一種用于檢測(cè)基因突變的長(zhǎng)度依賴(lài)探針制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)基因突變的長(zhǎng)度依賴(lài)探針的制備方法，包括以下步驟：1）選擇與待測(cè)目標(biāo)序列無(wú)關(guān)的載體作為模板，并根據(jù)目標(biāo)核苷酸序列和無(wú)關(guān)序列設(shè)計(jì)長(zhǎng)度一代探針對(duì)的擴(kuò)增引物序列；2）人工合成引物；3）PCR擴(kuò)增；4）PCR產(chǎn)物純化回收；5）使用T7外切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化；6）回收ssDNA。本發(fā)明所述MLPA探針制備方法成本低廉，只需要PCR儀即可完成擴(kuò)增、酶切等全部操作，利用T7外切酶消化排除了沒(méi)有消化完全的dsDNA和核苷酸，提高了探針制備效率，提高M(jìn)LPA實(shí)驗(yàn)時(shí)的雜交效率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種用于檢測(cè)基因突變的長(zhǎng)度依賴(lài)探針制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及寡核苷酸探針制備，具體為可用于檢測(cè)基因突變，包括單核苷酸多態(tài) 性（SNP)、拷貝數(shù)變異（CNV)和染色體數(shù)目異常的長(zhǎng)度依賴(lài)探針的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 檢測(cè)基因突變是診斷遺傳疾病的主要手段以及其他代謝、神經(jīng)類(lèi)疾病的重要輔助 診斷手段?；蛲蛔儼ㄈ鐔魏塑账岫鄳B(tài)性（SNPs)、拷貝數(shù)變異（CNVs)、基因片段重復(fù)和 缺失（Ins/Del)、染色體數(shù)目異常、基因甲基化等。其中單核苷酸多態(tài)性（SNPs)、拷貝數(shù)變 異（CNVs)和染色體數(shù)目異常是目前檢測(cè)基因突變類(lèi)型中的主要類(lèi)型。
[0003] 目前檢測(cè)基因突變的技術(shù)手段以PCR技術(shù)以及PCR延生技術(shù)為主，PCR技術(shù)具有 檢測(cè)周期短、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率高、檢測(cè)結(jié)果可靠。然而，PCR技術(shù)只能實(shí)現(xiàn)一 個(gè)反應(yīng)管分析一個(gè)基因位點(diǎn)，效率低，同時(shí)PCR技術(shù)對(duì)樣本DNA質(zhì)量的要求較高，對(duì)于低濃 度低質(zhì)量樣本DNA常會(huì)出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性的結(jié)果，對(duì)于一些特殊樣本DNA (CG含量高、位 點(diǎn)部分甲基化)PCR技術(shù)也常顯得能力郵箱。當(dāng)前要對(duì)如眾多不同的遺傳、神經(jīng)、心血管、腦 血管疾病進(jìn)行分子生物學(xué)專(zhuān)業(yè)的檢測(cè)，前期樣本分揀繁瑣、檢測(cè)工作量大。因此，基因突變 檢測(cè)急需一種高通量、快捷方便的檢測(cè)方法。
[0004] 常見(jiàn)的高通量檢測(cè)基因突變的技術(shù)有基因芯片、多通道毛細(xì)管電泳、變性高效液 相色譜分析、二代測(cè)序等。這些方法雖然能進(jìn)行實(shí)現(xiàn)"單樣品對(duì)應(yīng)多項(xiàng)目"的檢測(cè)，然而對(duì) "多樣品對(duì)應(yīng)多項(xiàng)目"方式的檢測(cè)能力有限，其局限性主要在對(duì)檢測(cè)樣本DNA的要求高、檢測(cè) 結(jié)果的正確度取決于檢測(cè)深度、成本高。為一次性獲得多目標(biāo)DNA產(chǎn)物片段，多采用較為廉 價(jià)的多重PCR技術(shù)，但目標(biāo)DNA造成引物序列間相互干擾和引物聚合體使該技術(shù)檢測(cè)基因 數(shù)目收到了很大的限制，一般不會(huì)超過(guò)10個(gè)。
[0005] 2002年荷蘭的Dr. Schouten JP創(chuàng)造了一種新的基因突變檢測(cè)技術(shù)用于醫(yī)學(xué) 檢測(cè)，該技術(shù)即多重連接依賴(lài)探針擴(kuò)增技術(shù)（Multiplex Ligation dependent Primers Amplification，MLPA)其原理是針對(duì)不同的目標(biāo)基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)（圖1)，這 種長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)兩序列的一端具基因特異性，它們與各自目標(biāo)基因區(qū)域復(fù)性后僅留一缺 口，于此同時(shí)所有長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)中與目的基因不雜交的一端都接有相同的堿基序列（既 通用引物序列，GS)用于PCR，這樣當(dāng)長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)與目標(biāo)區(qū)復(fù)性并在連接酶的作用下相 連而本身成為PCR的模板DNA，并由一對(duì)通用引物擴(kuò)增而達(dá)到信號(hào)放大的效果，由于針對(duì)不 同的目標(biāo)基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)的探針對(duì)長(zhǎng)度各不相同，通過(guò)分離PCR產(chǎn)物大小(無(wú)須通過(guò)測(cè)序手 段，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或毛細(xì)管電泳即可達(dá)到分離的效果）便可知道是否有目標(biāo)基因的 存在，可以對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定性分析，也能進(jìn)行相對(duì)定量分析。
[0006] MLPA技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便(不需昂貴和復(fù)雜的操作設(shè)備)、特異性高(探針復(fù)性及 連接酶的特異性識(shí)別）及高通量(單管可測(cè)多達(dá)45個(gè)基因位點(diǎn)）、需要DNA樣本量低(僅需 20ng/y 1 DNA)、應(yīng)用領(lǐng)域廣(可應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性（SNP)、拷貝數(shù)變異（CNV)、基因片段 缺失和重復(fù)（Int/Del)、染色體數(shù)目異常、基因甲基化分析以及mRNA的分析）的特點(diǎn)。這幾 年來(lái)，已超過(guò)有上百篇的研究報(bào)告中應(yīng)用了此技術(shù)。
[0007] 在MLPA技術(shù)中涉及到針對(duì)目標(biāo)基因的長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)，其中長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)的 設(shè)計(jì)是難點(diǎn)，荷蘭科學(xué)家創(chuàng)造性地利用了 M13單鏈?zhǔn)删w的特性，巧妙地在插入衍生的序 列兩端設(shè)計(jì)了限制性?xún)?nèi)切酶（RE)識(shí)別位點(diǎn)，以便采用雙酶切獲得長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)，克服了 目前寡核苷酸化學(xué)合成一般難以達(dá)到50mer以上的困難。
[0008] 其原理就是將各Ml3載體的大小不同的無(wú)關(guān)序列或無(wú)關(guān)的模板（Unrelated Template，UT)引入單鏈探針從而獲得長(zhǎng)度不同的單鏈探針。該單鏈探針生物方法非常繁 瑣，不僅需要基因克隆、病毒轉(zhuǎn)染、質(zhì)粒提取等過(guò)程，還必須購(gòu)買(mǎi)一套昂貴的M13載體，此 夕卜，操作M13病毒極易發(fā)生污染。同時(shí)為了壟斷MLPA應(yīng)用市場(chǎng)，現(xiàn)在荷蘭公司MRC-Holland 已經(jīng)不再出售M13載體，因此，長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)的制備方法急待解決。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是針對(duì)上述MLPA長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)生物制備方法繁瑣的問(wèn)題，提供 一種操作方法簡(jiǎn)便、污染可控、制備效率高的MLPA長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)的制備方法。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供一種用于針對(duì)心血管疾病相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因的MLPA檢測(cè)的 長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)以及心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)基因的MLPA檢測(cè)方法。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案（圖2): 1.針對(duì)待測(cè)靶位點(diǎn)或片段設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，一對(duì)為通用引物，用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增檢 測(cè)，分別為GSF和GSR，該對(duì)引物序列與待測(cè)靶位點(diǎn)或片段以及長(zhǎng)探針中的天然序列（NS)無(wú) 關(guān)；針對(duì)待測(cè)靶位點(diǎn)或片段的檢測(cè)引物，分別為T(mén)SF和TSR。
[0012] 2.制備長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)中的長(zhǎng)探針： 1) 長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)中的長(zhǎng)探針有三個(gè)部分組成，分別為GSR、NS和TSR ; 2) GSR的5'端用報(bào)告基團(tuán)進(jìn)行修飾； 3) 確定一段與待測(cè)靶位點(diǎn)或片段及通用引物無(wú)關(guān)的天然序列（NS); 4) 針對(duì)長(zhǎng)探針的設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物，分別為GSR-Ν'和TSR-Ν'，其中GSR-Ν'是由GSR 的序列與NS序列3'端的18bp左右的序列組成，TSR-Ν'由目的長(zhǎng)探針5'端序列的反向互 補(bǔ)序列與NS序列5'端的18bp左右反向互補(bǔ)的序列組成，并且TSR-Ν'的5'端要帶上磷酸 化修飾； 5) 用GSR-Ν'和TSR-Ν'以所述的長(zhǎng)探針的核酸序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得互補(bǔ)鏈 5'端磷酸化修飾的雙鏈核苷酸序列； 6) 純化回收PCR產(chǎn)物，除去引物二聚體和擴(kuò)增長(zhǎng)度不合格的PCR產(chǎn)物； 7) 采用核酸T7核酸外切酶對(duì)以上純化后的PCR產(chǎn)物的dsDNA進(jìn)行消化，去除5'端磷 酸化標(biāo)記的那條ssDNA ; 8) 采用ssDNA純化回收試劑盒對(duì)消化后產(chǎn)物進(jìn)行回收，獲得長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)中的長(zhǎng) 探針。
[0013] 9)根據(jù)檢測(cè)設(shè)備的需要，對(duì)長(zhǎng)探針的3'端進(jìn)行報(bào)告基團(tuán)的修飾。
[0014] 10)在通過(guò)紫外分光光度計(jì)對(duì)獲得的長(zhǎng)探針0D260與0D280的比值進(jìn)行檢測(cè)，其 比值在1. 6~2. 0之間，則分裝備用。如果比值不在這個(gè)范圍內(nèi)，則對(duì)獲得的長(zhǎng)探針再進(jìn)行純 化。
[0015] 3.制備長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)中的短探針 1) 長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)中的短探針有兩個(gè)部分組成，分別為GSF和TSF ; 2) 針對(duì)短探針的涉及一對(duì)擴(kuò)增引物，分別為GSF-N'和TSF-N'，其中GSF-N'是由GSF 的序列5'端的15bp左右的序列組成，TSF-Ν'由TSF序列3'端的反向互補(bǔ)序列中的15bp 左右反向互補(bǔ)的序列組成，并且在其GSF-Ν'的5'端要帶上磷酸化修飾； 3) 用GSF-Ν'和TSF-Ν'以所述的短探針的核酸序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得互補(bǔ)鏈 5'端磷酸化修飾的雙鏈核苷酸序列； 4) 純化回收PCR產(chǎn)物，除去引物二聚體和不合格的PCR產(chǎn)物； 5) 采用核酸T7核酸外切酶對(duì)以上純化后的PCR產(chǎn)物的dsDNA進(jìn)行消化，去除5'端磷 酸化標(biāo)記的那條ssDNA ; 6) 采用ssDNA純化回收試劑盒對(duì)消化后產(chǎn)物進(jìn)行回收，獲得長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)中的短 探針。
[0016] 7)在通過(guò)紫外分光光度計(jì)對(duì)獲得的短探針0D260與0D280的比值進(jìn)行檢測(cè)，其比 值在1.6~2.0之間，則分裝備用。如果比值不在這個(gè)范圍內(nèi)，則對(duì)獲得的短探針再進(jìn)行純 化。
[0017] 所述PCR擴(kuò)增得到的5'端磷酸化修飾的dsDNA序列需先經(jīng)過(guò)純化再進(jìn)行T7核酸 外切酶。
[0018] 所述長(zhǎng)探針的3'端進(jìn)行報(bào)告基團(tuán)的修飾中報(bào)告基團(tuán)選擇，根據(jù)檢測(cè)手段來(lái)確定使 用何種報(bào)告基團(tuán)，報(bào)告基團(tuán)可以是熒光基團(tuán)、可以選擇對(duì)特定染料敏感的蛋白、也可以選擇 對(duì)特定抗體蛋白。
[0019] 所述的T7核酸外切酶消化過(guò)程中，lug dsDNA用1個(gè)單位T7核酸外切酶消化。
[0020] 本發(fā)明所述MLPA探針制備方法與采用M13噬菌體制備MLPA相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1)PCR擴(kuò)增引物簡(jiǎn)單，只需考慮引物Tm值和長(zhǎng)度等PCR引物設(shè)計(jì)的常規(guī)性問(wèn)題，通過(guò) 結(jié)合目標(biāo)核苷酸序列，針對(duì)模版設(shè)計(jì)一對(duì)引物即可。
[0021] 2)利用簡(jiǎn)單的PCR技術(shù)和T7核酸外切酶消化即可獲得長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)，無(wú)需噬菌 體培養(yǎng)，可在一天內(nèi)完成探針制備工作，大大降低了 MLPA技術(shù)門(mén)檻。
[0022] 3)無(wú)需進(jìn)行克隆制備，無(wú)需特異性?xún)?nèi)切酶酶切，操作簡(jiǎn)單。
[0023] 4)探針?biāo)璧奶畛湫蛄衼?lái)源多樣且方便，可使不同探針填充序列保持一致，也可 根據(jù)需要選擇不同模版擴(kuò)增所需填充序列，降低雜交時(shí)的非特異性雜交，提高檢測(cè)成功率。
[0024]

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1 MLPA技術(shù)的雜交原理示意圖； 圖2本發(fā)明的探針制備流程圖； 圖3本發(fā)明實(shí)施例1中瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果圖； 圖4本發(fā)明實(shí)施例2中毛細(xì)電泳分析結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 結(jié)合附圖和具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的制備方法，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定，具體為 用多重連接擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)哺乳動(dòng)物心血管疾病相關(guān)基因的長(zhǎng)度依賴(lài)探針的制備及其檢測(cè)。
[0027] 實(shí)施例1檢測(cè)哺乳動(dòng)物心血管疾病相關(guān)基因ACE基因的長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)的制備 及其檢測(cè)，包括以下步驟： 1.針對(duì)待測(cè)ACE基因設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，一對(duì)為通用引物，用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增檢測(cè)，分別 為GSF和GSR，該對(duì)引物序列與待測(cè)靶位點(diǎn)或片段以及長(zhǎng)探針中的天然序列（NS)無(wú)關(guān)；針對(duì) 待測(cè)靶位點(diǎn)或片段的檢測(cè)引物，分別為T(mén)SF和TSR。
[0028] 2.制備長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)中的長(zhǎng)探針： 1) 確定一段與待測(cè)ACE基因及通用引物無(wú)關(guān)的天然序列（NS)，根據(jù)NS和待測(cè)ACE基 因序列雞舍以?xún)?nèi)； 2) 針對(duì)長(zhǎng)探針的涉及一對(duì)擴(kuò)增引物，分別為GSR-Ν'和TSR-N'，其中GSR-Ν'是由GSR 的序列與NS序列3'端的18bp左右的序列組成，TSR-N'由目的長(zhǎng)探針5'端序列的反向互 補(bǔ)序列與NS序列5'端的18bp左右反向互補(bǔ)的序列組成，并且TSR-N'的5'端要帶上磷 酸化修飾； 3) PCR擴(kuò)增，獲得互補(bǔ)鏈5'端磷酸化修飾的雙鏈核苷酸序列； 4) 純化回收PCR產(chǎn)物，除去引物二聚體和不合格的PCR產(chǎn)物； 5) 采用T7核酸外切酶對(duì)以上純化后的PCR產(chǎn)物的雙鏈核苷酸序列進(jìn)行消化，去除5' 端磷酸化標(biāo)記的那條ssDNA ; 6) 采用ssDNA純化回收試劑盒對(duì)消化后產(chǎn)物進(jìn)行回收，獲得長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)中的長(zhǎng) 探針； 7) 對(duì)長(zhǎng)探針的3'端進(jìn)行報(bào)告基團(tuán)的修飾； 8) 對(duì)獲得的長(zhǎng)探針在通過(guò)紫外分光光度計(jì)對(duì)合成的長(zhǎng)探針的質(zhì)量進(jìn)行確定。
[0029] 3.制備長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)中的短探針 1) 長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)中的短探針有兩個(gè)部分組成，分別為GSF和TSF ; 2) 針對(duì)短探針的涉及一對(duì)擴(kuò)增引物，分別為GSF-Ν'和TSF-N'，其中GSF-Ν'是由GSF 的序列5'端的18bp左右的序列組成，TSF-Ν'由TSF序列3'端的反向互補(bǔ)序列中的18bp 左右反向互補(bǔ)的序列組成，并且其5'端要帶上磷酸化修飾； 3) 用GSF-Ν'和TSF-Ν'以所述的長(zhǎng)探針的核酸序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得互補(bǔ)鏈 5'端磷酸化修飾的雙鏈核苷酸序列； 4) 純化回收PCR產(chǎn)物，除去引物二聚體和不合格的PCR產(chǎn)物； 5) 采用T7核酸外切酶對(duì)以上純化后的PCR產(chǎn)物的雙鏈核苷酸序列進(jìn)行消化，去除5' 端磷酸化標(biāo)記的那條ssDNA ; 6) 采用ssDNA純化回收試劑盒對(duì)消化后產(chǎn)物進(jìn)行回收，獲得長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)中的短 探針。
[0030] 7)對(duì)獲得的短探針在通過(guò)紫外分光光度計(jì)對(duì)合成的短探針的質(zhì)量進(jìn)行確定。
[0031] 4.用上述得到的ACE基因的長(zhǎng)度依賴(lài)談針對(duì)跟哺乳動(dòng)物核基因組DNA進(jìn)行雜交 反應(yīng)，連接后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。
[0032] 實(shí)施步驟1長(zhǎng)探針擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)合成。
[0033] 設(shè)計(jì)一對(duì)與待測(cè)靶片段及長(zhǎng)探針核苷酸序列無(wú)關(guān)的易于進(jìn)行PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增引 物，分別為GSR-Ν'和TSR-N'，TSR-N'的5'端進(jìn)行磷酸化修飾，用于長(zhǎng)探針的PCR擴(kuò)增檢 測(cè)。
[0034] 選擇質(zhì)粒pET_28a (購(gòu)自Novagen公司）中一部分序列為與待檢測(cè)祀片段無(wú)關(guān)的 模板序列（NS)，并根據(jù)ACE基因的長(zhǎng)探針序列和NS序列設(shè)計(jì)并人工合成長(zhǎng)探針制備專(zhuān)用的 通用引物GSR-Ν'（由GSR和NS序列的5'端的18bp反向互補(bǔ)序列組成）和制備ACE基因 長(zhǎng)探針用的下游引物TSR-N'（由TSR和NS序列3'端的23bp的反向互補(bǔ)序列組成)。
[0035] 上述引物的具體核苷酸序列為： GSR:5'_ CACACAGGAAACAGCTATGAC -3' 21bp TSR :5'-ACCTGCTGCCTATACAGTCACTTTT-3' 25bp GSR-Ν' ：5' _ GCGGTCCCAAAGGGTCAGTTCTAGAGCTAGGAGATGC~3, 47 bp (下劃線部分為 GSR 的反向互補(bǔ)序列，剩余部分為NS序列5'端的18bp的反向互補(bǔ)序列） TSR-N，：5' _ TGGACGACGGATATGTCAGTGAAAAGACGAAGGATTACGTCCTCAGCG-3' 48bp 5' 端 磷酸化修飾（下劃線部分為T(mén)SR序列的反向互補(bǔ)序列，剩余部分為NS序列3'端的23bp的 反向互補(bǔ)序列） 最終PCR擴(kuò)增得到的長(zhǎng)探針片段具體序列為： CACACAGGAAACAGCTATGAC (GSR 序列） AGATCTCGAT CCTCTACGCC GGACGCATCG TGGCCGGCAT CACCGGCGCC ACAGGTGCGG TTGCTGGCGC CTATATCGCC GACATCACCG ATGGGGAAGA TCGGGCTCGC CACTTCGGGC TCATGAGCGC TTGTTTCGGC GTGGGTATGG TGGCAGGCCC CGTGGCCGGG GGACTGTTGG GCGCCATCTC CTTGCATGCA CCATTCCTTG CGGCGGCGGT GCTCAACGGC CTCAACCTAC TACTGGGCTG CTTCCTAATG CAGGAGTCGC (NS 序列） ACCTGCTGCCTATACAGTCACTTTT (TSR 序列） 實(shí)施步驟2長(zhǎng)探針的PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物的純化回收 以質(zhì)粒pET-28a為模板，用引物GSR-Ν'和TSR-Ν'進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0036] 1)PCR反應(yīng)體系：

【權(quán)利要求】
1. 用于多重連接擴(kuò)增技術(shù)的長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)制備方法，包括長(zhǎng)探針的制備和短探針的 制備。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多重連接擴(kuò)增技術(shù)的長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)制備方法，其特 征在于，所述的長(zhǎng)探針的制備方法包括以下步驟： 1) 設(shè)計(jì)一對(duì)與待測(cè)靶片段及長(zhǎng)探針中的天然序列無(wú)關(guān)的通用引物，GSF和GSR，用于 最后的PCR擴(kuò)增檢測(cè)； 2) 確定一段與長(zhǎng)探針及通用引物無(wú)關(guān)的天然序列NS，并用于設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)探針的 引物，分別為GRS-N'和GSF-N'，其中GSR-Ν'是由GSR的序列與NS序列3'端的18bp左右 的序列組成，TSR-N'由目的長(zhǎng)探針5'端序列的反向互補(bǔ)序列與NS序列5'端的18bp左 右反向互補(bǔ)的序列組成，并且TSR-N'的5'端要帶上磷酸化修飾； 3) 用GRS-N'和GSF-Ν'以所述的一段與探針及通用引物無(wú)關(guān)的核酸序列為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，獲得互補(bǔ)鏈5'端磷酸化修飾的雙鏈核苷酸序列； 4) 純化回收PCR產(chǎn)物； 5) 采用T7核酸外切酶對(duì)以上dsDNA序列進(jìn)行消化，去除5'磷酸化標(biāo)記的那條ssDNA ; 6) 根據(jù)檢測(cè)設(shè)備的需要，對(duì)長(zhǎng)探針的3'端進(jìn)行報(bào)告基團(tuán)的修飾； 7) 采用ssDNA純化回收試劑盒對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行回收，便得到長(zhǎng)探針。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于多重連接擴(kuò)增技術(shù)的長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)長(zhǎng)探針的制備方 法，其特征在于，步驟2)所述的天然序列NS，天然序列可以選用任何與目標(biāo)基因片段和通 用引物無(wú)關(guān)序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于多重連接擴(kuò)增技術(shù)的長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)長(zhǎng)探針的制備方 法，其特征在于，步驟6)所述的報(bào)告基團(tuán)的修飾，報(bào)告基團(tuán)可以使用FAM、HAX、Cys5、Cys3。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于多重連接擴(kuò)增技術(shù)的探針制備方法，其特征在于，步驟 3)所述PCR擴(kuò)增得到的5'端磷酸化修飾的雙鏈核苷酸序列需先經(jīng)過(guò)純化再進(jìn)行T7外切 酶消化。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于多重連接擴(kuò)增技術(shù)的探針制備方法，其特征在于，步驟 5)所述的T7外切酶消化過(guò)程中，lugdsDNA用1個(gè)單位T7外切酶消化。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多重連接擴(kuò)增技術(shù)的長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)制備方法，其特 征在于，所述的短探針的制備方法包括以下步驟： 1) 針對(duì)短探針的涉及一對(duì)擴(kuò)增引物，分別為GSF-Ν'和TSF-N'，其中GSF-Ν'是由GSF 的序列5'端的18bp左右的序列組成，TSF-N'由TSF序列3'端的反向互補(bǔ)序列中的18bp 左右反向互補(bǔ)的序列組成，并且其5'端要帶上磷酸化修飾； 2) 用GSF-Ν'和TSF-Ν'以所述的長(zhǎng)探針的核酸序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得互補(bǔ)鏈 5'端磷酸化修飾的雙鏈核苷酸序列； 3) 純化回收PCR產(chǎn)物； 4) 采用T7核酸外切酶對(duì)以上純化后的PCR產(chǎn)物的雙鏈核苷酸序列進(jìn)行消化，去除5' 端磷酸化標(biāo)記的那條ssDNA ; 5) 采用ssDNA純化回收試劑盒對(duì)消化后產(chǎn)物進(jìn)行回收，獲得長(zhǎng)度依賴(lài)探針對(duì)中的短 探針。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于多重連接擴(kuò)增技術(shù)的探針制備方法，其特征在于，步驟 3)所述PCR擴(kuò)增得到的5'端磷酸化修飾的雙鏈核苷酸序列需先經(jīng)過(guò)純化再進(jìn)行T7外切 酶消化。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于多重連接擴(kuò)增技術(shù)的探針制備方法，其特征在于，步驟 5)所述的Τ7外切酶消化過(guò)程中，lugdsDNA用1個(gè)單位Τ7外切酶消化。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104099424SQ201410363255
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】何駿奇, 毛丹丹, 王校, 卞雪蓮 申請(qǐng)人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司