗脫液,每管收集ImL,純化結(jié)果用質(zhì)量體積比為15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，最后根據(jù)蛋白質(zhì)電泳的結(jié)果合并洗脫液，得到目的重組蛋白質(zhì)I X elute洗脫合并液；
[0031]7)中國對蝦DWD抗菌`肽液體抑菌功能檢測:將步驟(6)的目的重組蛋白質(zhì)IXelute洗脫合并液利用截留孔徑為3500Da的透析袋對IXPBS緩沖液進(jìn)行24h透析，12h期間更換一次IXPBS緩沖液，透析液經(jīng)過12000rpm高速離心之后的上清液作為被檢測樣品進(jìn)行液體抑菌功能檢測，方法為:選擇大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為液體抑菌試驗(yàn)的菌種，將這些菌種事先進(jìn)行3mL-5mL的LB液體培養(yǎng)基過夜活化10h-12h，之后，分別取ImL菌液放入潔凈的1.5mL eppendof離心管中作為對照樣品，分別另取ImL菌液放入潔凈的1.5mL eppendof?離心管中作為液體抑菌管，之后要在液體抑菌管里面加入100 μ L的經(jīng)過濾膜過濾處理的DWD抗菌肽透析后上清液，在37°C、180rpm-200rpm條件下?lián)u菌培養(yǎng)5h-6h，之后利用分光光度計測定OD595的數(shù)值，最后以對照管的OD595作為對照，利用excel分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并且利用t-test檢驗(yàn)方法分析顯著性差異，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示；
[0032]實(shí)施例2:中國對蝦DWD抗菌肽的重組表達(dá)與蛋白酶抑制劑活性檢測
[0033]圖3中，I為濾紙片上不加任何物質(zhì)的對照，2為加15 μ LlXPBS的對照，3為加15 μ L BSA蛋白透析液對照，4為加15 μ L重組DWD蛋白透析液。
[0034]圖4中，I為濾紙片上不加任何物質(zhì)的對照，2為加15 μ LlXPBS的對照，3為加15 μ L BSA蛋白透析液對照，4為加15 μ L重組DWD蛋白透析液。
[0035]I)中國對蝦DWD抗菌肽基因表達(dá)片段的克隆:取冷凍保存的中國對蝦3只-5只，無菌條件下解剖收集肝臟組織供100mg-150mg，利用動物基因組DNA小量提取試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)進(jìn)行中國對蝦肝臟基因組DNA的提取，具體方法參照試劑盒說明書。之后，以lyL-2yL中國對蝦肝臟基因組DNA作為模板，以前引物DWD-F:5'-tac tea gaa ttcacg aga ggcccg cta aag c_3 和后弓丨物 DWD-R:5 -tac tea ctc gag tct gcg ctt agaegg act g-3'作為擴(kuò)增中國對蝦DWD抗菌肽基因表達(dá)片段的一對引物，PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min-10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳處理，并且在凝膠成像儀紫外燈下將目的片段所在凝膠條帶切下回收，利用DNA膠回收試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)進(jìn)行目的片段的純化與回收，方法為:將切下的膠帶放入潔凈的1.5mL離心管中，加入400 μ L solution SN溶解液，在55°C -65°C條件下孵育5min-10min,間隔要求每間隔Imin晃動一次離心 管，使膠帶充分溶解，之后將3S柱放回同一個收集管中，繼續(xù)加入500 μ L Wash Solution洗脫溶液，IOOOOrpm離心Imin,倒去收集管中的廢液，重復(fù)洗脫一次，倒去收集管中的廢液，將3S柱放回同一個收集管中，IOOOOrpm離心2min，將洗滌液充分去掉，將3S柱放入一個新的滅菌的RNase-Freel.5mL潔凈的離心管中，加入20 μ L-30 μ L無RNA酶的滅菌水，在超凈工作臺中室溫條件下放置2min，并且使離心管蓋子敞開，最后，IOOOOrpm條件下離心Imin,將目的產(chǎn)物收集在離心管中，獲得DWD抗菌肽基因表達(dá)片段溶解液；
[0036]2)中國對蝦具DWD抗菌肽基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建:取步驟(I)的DWD抗菌肽基因表達(dá)片段溶解液16 μ L，進(jìn)行內(nèi)切酶EcoR I和Xho I的雙酶切處理，20 μ L的體系中基因表達(dá)片段為16 μ L，內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer緩沖液為2 μ L，同時，取大腸桿菌pET_28a質(zhì)粒載體溶解液10 μ L進(jìn)行內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切處理，20 μ L的體系中質(zhì)粒載體溶解液為10 μ L，內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer緩沖液為2 μ L，無菌水6 μ L，之后，取雙酶切處理的DWD抗菌肽基因表達(dá)片段6 μ L，雙酶切處理后的大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒載體溶解液2 μ L，再加T4DNA連接酶I μ L和IOX ligationbuffer緩沖液I μ L，在16°C金屬浴中進(jìn)行過夜連接10h_12h，獲得連接產(chǎn)物；
[0037]3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5ci感受態(tài)細(xì)胞與陽性克隆子的篩選:將步驟(2)中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5a感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司產(chǎn)品)，主要是利用“熱激法”進(jìn)行轉(zhuǎn)化，卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為25μ g/μ L，固體LB培養(yǎng)基平板在37°C條件下過夜培養(yǎng)10h-12h，之后，挑取固體LB培養(yǎng)基平板表面的單個白色菌落，以前引物DffD-F:5 -tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3 和后引物 DWD-R:5 -tac teaetc RaR tct gcg ctt aga egg actg-3'作為菌落PCR反應(yīng)的一對引物,進(jìn)行陽性克隆子的篩選，PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴(kuò)增出目的條帶的陽性菌落進(jìn)行菌種保存的同時，進(jìn)行LB液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)10h-12h，獲得陽性克隆菌株菌液；[0038]4)質(zhì)粒提取:取步驟(3)的陽性克隆菌株菌液lmL，利用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)進(jìn)行質(zhì)粒提取，具體提取方法為:按照質(zhì)粒提取試劑盒的要求，取陽性克隆菌株菌液ImL,在6000rpm條件下低速離心3min-5min,去掉上清，收集細(xì)胞沉淀，并且室溫條件下立即加入試劑盒中的Solution I溶液300 μ L (此溶液需要存放在4°C環(huán)境)，馬上用渦旋震蕩器將細(xì)胞沉淀充分振蕩混勻，繼續(xù)加入試劑盒中的Solution II溶液300 μ L,要求輕輕混勻至液體清亮，室溫條件下靜置3min-5min,之后繼續(xù)緩慢加入試劑盒中的Solution III溶液300 μ L,要求立即混勻，放在冰浴中5min_10min后在室溫條件下，12000rpm高速離心5min-10min,并且將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5mL潔凈的離心管中，并且加入等體積的異丙醇，充分混勻之后再冰浴中放置5min-10min，室溫條件下10000rpm-12000rpm離心10min-15min后，去掉上清,用70%乙醇溶液洗漆沉淀2次-3次，室溫條件下10000rpm-12000rpm離心5min-10min,棄去上清,室溫條件下在超凈工作臺中干燥質(zhì)粒沉淀，最后，加入20 μ L-30 μ L滅菌水進(jìn)行溶解，獲得陽性重組質(zhì)粒；
[0039]5)轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞與陽性表達(dá)菌株的篩選:將步驟(4 )的陽性重組質(zhì)粒，利用“熱激法”轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3 )感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司產(chǎn)品)，那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為25 μ g/ μ L，將固體LB培養(yǎng)基平板在37°C條件下過夜培養(yǎng)10h-12h，之后，挑取固體LB培養(yǎng)基平板表面的單個白色菌落，以前引物DWD-F:
5-tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3 和后引物DWD-R:5 -tac tea ctc gagtct gcg ctt aga egg actg-3'作為菌落PCR反應(yīng)的一對引物,進(jìn)行陽性克隆子的篩選,PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)粒體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴(kuò)增出目的條帶的陽性菌落進(jìn)行菌種保存的同時，利用3mL-5mL液體LB培養(yǎng)基進(jìn)行液體震蕩培養(yǎng)，液體搖瓶培養(yǎng)的條件為:37°C，180rpm-200rpm,培養(yǎng)12h-14h，獲得陽性表達(dá)菌株菌液；
[0040]6)中國對蝦DWD抗菌肽的誘導(dǎo)表達(dá)與親和純化:將步驟(5)的陽性表達(dá)菌株菌液作為誘導(dǎo)表達(dá)的母液，從中取ImL菌液在無菌條件下轉(zhuǎn)接到一瓶IOOmL新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為50μ g/mL，在37°C、180rpm-200rpm條件下轉(zhuǎn)培養(yǎng)3h-4h之后，在無菌條件下加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG最終物質(zhì)的量濃度為0.3mmol/L,誘導(dǎo)表達(dá)的條件為在37°C、180rpm-200rpm條件下誘導(dǎo)3h_4h,之后，6000rpm低速離心收集菌體，用20mLlXPBS緩沖液重新懸起菌體沉淀，在冰浴中進(jìn)行菌體沉淀的超聲波破碎50min (功率200w,超聲破碎Is、間歇2s,全程50min),結(jié)束后12000rpm高速離心收集上清液，取3mL-5mL上清液利用His-tag凝膠親和純化柱(上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的親和純化，方法為:取出4°C條件下在20%酒精溶液中保存的His-tag凝膠親和柱，在室溫下將酒精流通至膠面之后，用3倍-5倍柱體積的去離子水充分洗柱，再用3倍-5倍柱體積的I XPBS緩沖液充分洗脫柱子，然后用5倍-10倍柱體積的試劑盒中的I X charge Buffer溶液流通洗柱,再用3倍-5倍柱體積的I Xbinding Buffer溶液流通洗柱，之后就是反復(fù)上樣，要求用3mL-5mL超聲波破碎后的高速離心上清液反復(fù)流通柱子3次-5次，目的是讓重組蛋白與柱子凝膠顆粒充分結(jié)合，之后，用5倍-10倍柱體積的I Xbinding Buffer溶液緩慢流通柱子,用3倍-5倍柱體積的I Xwash Buffer溶液緩慢流通柱子來除掉雜蛋白，之后，用6mL的IXelute洗脫溶液進(jìn)行樣品的洗脫，并且用6只1.5mL eppendof離心管收集蛋白洗脫液,每管收集ImL,純化結(jié)果用質(zhì)量體積比為15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，最后根據(jù)蛋白質(zhì)電泳的結(jié)果合并洗脫液，得到目的重組蛋白質(zhì)I X elute洗脫合并液；
[0041]7)中國對蝦DWD抗菌肽蛋白酶抑制劑活性的檢測:將步驟(6)的目的重組蛋白質(zhì)I X elute洗脫合并液利用截留孔徑為3500Da的透析袋對I XPBS緩沖液進(jìn)行24h透析，12h期間更換一次IXPBS緩沖液，透析液經(jīng)過12000rpm高速離心之后的上清液作為被檢測樣品進(jìn)行蛋白酶抑制劑活性的檢測，具體方法為:首選選擇在生長繁殖過程中能夠分泌蛋白酶的細(xì)菌——枯草芽孢桿菌(革蘭氏陽性細(xì)菌)和綠膿桿菌(革蘭氏陰性細(xì)菌)，在LB固體培養(yǎng)基上劃線37°C過夜培養(yǎng)(不加抗生素)，然后用經(jīng)過滅菌的牙簽挑去細(xì)菌的單克隆，在同一個固體脫脂奶粉培養(yǎng)基(配方為1%的脫脂奶粉與1%的瓊脂)上按照十字對角的方式分別接種四個單菌落，在上面覆蓋一個經(jīng)過滅菌的濾紙小圓片(直徑為8mm-10mm)，然后，預(yù)留一個小圓片作為空白對照，在其他3個小圓片上分別滴加經(jīng)過濾膜過濾除菌的DWD重組蛋白透析液、過濾除菌的I XPBS緩沖液、過濾除菌的BSA蛋白溶液(與DWD重組蛋白透析液的蛋白質(zhì)濃度相同)，28°C條件下過夜培養(yǎng)，之后，觀察透明圈出現(xiàn)的情況，試驗(yàn)結(jié)果如圖3和圖4所示?！?br> 【權(quán)利要求】
1.一種中國對蝦DWD抗菌肽分子的制備方法，其特征在于:包含以下步驟: .1)中國對蝦DWD抗菌肽基因表達(dá)片段的克隆:取中國對蝦3只-5只，無菌條件下解剖收集肝臟組織供100mg-150mg，利用動物基因組DNA小量提取試劑盒進(jìn)行中國對蝦肝臟基因組DNA的提取，之后，以I μ L-2 μ L中國對蝦肝臟基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)來擴(kuò)增中國對蝦DWD抗菌肽基因表達(dá)片段，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳處理，并且在凝膠成像儀紫外燈下將目的片段所在凝膠條帶切下回收，利用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段的純化與回收，獲得中國對蝦DWD抗菌肽基因表達(dá)片段溶解液； . 2)中國對蝦DWD抗菌肽基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建:取步驟(I)的中國對蝦DWD抗菌肽基因表達(dá)片段溶解液16 μ L，進(jìn)行內(nèi)切酶EcoR I和Xho I的雙酶切處理，20 μ L的體系中基因表達(dá)片段為16 μ L，內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer緩沖液為2 μ L，同時，取大腸桿菌pET_28a質(zhì)粒載體溶解液10 μ L進(jìn)行內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切處理，.20 μ L的體系中質(zhì)粒載體溶解液為10 μ L，內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer緩沖液為2 μ L，無菌水6 μ L，之后，取雙酶切處理的DWD抗菌肽基因表達(dá)片段6 μ L，雙酶切處理后的大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒載體溶解液2 μ L，再加T4DNA連接酶I μ L和IOX ligationbuffer緩沖液I μ L，在16°C金屬浴中進(jìn)行連接10h_12h，獲得連接產(chǎn)物； . 3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5ci感受態(tài)細(xì)胞與陽性克隆子的篩選:將步驟(2)中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司產(chǎn)品)，主要是利用“熱激法”進(jìn)行轉(zhuǎn)化，卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為25 μ g/ μ L，固體LB培養(yǎng)基平板在37°C條件下培養(yǎng)10h-12h，之后，挑去固體LB培養(yǎng)基平板表面的單個白色菌落，以前引物DWD-F:5'-tactea gaattc acg aga ggc ccg cta aag c_3 和后引物 DWD-R:5 -tac tea ctc gag tctgcg ctt aga egg act g_3'作為菌落PCR反應(yīng)的一對引物,進(jìn)行陽性克隆子的篩選,PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，.72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴(kuò)增出目的條帶的陽性菌落進(jìn)行菌種保存的同時，進(jìn)行LB液體培養(yǎng)基震蕩 培養(yǎng)10h-12h，獲得陽性克隆菌株菌液； 4)質(zhì)粒提取:取步驟(3)中的陽性菌株菌液lmL，利用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，獲得陽性重組質(zhì)粒； 5)轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞與陽性表達(dá)菌株的篩選:將步驟(4)的陽性重組質(zhì)粒，利用“熱激法”轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為25μ g/μ L，固體LB培養(yǎng)基要求在37°C條件下過夜培養(yǎng)10h_12h，之后，挑去固體LB培養(yǎng)基平板表面的單個白色菌落，以前引物DWD-F:5'-tac tea gaa ttcacg agaggc ccg cta aag c_3 和后弓丨物DWD-R:5 -tac tea ctc gag tct gcg ctt aga eggact g-3'作為菌落PCR反應(yīng)的一對引物，進(jìn)行陽性克隆子的篩選，PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min-10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴(kuò)增出目的條帶的陽性菌落進(jìn)行菌種保存的同時，利用3mL-5mL液體LB培養(yǎng)基進(jìn)行液體震蕩培養(yǎng)，液體搖瓶培養(yǎng)的條件為:37°C，180rpm-200rpm，培養(yǎng)12h_14h，獲得陽性表達(dá)菌株菌液； 6)中國對蝦DWD抗菌肽的誘導(dǎo)表達(dá)與親和純化:將步驟(5)的陽性表達(dá)菌株菌液作為誘導(dǎo)表達(dá)的母液，從其中取ImL菌液在無菌條件下轉(zhuǎn)接到一瓶IOOmL新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，要求卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為50 μ g/mL,在37°C、180rpm-200rpm條件下轉(zhuǎn)培養(yǎng)3h-4h之后，在無菌條件下加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG最終物質(zhì)的量濃度為0.1mmol/L-0.5mmol/L,誘導(dǎo)表達(dá)的條件為在37°C、180rpm-200rpm條件下誘導(dǎo)3h_4h,之后,6000rpm低速離心收集菌體，用20mLlXPBS緩沖液重新懸起菌體沉淀，在冰浴中進(jìn)行菌體沉淀的超聲波破碎40min-60min,結(jié)束后10000rpm-12000rpm高速離心收集上清液,取5mL上清液利用His-tag凝膠親和純化柱進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的親和純化，最后根據(jù)蛋白質(zhì)電泳的結(jié)果合并洗脫液，得到目的重組蛋白質(zhì)IXelute洗脫合并液； 7)中國對蝦DWD抗菌肽液體抑菌功能檢測:將步驟(6)的目的重組蛋白質(zhì)IXelute洗脫合并液利用截留孔徑為3500Da的透析袋對I XPBS緩沖液進(jìn)行24h透析，12h期間更換一次I XPBS緩沖液，透析液經(jīng)過10000rpm-12000rpm高速離心之后的上清液作為被檢測樣品進(jìn)行液體抑菌功能檢測； 8)中國對蝦DWD抗菌肽蛋白酶抑制劑活性的檢測:將步驟(6)的目的重組蛋白質(zhì)I X elute洗脫合并液利用截留孔徑為3500Da的透析袋對I XPBS緩沖液進(jìn)行24h透析，12h期間更換一次I XPBS緩沖液，透析液經(jīng)過10000rpm-12000rpm高速離心之后的上清液作為被檢測樣品進(jìn)行蛋白酶抑制劑活性的檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中國對蝦DWD抗菌肽分子的制備方法，其特征在于:以前引物 DWD-F:5'-tac tea gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3' 和后引物 DWD-R:5 -tac tea ctcgag tct gcg ctt aga egg act g-3作為擴(kuò)增中國對奸DWD抗菌妝基因表達(dá)片段的一對引物，PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 45s，最后 72°C后延伸 5min_10min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中國對蝦DWD抗菌肽分子的制備方法，其特征在于:選擇大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為液體抑菌試驗(yàn)的菌種，將這些菌種事先進(jìn)行3mL-5mL的LB液體培養(yǎng)基過夜活化10h_12h，之后，分別取ImL菌液放入潔凈的1.5mL eppendof離心管中作為對照樣品，分別另取ImL菌液放入潔凈的1.5mL eppendof離心管中作為液體抑菌管，之后要在液體抑菌管里面加入100 μ L的經(jīng)過濾膜過濾處理的DWD抗菌肽透析后上清液，在37°C、180rpm-200rpm條件下?lián)u菌培養(yǎng)5h_6h，之后利用分光光度計測定OD595的數(shù)值，最后以對照管的OD595作為對照，利用excel分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并且利用t-test檢驗(yàn)方法分析顯著性差異。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中國對蝦DWD抗菌肽分子的制備方法，其特征在于:首選在生長繁殖過程中能夠分泌蛋白酶的細(xì)菌——枯草芽孢桿菌(革蘭氏陽性細(xì)菌)和綠膿桿菌(革蘭氏陰性細(xì)菌)，在LB固體培養(yǎng)基上劃線37°C過夜培養(yǎng)(不加抗生素)，然后用經(jīng)過滅菌的牙簽挑去細(xì)菌的單克隆，在同一個固體脫脂奶粉培養(yǎng)基(配方為1%的脫脂奶粉與1%的瓊脂)上按照十字對角的方式分別接種四個單菌落，在上面覆蓋一個經(jīng)過滅菌的濾紙小圓片(直徑為8mm-10mm)，然后，預(yù)留一個小圓片作為空白對照，在其他3個小圓片上分別滴加經(jīng)過濾膜過濾除菌的DWD重組蛋白透析液、過濾除菌的IXPBS緩沖液、過濾除菌的BSA蛋白溶液(與DffD重組蛋白透析液的蛋白質(zhì)濃度相同)，28 °C條件下過夜培養(yǎng)，觀察透明圈出現(xiàn)的情況。
【文檔編號】C12Q1/02GK103451188SQ201310403797
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】杜志強(qiáng), 王金星, 趙小凡, 張雪峰, 王建英 申請人:內(nèi)蒙古科技大學(xué)